THBS2在肺腺癌组织中的表达及其对肺腺癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化的影响

目的:研究血小板反应蛋白2（thrombospondin 2,THBS2）在肺腺癌组织中的表达及其对肺腺癌细胞H1299和A549迁移能力、侵袭能力、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响,并探究分子机制。方法:运用TIMER和GEPIA数据库分析THBS2 mRNA在泛肿瘤和肺腺癌组织中的表达,利用UALCAN数据库分析THBS2 mRNA在I-IV期肺腺癌组织中的表达差异,通过HPA数据库检测THBS2蛋白在肺腺癌组织中的表达情况。通过免疫印迹实验（Western blot）检测THBS2在人正常支气管上皮细胞（BEAS-2B）和肺腺癌细胞（H1299、A549）中的表达情况。应用质粒转染技术在肺腺癌细胞H1299和A549中分别过表达和敲低THBS2。细胞划痕实验和侵袭实验（Transwell）检测细胞迁移和侵袭能力。Western blot验证THBS2过表达和敲低效率,同时检测EMT相关蛋白和MMP2的表达水平。结果:TIMER数据库与GEPIA数据库检索结果显示THBS2 mRNA在肺腺癌组织中高表达（P＜0.001）。UALCAN数据库分析证明,与正常肺组织相比,THBS2 mRNA在I-IV期肺腺癌组织中均显著表达（P＜0.001）。HPA数据库结果显示,THBS2蛋白在肺腺癌组织中呈现中高等强度表达。细胞划痕实验、Transwell实验和Western blot结果表明,THBS2在人正常支气管上皮细胞和肺腺癌细胞中的表达有显著差异（P＜0.01）;过表达THBS2可增加肺腺癌细胞H1299和A549迁移与侵袭能力（P＜0.01）,EMT相关蛋白E-cadherin表达水平减少,而N-cadherin和Vimentin表达水平增加（P＜0.01）;相反的,敲低THBS2可抑制肺腺癌细胞H1299和A549迁移与侵袭能力（P＜0.01）,EMT相关蛋白E-cadherin表达水平增加,而N-cadherin和Vimentin表达水平减少（P＜0.01）。结论:THBS2在肺腺癌组织中高表达;THBS2在肺腺癌细胞（H1299、A549）中的表达均显著高于人正常支气管上皮细胞（BEAS-2B）;THBS2在肺腺癌细胞H1299和A549中的过表达和敲低影响迁移、侵袭和EMT的过程,可作为肺腺癌治疗的新型潜在靶点。     

STAT3通过上调Twist基因表达从而诱导肺腺癌细胞上皮-间质转化

目的探讨信号转导子与转录激活子3（STAT3）基因在肺腺癌细胞上皮-间质转化（Epi．thelial-mesenchymal transition,EMT）过程中的作用。方法应用STAT3-siRNA转染人肺腺癌A549细胞,下调STAT3基因表达。转染后观察细胞形态学变化,通过Westernblot检测STAT3和Twist蛋白的表达变化。同时应用Transwell法和划痕实验检测细胞的侵袭和迁移能力。并应用免疫组化法验证STAT3和Twist蛋白在肺腺癌组织中表达的相关性。结果STAT3-siRNA转染人肺腺癌A549细胞后,STAT3基因表达下降,同时降低Twist的表达,并且降低肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,在肺腺癌组织中我们也观察到随着分化程度升高,两个蛋白在肺癌组织中的的表达均逐渐降低,并呈正相关。结论STAT3基因通过调节Twist的表达,参与EMT过程,从而在肺癌进展中发挥重要作用。     

HOXB7基因在肺腺癌中的表达及其临床意义

目的 检测同源盒基因B7（HOXB7）在肺腺癌中的表达情况,并探讨其临床意义。方法 分别应用逆转录PCR（RT PCR）和Western blotting法检测人正常肺支气管上皮细胞系HBE及4株肺腺癌细胞系A549、H1975、H1650、H322中HOXB7的表达情况。应用免疫组织化学染色及Western blotting法检测HOXB7在75例肺腺癌及配对癌旁正常组织中的表达,并分析其表达与肺腺癌临床病理特征及预后的关系。结果 4株肺腺癌细胞系中HOXB7 mRNA和蛋白的表达水平均显著高于正常肺支气管上皮细胞系（P＜0.05）。HOXB7蛋白在肺腺癌及对应癌旁正常组织中的高表达率分别为76.0％（57/75）和9.3％（7/75）,差异有统计学意义（P＜0.05）。HOXB7蛋白在肺腺癌组织中的表达水平与临床分期、病理分级及淋巴结转移有关（P＜0.05）,而与性别、年龄无关（P＞0.05）。HOXB7低表达者的中位生存期为68个月,高于高表达者的51个月,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论HOXB7在肺腺癌中高表达,且与肿瘤的侵袭转移和疾病进展相关,有可能作为肺腺癌早期诊断及评估预后的新靶标。     

STC1诱导上皮-间质转化促进肺癌细胞的侵袭和迁移

背景与目的：斯钙素1（stanniocalcin 1,STC1）与癌症的发展和不良预后相关,但STC1对肺癌细胞转移的影响及其作用机制目前还未完全阐明。探讨STC1对肺癌细胞侵袭和迁移的影响及其可能的内在分子机制。方法：构建STC1过表达的细胞系HLEC-STC1及对照细胞系HLEC-EV,STC1沉默的细胞系A549-STC1 siRNA及对照细胞系A549-EV;采用Transwell和划痕实验检测细胞的侵袭和迁移能力;采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）标志物的mRNA和蛋白质水平变化;并使用细胞免疫荧光技术进一步验证细胞EMT标志物的表达和定位;采用Western blot检测EMT相关信号通路蛋白和转录因子的水平。结果：与对照细胞相比,过表达STC1的HLEC-STC1细胞的侵袭和迁移能力增强,STC1沉默的A549-STC1 siRNA细胞的侵袭和迁移能力减弱（P＜0.05）;过表达STC1的HLEC-STC1细胞中上皮标志物上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）的表达下调,间质标志物神经型钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）及肿瘤干细胞标志物上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule,EpCAM）表达上调（P＜0.05）;低表达STC1的A549-STC1 siRNA细胞中E-cadherin的表达上调,N-cadherin、vimentin及EpCAM的表达下调（P＜0.05）;同时,HLEC-STC1细胞中细胞外调节蛋白激酶信号通路（extracellular signal-regulated protein kinase,ERK）及Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路激活相关的磷酸化（p）-ERK和β-catenin的水平升高,转录因子E盒结合锌指蛋白1（zinc finger E-box-binding homeobox 1,ZEB1）和锌指转录因子1（Snail1）的表达水平上调,A549-STC1 siRNA细胞中的结果则相反（P＜0.05）。结论：STC1可能通过激活ERK和Wnt/β-catenin信号通路上调转录因子ZEB1和Snail1的表达水平,从而诱导EMT促进肺癌细胞的侵袭和迁移。     

JNK/MAPK在LPS诱导乳腺癌细胞MCF-7上皮间质转化过程中的作用

目的：探讨JNK/MAPK在LPS诱导乳腺癌细胞上皮间质转化（ EMT）过程中的作用。方法：将乳腺癌细胞 MCF-7分为3组：正常对照组、LPS（10μg/ml）处理组、LPS﹢SP-600125诱导实验组。应用real-time RT-PCR与Western blot法检测上皮细胞表面标志E-钙黏蛋白（ E-cadherin）和间质细胞表面标志N     

姜黄素逆转电离辐射诱导的非小细胞肺癌A549细胞上皮间质转化

目的 探讨姜黄素对电离辐射诱导的非小细胞肺癌A549细胞上皮间质转化的影响。方法 用电离辐射诱导A549细胞发生上皮间质转化,将其命名为A549R。CCK8法检测细胞增殖;Western blot检测姜黄素对A549R上皮/间质标志物表达的影响;划痕实验及Transwell实验检测姜黄素对A549R细胞迁移能力的影响。结果 A549R细胞经姜黄素处理后,细胞形态由纺锤形转变为椭圆形上皮形态;E-cadherin表达下调,pan-Keratin表达上调,Vimentin、Twist表达显著下调,N-cadherin表达水平无明显变化;划痕愈合面积随姜黄素浓度的升高而显著下降;A549R细胞迁移能力随姜黄素浓度的升高而显著下降。结论 姜黄素通过下调E-cadherin、Vimentin、Twist的表达,并上调Keratin的表达,从而逆转电离辐射诱导A549细胞发生上皮间质转化。     

尼古丁诱导肺癌细胞上皮间质转化促进其侵袭转移

背景与目的我们的前期研究发现尼古丁能诱导肺癌细胞上皮间质转化。本研究的目的是探讨尼古丁诱导的上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）与肺癌侵袭之间的关系。方法应用不同浓度尼古丁处理肺腺癌A549细胞,应用Real-time PCR和Western blot方法检测EMT相关分子标志物E-钙粘蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）mRNA和蛋白表达水平,应用免疫荧光技术检测β-链蛋白（β-catenin）蛋白表达位置的变化,应用划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测尼古丁对肺癌细胞迁移侵袭能力的影响。结果尼古丁明显下调肺癌细胞株A549 E-cadherin mRNA和蛋白水平表达（P<0.01, P<0.01）,并具有浓度和时间依赖性;尼古丁明显上调肺癌细胞株A549 Vimentin mRNA和蛋白水平表达（P<0.01, P<0.01）;尼古丁诱导肺癌细胞株A549细胞β-catenin蛋白发生核转移;划痕实验和侵袭实验观察到尼古丁处理的肺癌细胞株A549细胞的迁移和侵袭能力明显增强（P<0.01, P<0.01）。结论尼古丁能够诱导肺癌细胞发生EMT,并且促进肺癌细胞株A549细胞的体外侵袭潜能。     

miR-142-5p通过影响上皮间质转化抑制肺腺癌H1650细胞的侵袭与迁移

目的：探讨肺腺癌组织中miR-142-5p的表达及其对H1650细胞增殖、侵袭、迁移及上皮间质转化（epithelieal-mesenchymal transition,EMT）的影响及其作用机制。方法：收集2014年1月至2015年1月在河北医科大学第四医院胸外科行肿瘤切 除并经病理证实的107例肺腺癌患者的癌组织及其癌旁组织标本,以及人肺腺癌细胞系H1650、HCC827、 A549、 H1975、PC9和人 支气管上皮细胞BEAS-2B, 用qPCR实验检测肺腺癌组织及细胞中miR-142-5p的表达水平及其与患者临床特征的关系。分别用 miR-142-5p模拟物（mimics）、miR-阴性对照质粒（miR-NC）转染H1650细胞后, 用CCK8、细胞划痕愈合和Transwell侵袭实验分 别检测H1650细胞的增殖、侵袭和迁移能力。使用生物信息学工具预测miR-142-5p的靶基因,通过双荧光素酶报告基因实验验 证miR-142-5p对靶基因的调控作用,Western blotting检测细胞周期蛋白依赖性激酶5（cyclin-dependent kinase 5,CDK5）及EMT 相关蛋白的表达水平。结果：肺腺癌组织及细胞系中miR-142-5p表达水平显著低于癌旁组织及BEAS-2B细胞（均P<0.01）;107 例肺腺癌组织中, 61例（57.01%）低表达miR-142-5p,其表达水平与患者的TNM分期、淋巴结转移密切相关（均P<0.01）。转染 miR-142-5p模拟物后, H1650细胞中miR-142-5p高表达,细胞的增殖、侵袭和迁移能力显著降低（均P<0.05或P<0.01）。生物信息 学工具预测CDK5是miR-142-5p的靶基因,经双荧光素酶报告基因验证,miR-142-5p可显著降低H1650细胞中CDK5的表达水 平,显著提高E-cadherin表达,降低N-cadherin和Snail的表达水平（均P<0.01）。结论：miR-142-5p在肺腺癌组织和细胞中呈低表 达状态,其通过下调CDK5表达影响EMT抑制H1650细胞的侵袭与迁移能力。     

沉默PD-L1基因表达抑制胃癌细胞黏附、迁移、侵袭及上皮间质转化

目的:初步探讨程序性死亡受体配体（programmed death-ligand 1,PD-L1）对胃癌细胞SGC7901侵袭、迁移的影响及PD-L1表达对上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响。方法:采用siRNA干扰技术,下调SGC7901细胞株中PD-L1的表达,采用RT-PCR法及Western blot法验证PD-L1的沉默,并将后续实验分为空白对照组、空载体组（siRNA-NC组）及PD-L1沉默组（siRNA-PD-L1组）。采用RT-PCR法及Western blot法分别对各组细胞EMT相关指标（E-cadherin、Vimentin、Snail）的mRNA和蛋白表达情况进行检测。利用MTT实验比较各组细胞的黏附能力,Transwell小室实验比较各组细胞的迁移能力及侵袭能力。结果:下调PD-L1表达后,siRNA-PD-L1组Vimentin及Snail 两项指标的mRNA和蛋白表达量,细胞的黏附能力、迁移能力及侵袭能力均低于空白对照组和siRNA-NC组,E-cadherin mRNA和蛋白表达量高于其他两组,差异均具有统计学意义（P＜0.001）,而空白对照组和siRNA-NC组之间上述指标的差异无统计学意义。结论:PD-L1的表达影响胃癌细胞黏附、迁移、侵袭等生物学行为,促进胃癌细胞的上皮间质转化,与胃癌的预后可能存在相关性。     

FBXW7调控非小细胞肺癌上皮间质转化的作用机制

目的:研究FBXW7在非小细胞肺癌上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)过程中发挥的作用。方法:收集100对非小细胞肺癌组织和对应的癌旁组织,利用免疫组化检测FBXW7在癌组织和癌旁组织中的表达。利用Western blot检测FBXW7在细胞系中的表达及FBXW7对EMT部分标志蛋白的影响。利用Transwell实验检测FBXW7对NSCLC细胞迁移能力的影响。免疫共沉淀实验和泛素化的Western blot验证FBXW7与Snail1的关系。结果:FBXW7在NSCLC组织中的表达明显低于对应癌旁组织中的表达。FBXW7在正常肺上皮细胞中的表达也明显高于4种非小细胞肺癌细胞系中的表达。FBXW7过表达显著抑制A549细胞的迁移能力。FBXW7过表达也明显抑制NSCLC细胞的EMT。机制研究发现,FBXW7可以直接结合并泛素化降解Snail1蛋白,并且Snail1部分逆转FBXW7对NSCLC细胞EMT标志蛋白的影响。结论:FBXW7对NSCLC细胞EMT的调控部分依赖于泛素化降解Snail1蛋白。     

HOXB7 promotes invasion and predicts survival in pancreatic adenocarcinoma

BACKGROUND:

The homeobox gene HOXB7 is overexpressed across a range of cancers and promotes tumorigenesis through varying effects on proliferation, survival, invasion, and angiogenesis. Although published microarray data suggest HOXB7 is overexpressed in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), its function in pancreatic cancer has not been studied.

METHODS:

HOXB7 message and protein levels were examined in PDAC cell lines and patient samples, as well as in normal pancreas. HOXB7 protein expression in patient tumors was determined by immunohistochemistry and correlated with clinicopathologic factors and survival. The impact of HOXB7 on cell proliferation, growth, and invasion was assessed by knockdown and overexpression in PDAC cell lines. Candidate genes whose expression levels were altered following HOXB7 knockdown were determined by microarray analysis.

RESULTS:

HOXB7 message and protein levels were significantly elevated in PDAC cell lines and patient tumor samples relative to normal pancreas. Evaluation of a tissue microarray of 145 resected PDACs found high HOXB7 protein expression was correlated with lymph node metastasis (P = .034) and an independent predictor of worse overall survival in multivariate analysis (hazard ratio = 1.56, 95% confidence interval = 1.02‐2.39). HOXB7 knockdown or overexpression in PDAC cell lines resulted in decreased or increased invasion, respectively, without influencing proliferation or cell viability.

CONCLUSIONS:

HOXB7 is frequently overexpressed in PDAC, specifically promotes invasive phenotype, and is associated with lymph node metastasis and worse survival outcome. HOXB7 and its downstream targets may represent novel clinical biomarkers or targets of therapy for inhibiting the invasive and metastatic capacity of PDAC. Cancer 2013. © 2012 American Cancer Society.     

siRNA沉默 B7-H4 表达对人肺腺癌A549细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的:探讨靶向B7-H4基因的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对人肺腺癌细胞A549增殖、侵袭和迁移的影响。方法:体外化学合成B7-H4特异性siRNA(B7-H4-siRNA),转染A549细胞,MTT法、流式细胞术、Western blotting分别检测A549细胞的增殖、细胞周期,以及B7-H4和Cyclin D1蛋白的水平;Transwell实验检测A549细胞体外侵袭和迁移能力。结果:B7-H4-siRNA成功转染入A549细胞,Western blotting结果显示,B7-H4-siRNA转染抑制A549细胞中B7-H4和Cy-clin D1蛋白的表达。B7-H4-siRNA转染后A549细胞增殖活性明显下降,B7-H4-siRNA组A549细胞的倍增时间明显长于未转染组、Ctrl-siRNA组和转染试剂对照组[(33.78±0.26)h vs(28.69±0.18)、(27.32±0.13)、(26.93±0.19)h,P<0.05]。B7-H4-siRNA转染使A549细胞阻滞在G1期。B7-H4-siRNA组A549细胞的侵袭细胞数明显少于未转染组[(89.80±0.99)个vs(186.20±1.33)个,P<0.05]。B7-H4-siRNA组A549细胞的迁移细胞数明显少于未转染组、Ctrl-siRNA组和转染试剂对照组[(60.20±0.37)个vs(102.57±0.52)、(100.72±0.31)、(98.65±0.21)个,P<0.05〗。结论:B7-H4-siRNA能沉默A549细胞中B7-H4的表达,抑制A549细胞的增殖、侵袭和迁移,B7-H4可能成为肺癌基因治疗的候选靶点。     

AKR7A3在肺腺癌中异常表达及临床意义

目的:探讨醛-酮还原酶家族7成员A3（AKR7A3）在肺腺癌中的异常表达及与临床病理特征的关系，并探究其临床意义。方法:采用生物信息学数据库分析、免疫组化、Western Blot、Real-time PCR等方法对肺腺癌组织及不同细胞中AKR7A3的表达进行检测与分析。结果:Oncomine数据库分析结果显示，在肺腺癌中，AKR7A3的表达普遍高于正常肺组织，分别为正常肺组织的1.811倍（P=0.022）、1.356倍（P<0.01）、1.413倍（P=0.002）。Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示，AKR7A3高表达的患者较低表达的患者生存时间缩短，差异具有统计学意义（P=0.003 7）。免疫组化染色显示肺腺癌组织中AKR7A3的表达较癌旁增高，在与临床病理特征的相关性分析中，发现其与肿瘤分化程度（P<0.01）、淋巴结转移情况（P=0.029）以及TNM分期（P<0.01）相关，且会造成患者生存时间缩短（P=0.031）。Cox多因素分析表明AKR7A3可能是影响肺腺癌患者预后的独立危险因素(P=0.012)。Western Blot及Real-time PCR实验提示不同肺腺癌细胞中AKR7A3蛋白及mRNA表达普遍增高。结论:AKR7A3在肺腺癌中表达增高，对预后有不良影响，有促进肿瘤发生发展的作用。     

沉默S100P基因抑制肺腺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭

目的:探讨肺癌组织及细胞中S100P基因表达对增殖、迁移、侵袭的影响及其作用机制。方法:在GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)数据库和HPA数据库（Human Protein Atlas）得到肺癌数据,分析S100P 基因在不同分型肺癌组织与正常组织中差异表达。使用shRNA -S100P RNA下调肺癌细胞系中S100P基因表达水平;细胞的增殖活性使用MTS比色法检测;细胞周期变化运用流式细胞仪检测;细胞划痕实验和Transwell实验分别检测细胞迁移能力和侵袭能力。RT-qPCR与Western blot分别验证S100P表达及细胞周期、凋亡蛋白表达水平。结果:S100P基因在肺癌组织中表达水平明显高于正常组织(P＜0.01);不同分型的肺癌组织中S100P基因表达存在差异。与对照组相比,下调S100P使A549增殖、迁移和侵袭能力均降低。结论:S100P基因在肺癌中高表达且下调后可抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力。     

Radioresistant human lung adenocarcinoma cells that survived multiple fractions of ionizing radiation are sensitive to HSP90 inhibition

Despite the common usage of radiotherapy for the treatment of NSCLC, outcomes for these cancers when treated with ionizing radiation (IR) are still unsatisfactory. A better understanding of the mechanisms underlying resistance to IR is needed to design approaches to eliminate the radioresistant cells and prevent tumor recurrence and metastases. Using multiple fractions of IR we generated radioresistant cells from T2821 and T2851 human lung adenocarcinoma cells. The radioresistant phenotypes present in T2821/R and T2851/R cells include multiple changes in DNA repair genes and proteins expression, upregulation of EMT markers, alterations of cell cycle distribution, upregulation of PI3K/AKT signaling and elevated production of growth factors, cytokines, important for lung cancer progression, such as IL-6, PDGFB and SDF-1 (CXCL12). In addition to being radioresistant these cells were also found to be resistant to cisplatin.HSP90 is a molecular chaperone involved in stabilization and function of multiple client proteins implicated in NSCLC cell survival and radioresistance. We examined the effect of ganetespib, a novel HSP90 inhibitor, on T2821/R and T2851/R cell survival, migration and radioresistance. Our data indicates that ganetespib has cytotoxic activity against parental T2821 and T2851 cells and radioresistant T2821/R and T2851/R lung tumor cells. Ganetespib does not affect proliferation of normal human lung fibroblasts. Combining IR with ganetespib completely abrogates clonogenic survival of radioresistant cells.Our data show that HSP90 inhibition can potentiate the effect of radiotherapy and eliminate radioresistant and cisplatin -resistant residual cells, thus it may aid in reducing NSCLC tumor recurrence after fractionated radiotherapy.     

下调转录因子HOXB7抑制胰腺癌BXPC3细胞侵袭及迁移机制研究

目的:研究在胰腺癌细胞株BXPC3中转染shRNA干扰转录因子HOXB7的表达后,BXPC3细胞侵袭及迁移能力的变化。方法:Real-time PCR及Western blot印迹方法分别检测HOXB7基因mRNA及蛋白在正常人胰腺导管上皮细胞HPDE、胰腺癌细胞株BXPC3中的表达;在胰腺癌细胞株BXPC3细胞中转染HOXB7 shRNA及阴性对照shRNA,mRNA及蛋白水平检测转录因子HOXB7的干扰效果;Transwell侵袭实验检测各组细胞的侵袭能力;划痕实验检测各组细胞迁移能力的变化。结果:Real-time PCR及Western blot结果显示HOXB7基因mRNA及蛋白在BXPC3细胞株中表达明显高于正常人胰腺导管上皮细胞HPDE（P＜0.05）。在BXPC3细胞中转染HOXB7 shRNA后HOXB7的mRNA及蛋白表达水平均明显受到抑制;Transwell侵袭实验及划痕实验显示细胞侵袭能力及迁移能力均显著降低。结论:胰腺癌细胞株BXPC3中干扰转录因子HOXB7表达后,细胞侵袭及迁移能力明显降低。