ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的研制

目的 通过研究冷酚与粗糖的混合比例、粗糖提纯时的质量浓度和乳糖保护剂的用量来制备符合规定的ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗.方法 发酵细菌,提取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖粗制品,以不同的纯化工艺纯化A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖.将4种纯化的多糖原液按一定比例混合,加入乳糖作为保护剂,冷冻干燥制成ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗.结果 通过比较不同纯化工艺制备的多糖,确定最佳提纯条件为多糖与冷酚的体积比为1∶1,粗糖提纯时的质量浓度为6 g/L.检测按此纯化条件制备的ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗显示,3批疫苗的水分含量分别为1.7％、2.0％和2.1％,疫苗的A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖含量和回收率分别都≥50 μg/剂和80％,符合相关规定的要求.结论 按确定的工艺成功制备ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗.     

A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量测定方法的建立

目的  建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌（meningococcus,Men）多糖疫苗（groups A,C,Y,W135 menignococcal polysaccharide vaccine,MPV4）多糖含量的火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis,RIE)法。方法  分别用A、C、Y、W135群Men菌液、A、C、Y、W135群Men菌液加佐剂、A、C、Y、W135群Men多糖-牛白蛋白结合物免疫家兔,制备特异性抗血清。将制备的抗血清以一定的比例加入琼脂糖凝胶制成平板,并将纯化的多糖作为定量参考品加入抗原孔进行RIE。以多糖含量和对应的RIE峰高作标准曲线并建立直线回归方程。采用优化的RIE法测定MPV4多糖含量和分子大小。结果  菌液加佐剂制备的抗血清效价较理想。在确定的电泳条件下,建立的RIE法制备的标准曲线呈现良好的线性关系,相关系数值均大于0.98。该法特异性较好,未检出各多糖间的交叉反应。采用该法测定3批MPV4多糖含量、分子大小及回收率的结果均与先前的检定结果相符,均符合质控标准。结论  建立的RIE法可作为MPV4多糖抗原含量的测定方法。     

火箭免疫电泳在W135群脑膜炎球菌发酵工艺优化中的应用

目的  应用火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis，RIEP）检测W135群脑膜炎球菌（group W135 meningococcus，MenW135）发酵液的多糖含量，来指导MenW135发酵工艺的改进。方法  制备家兔MenW135抗血清，并确定RIEP琼脂糖凝胶中的抗血清浓度。分别以不同发酵条件培养MenW135，并分别在培养2、3、4、5、6 h时取样，用分光光度法检测菌液的吸光度（A），用RIEP检测菌液的多糖含量。结果  检测MenW135多糖的RIEP琼脂糖凝胶中的抗血清浓度确定为0.1%。在MenW135发酵2~5 h期间，MenW135多糖含量与其A值呈正相关性。然而，在MenW135发酵5~6 h期间，菌液的A值不增加，但菌液的多糖含量仍在升高。结论  相对于通过菌液的A值来观察菌液的多糖含量，RIEP检测能直接获得菌液的多糖含量，从而更好地指导MenW135多糖疫苗发酵工艺的优化。     

苯酚提取法对A群脑膜炎球菌多糖中细菌内毒素含量的影响

目的  研究苯酚提取法对A 群脑膜炎球菌多糖料液中细菌内毒素含量的影响。方法  用苯酚对A 群脑膜炎球菌多糖料液进行提取，比较粗制多糖不同溶解倍数、苯酚提取过程中采用不同搅拌转数、提取次数、提取温度等因素对多糖细菌内毒素含量的影响。  结果  粗制多糖采用4.5%醋酸钠溶液1∶100（质量体积比）溶解后进行苯酚提取的多糖细菌内毒素含量最低。同时，综合考虑多糖料液中蛋白含量、多糖回收率的检定结果，确定用苯酚进行提取的最佳条件为搅拌转数为400 转/min，提取次数为3次，温度为13～15 ℃，可有效降低多糖料液中细菌内毒素的含量。  结论  苯酚提取法可明显降低A 群脑膜炎球菌粗制多糖料液中的细菌内毒素含量。     

A群和C群脑膜炎球菌荚膜多糖提制工艺研究

研究一种不使用苯酚的荚膜多糖提制工艺,用于疫苗制备。采用液体罐培养A群和C群脑膜炎球菌,杀菌后离心取上清液,用十六烷基三甲基溴化铵沉淀多糖,用氯化钙溶液解离后,加乙醇至25%去除核酸等杂质,经乙醇沉淀获得粗多糖。将粗多糖溶解后,加乙醇至一定浓度沉淀蛋白,离心获得上清液,经超滤浓缩和乙醇沉淀,获得纯化多糖。纯化的多糖生化检测结果符合WHO和《中国药典》(2010年版)规定,豚鼠和小鼠异常毒性检查合格,豚鼠过敏试验未见过敏反应,1H NMR检测显示多糖结构具有一致性。该研究建立的A群和C群脑膜炎球菌荚膜多糖提制工艺为应用于疫苗制备奠定了基础。     

B群脑膜炎球菌疫苗研究进展

由B群脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis serogroup B,MenB)引起的流行性脑脊髓膜炎是全球重要的公共卫生问题之一.由于MenB荚膜多糖与人体组织具有相似性,以及MenB外膜蛋白抗原具有多样性和复杂性,因此目前尚无有效的MenB疫苗.荚膜多糖修饰疫苗可能是一种解决办法;应用反向疫苗学等方法确认MenB的各种保守抗原是重要的疫苗研究途径;将多种无交叉反应的抗原混合制成疫苗同样是未来的研究方向之一.此文就MenB疫苗的研究进展作一综述.     

C群脑膜炎球菌结合疫苗的制备及其免疫原性

 目的  制备由不同分子大小C群脑膜炎球菌多糖（group C meningococcal polysaccharide,CPS）与破伤风类毒素（tetanus toxoid,TT）共价偶联而成的结合疫苗（CPS-TT）,并检测其在小鼠中的免疫原性。 方法   将CPS降解成不同大小的片段,经碳二亚胺（carbodiimide,EDAC）或溴化氰（cyanogen bromide,CNBr）活化后偶联到TT上制成CPS-TT。NIH小鼠皮下注射制备的不同CPS-TT,用ELISA法测定小鼠血清抗CPS和TT IgG抗体。 结果   EDAC活化的降解CPS的衍化率（3.9%～5.7% ）和多糖回收率（11.4%～21.3%）均高于CNBr活化的降解CPS的衍化率（0.4%～1.2%）和回收率（2.4%～11.5%）。EDAC或CNBr活化的降解CPS制备的CPS-TT在小鼠中均具有较强的免疫原性,但EDAC活化的降解CPS制备的CPS-TT免疫小鼠的抗CPS抗体滴度高于CNBr活化的降解CPS制备的CPS-TT免疫小鼠。结论  EDAC活化的降解CPS可用于制备C群脑膜炎球菌结合疫苗。     

B群脑膜炎球菌疫苗研究进展

由B群脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis serogroup B,MenB)引起的流行性脑脊髓膜炎是全球重要的公共卫生问题之一.由于MenB荚膜多糖与人体组织具有相似性,以及MenB外膜蛋白抗原具有多样性和复杂性,因此目前尚无有效的MenB疫苗.荚膜多糖修饰疫苗可能是一种解决办法;应用反向疫苗学等方法确认MenB的各种保守抗原是重要的疫苗研究途径;将多种无交叉反应的抗原混合制成疫苗同样是未来的研究方向之一.此文就MenB疫苗的研究进展作一综述.     

B群脑膜炎球菌疫苗研究进展

由B群脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis serogroup B,MenB)引起的流行性脑脊髓膜炎是全球重要的公共卫生问题之一.由于MenB荚膜多糖与人体组织具有相似性,以及MenB外膜蛋白抗原具有多样性和复杂性,因此目前尚无有效的MenB疫苗.荚膜多糖修饰疫苗可能是一种解决办法;应用反向疫苗学等方法确认MenB的各种保守抗原是重要的疫苗研究途径;将多种无交叉反应的抗原混合制成疫苗同样是未来的研究方向之一.此文就MenB疫苗的研究进展作一综述.     

脑膜炎球菌疫苗研究进展

1969年,美国Gotschlish等采用十六烷基三甲基溴化铵提取脑膜炎球菌的大分子多糖抗原,成功制备荚膜多糖疫苗,证明免疫效果良好.然而,多糖疫苗对婴幼儿的免疫原性较弱,因而人们研制了单价和多价多糖一蛋白结合疫苗,目前部分结合疫苗已进入临床或上市.鉴于B群脑膜炎球菌多糖的免疫原性极弱,人们开发了外膜蛋白疫苗.研究表明,部分外膜蛋白疫苗对婴儿及儿童有较好的免疫原性及安全性.此外,通过基因工程技术研制DNA疫苗也不失为预防脑膜炎球菌感染的一种免疫策略.     

高效阴离子交换色谱-脉冲安培法对A群脑膜炎球菌结合疫苗中游离多糖的检测

目的 采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培法（high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection,HPAEC-PAD）检测A群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗（group A meningococcal polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine,MenA-PS-TT）中的游离多糖含量.方法 采用1％脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate,DOC）处理MenA-PS-TT分离游离PS.游离和结合PS经三氟乙酸水解后,用HPAEC-PAD检测水解产物,并将检测结果与改良钼酸铵分光光度法的检测结果进行比较.结果 1％DOC处理的样品的PS回收率为90％～104％,TT沉淀率为99％以上,说明1％DOC处理不会对游离和结合PS产生影响.HPAEC-PAD检测MenA-PS的重复性良好,3次MenA-PS标准品定位结果和3次MenA-PS-TT成品检测结果的相对标准偏差分别为1.7％和6.4％.HPAEC-PAD与改良钼酸铵分光光度法的检测结果相当.结论 HPAEC-PAD可用于MenA-PS-TT中的游离PS含量检测.     

广东省C群流脑菌株PCR鉴定分析

目的 用PCR技术鉴定分析广东省2003-2011年从流脑患者、密切接触者及健康带菌者分离的C群流脑菌株.方法 对菌株进行常规鉴定、乳胶凝集,再用PCR方法进行鉴定.结果 36株脑膜炎奈瑟菌常规鉴定、乳胶凝集为C群,PCR鉴定crgA基因(230 bp)、siaD(C)基因( 250 bp)均为阳性.结论 基于siaD(C)基因的PCR技术可应用于C群脑膜炎奈瑟菌的鉴定分群.     

AC群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备

目的  制备以B群脑膜炎球菌外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）为载体的AC群脑膜炎球菌多糖（polysaccharide,PS）结合疫苗（AC-OMP）,并初步研究该制备工艺的稳定性。方法  将以溴化氰活化的A、C群PS分别与B群OMP偶联制成AC-OMP。按《中华人民共和国药典》2010年版三部的要求对制备的AC-OMP进行检定。以制备的AC-OMP免疫小鼠,用ELISA法检测小鼠血清抗体阳转率。结果  制备的AC-OMP的各项指标均达到质控标准。AC-OMP具有良好的免疫原性,AC-OMP免疫小鼠的血清抗PS抗体阳转率为100%。结论  该工艺适用于AC-OMP制备。     

火箭免疫电泳法定量检测4价脑膜炎球菌多糖疫苗中C群脑膜炎球菌多糖含量的方法学验证

目的 验证用火箭免疫电泳法(rocket immunoelectrophoresis,R1E)检测4价脑膜炎球菌多糖疫苗(tetravalent serogroup A／C／W135／Y meningDcoccal polysaccharide vaccine,MPV4)中C群多糖含量的可靠性。方法 以系列浓度的C群多糖溶液为标准,采用RlE对MPV4中C群多糖含量迸行重复测定。结果 最佳线性范围为30～86 mg／L,相关系数(r)均大于0.985;MPV4与C群多糖参比品的剂量反应曲线之间具有良好的平行性;在精密度试验中,试验内CV为6.08％～8.07％,试验间Cy为7.24％～9.19％;A、W135和Y群多糖及乳糖不引起非特异性免疫反应。结论 本法的线性、精密度和专属性均符合验证要求,可作为定量检测MPV4中C群多糖含量的方法。     

检测C群脑膜炎球菌结合疫苗中游离多糖含量的脱氧胆酸钠沉淀法的建立

 目的  建立检测C群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗（group C  meningococcal polysaccharide -tetanus toxoid conjugate vaccine, CPS-TT）中游离多糖的脱氧胆酸钠沉淀法。 方法  在不同pH条件下用脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate,DOC）对CPS和TT进行沉淀,确定可有效分离游离多糖和结合多糖的最适沉淀条件,并对该法进行验证。 结果  DOC沉淀法的最适pH为3.5,在此pH条件下用DOC沉淀法检测3批CPS-TT显示,上清TT含量平均为2.3%。DOC沉淀法具有较好的准确度和精密度,3批CPS-TT的批内变异系数均小于5%。 结论  DOC沉淀法可用于C群脑膜炎球菌结合疫苗的质量控制。