一种简便的大鼠肝脏星状细胞分离培养方法及鉴定

目的 探索简单经济的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)分离培养方法,提高实验效率.方法 取SD大鼠,行肝脏门静脉插管,用链酶蛋白酶、Ⅳ型胶原酶灌注,消化.细胞悬液经Percoll密度梯度离心液分离,台盼蓝染色鉴定细胞活性,Desmin抗体免疫组化鉴定纯度.结果 HSCs得率为(2.35...     

肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭的疗效观察

目的观察肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭的疗效, 探讨原代肝细胞提取方法, 观察体外培养的大鼠肝细胞生存情况。方法 利用胶原酶消化法分离大鼠肝细胞, 用D-氨基半乳糖(D-GalactosamineN, D-GalN)制作大鼠急性肝功能衰竭模型, 并以此模型为基础行大鼠同种异体肝细胞移植实验。结果 分离的肝脏实质细胞(Hepatocyte)的存活率在87%-95%。平均每只大鼠肝脏可分离出7.8×10⁷个肝脏实质细胞。肝细胞移植组大鼠7天的存活率为54.2%(13/24), 对照组8.3%(2/24), 移植组大鼠存活率与非移植组大鼠存活率之间具有显著性差异(P＜0.005)。结论 经腹腔移植同种异体肝细胞可明显改善D-GalN诱导的急性肝衰竭大鼠的存活率, 腹腔肝细胞移植是治疗急性肝衰竭安全有效的方法。     

大鼠肝细胞分离和原代肝细胞培养

用胶原酶连续灌注大鼠肝脏而获得形态典型、分离率高的肝细胞。用灌注法分离出来的肝细胞成活率高达90％,ATP含量在正常生理范围(8～10n mol/mg干重细胞),肝细胞具有葡萄糖异化作用的酶系能利用丙酮酸、乳酸为底物合成葡萄糖。在MEM培养剂中培养的肝细胞属均匀的单层上皮型细胞,在2～3天内保持原有形态,为非分裂     

大鼠睾丸支持细胞的分离、鉴定与培养

背景与目的:分离培养高纯度的大鼠睾丸支持细胞.材料与方法:选用SD雄性大鼠(18～21 d),处死取出睾丸,采用0.25%胰蛋白酶、0.05%胶原酶二步酶消化法结合低速离心分离支持细胞,置于35℃,5%CO2的培养箱培养,48 h后用20 mmol/LTris-HC1低渗处理培养细胞.0.25%胰蛋白酶消化后二次贴壁培养,用油红0染色和透射电镜观察对所培养的支持细胞进行鉴定,并用MTT法绘制细胞生长曲线.结果:分离培养的支持细胞纯度达95%,体外培养的对数生长期为4～9 d. 结论:采用二步酶消化法与低速离心及低渗处理法分离培养的支持细胞纯度高,用油红0染色鉴定支持细胞是一种简便快速的方法.     

原代小鼠肝细胞培养方法的比较

目的: 比较3种不同培养条件下原代小鼠肝细胞的形态以及肝细胞功能,寻找适合于原代小鼠肝细胞体外培养的培养基配方。方法: 采用改良Seglen两步胶原酶灌注法分离原代小鼠肝细胞,糖原染色观察细胞纯度,在贴壁4 h后用基础培养基、基础培养基加DMSO(DMSO组)、基础培养基加DMSO和EGF(DMSO+EGF组)等3种不同的条件培养肝细胞。镜下观察肝细胞形态,用MTT法检测细胞活力,生化分析仪检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平以及用ELISA法检测细胞培养上清液中白蛋白水平。结果: 成功分离小鼠原代肝细胞,肝细胞纯度达95%以上;原代肝细胞培养至96 h时,DMSO组仍能较好地维持细胞形态,基础培养基组的细胞活力比DMSO组和DMSO+EGF组分别降低了66.87%和67.16%(P<0.05),且基础培养基组的LDH水平均高于DMSO组和DMSO+EGF组(P<0.05)。此外DMSO组在96 h时仍能维持较高水平的白蛋白分泌,比基础培养基组和DMSO+EGF组分别增加了185%和24.2% (P<0.05)。结论: 小鼠原代肝细胞培养基中加入DMSO对于维持肝细胞的形态和功能有促进作用,本研究为体外原代肝细胞培养模型的建立和优化提供了实用的方法。     

入肝门静脉动脉化对肝部分切除大鼠肝细胞能量代谢的影响

目的 在大鼠肝部分切除基础上建立入肝门静脉动脉化加门腔分流术的动物模型,研究大鼠术后早期肝脏细胞能量代谢的变化.方法 90只Sprague-Dawley大鼠分为3组:肝切除组+门静脉动脉化组、单纯肝切除组及单纯门静脉动脉化组,每组30只.观察术前及术后5 min吲哚靛青绿15 min储留率(indocyanine green retention rate at 15 rain,ICGR15)、术后5 min及2 h动脉血酮体比率(arterial blood ketone body ratio,AKBR)及肝组织能荷(energy charge,EC)的变化情况.结果 肝部分切除或单纯门静脉动脉化手术均导致术后大鼠ICGR15明显升高(P<0.01),单纯门静脉动脉化大鼠肝脏吲哚靛青绿15 min储留率显著低于肝部分切除大鼠(P<0.01).肝切除附加门静脉动脉化后,大鼠术后ICGR15明显低于单纯肝部分切除组(P<0.01).肝部分切除或单纯行门静脉动脉化手术均导致术后大鼠AKBR及EC明显降低(P<0.01),单纯门静脉动脉化组大鼠术后2 h开始出现回升,而肝部分切除大鼠仍持续下降.肝部分切除附加门静脉动脉化组AKBR及EC术后均明显高于单纯肝部分切除组(P<0.01).结论 肝部分切除或门静脉阻断的手术操作均明显降低肝脏细胞能量代谢水平,入肝门静脉动脉化能有效促进肝部分切除术后大鼠残肝细胞能量代谢水平的恢复.     

正常肝脏CT灌注成像与肝脏储备功能对照研究

目的通过对正常肝脏CT灌注成像与肝脏储备功能对照研究,确定准确的正常肝脏CT灌注值。方法选择无任何肝脏疾病的志愿者20例,采用Philips16排螺旋CT机,选择肝门层面为中心,包括肝门静脉、腹主动脉和脾脏在内进行CT灌注扫描,通过设备附带软件分别计算肝脏的灌注值;利用吲哚氰绿实验进行肝脏储备功能检测。结果20例平均肝脏CT灌注值肝动脉灌注量（HAP）=0.18±0.08 ml/min.ml,门静脉灌注量（HPP）=0.98±0.33 ml/min.ml,总肝灌注量（TLP）=1.1±0.12 ml/min.ml,肝动脉灌注指数（HAI）=19.2%,门静脉灌注指数（PVI）=80.8%;平均15 min吲哚氰绿潴留率（ICGR15）=1.8%。结论肝脏CT灌注成像能反映肝脏的血流动力学变化,可作为影像学评估肝脏储备功能的重要指标。     

双途径介入化疗与单纯肝动脉栓塞化疗治疗晚期肝癌的临床观察

目的研究肝动脉化疗栓塞基础上经皮经肝门静脉灌注化疗治疗晚期肝癌的疗效.方法对49例不能手术切除的晚期原发性肝癌随机分组,行单纯肝动脉化疗栓塞治疗与在肝动脉化疗栓塞基础上加用经肝门静脉灌注化疗,对比分析.结果肝动脉化疗栓塞基础上经肝门静脉灌注化疗治疗晚期肝癌患者的半年、一年、二年、三年生存率分别为100%、76.5%、35.29%、23.53%,AFP及全身转移的发生率明显降低,与对照组有显著差异.结论肝动脉化疗栓塞基础上经肝门静脉灌注化疗治疗晚期肝癌疗效优于单纯性经肝动脉化疗栓塞.     

经不同途径区域灌注氟尿嘧啶在肝癌、肝组织及血浆中的浓度差异

背景与目的:肝动脉、肝门静脉灌注区域化疗是肝癌的重要治疗手段,本研究探讨区域性灌注化疗时氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)在大鼠肝癌和肝脏组织及血浆中的分布,为临床肝脏肿瘤化疗提供参考。方法:将24只荷瘤大鼠随机分为4组,分别经外周静脉(尾静脉)、肝动脉、肝门静脉或结扎肝动脉后经肝门静脉灌注5-FU,剂量为20 mg/kg。采用高效液相色谱法测定肝癌、肝脏组织及血浆中5-FU的含量,并计算药物在血浆、肝脏和肝癌组织间的穿透比率。结果:结扎肝动脉的肝门静脉组5-FU浓度在肝脏和肝癌组织中最高,分别为(22.1±9.5)μg/g和(16.4±7.2)μg/g;其次为肝动脉组;肝门静脉组5-FU浓度在肝癌组织中的浓度较低,为(8.9±3.7)μg/g;外周静脉组5-FU浓度在肝脏和肝癌组织中的药物浓度均为最低,肝癌组织中的浓度仅为(4.3±2.2)μg/g。在血浆中的5-FU浓度正好相反,外周静脉组浓度最高(26.8±12.5)μg/m L,肝动脉组(16.4±9.7)μg/m L、结扎肝动脉的肝门静脉组(15.9±10.1)μg/m L和肝门静脉组(14.9±8.5)μg/m L等3组浓度相近,均明显低于外周静脉组(P<0.05)。5-FU的肝癌/血浆穿透比率依次为结扎肝动脉的肝门静脉组(103.47%),肝动脉组(92.94%),肝门静脉组(59.58%)和外周静脉组(16.08%)。结论:与外周静脉注射全身化疗比较,区域性灌注化疗可显著提高肝癌和肝脏组织中的药物浓度,同时减少化疗药物在外周血中的分布,其中经结扎肝动脉的肝门静脉灌注和经肝动脉灌注是肝癌区域性化疗2种较好的途径。     

骨巨细胞瘤中单核基质细胞的分离培养及其性质研究

目的对骨巨细胞瘤中单核基质细胞的性质和来源进行探讨。方法体外分离培养8例骨巨细胞瘤的单核基质细胞，用胶原酶分离方法和差速贴壁法分离纯化细胞，将分离培养的骨巨细胞瘤单核基质细胞与狗股骨薄磨片共培养，观察骨巨细胞瘤单核基质细胞的噬骨能力、TRAP染色和RT—PCR检测降钙素受体（CTR）和细胞核因子KB受体活化因子（RANK）。结果利用酶消化的方法可以获得较高纯度的单核基质细胞；TRAP染色阳性；体外培养具有噬骨能力；采用RT—PCR方法可检测到降钙素受体和细胞核因子KB受体活化因子。结论利用胶原酶-Ⅱ消化的方法结合差速贴壁方法可以获得较纯的单核基质细胞，可用于生化和分子生物学研究，是进行骨巨细胞瘤细胞学研究的细胞来源。     

Cell culture and its application primary culture of human hepatocytes and its application]

Difficulty in obtaining human liver specimens has made a delay in the development of methodology for isolation and primary culture of human hepatocytes compared to animal hepatocyte cultures. Recently the collagenase-liver-perfusion technique, which was developed for rat hepatocyte isolation, has been applied to prepare isolated human hepatocytes. This method greatly improved the yield and viability of hepatocytes of human liver tissues. Since then, the isolated human hepatocytes and their primary culture have been widely used for studies of hepatic metabolism, regeneration, transplantation, hepatitis B virus infection, hepatotoxins, detection of human carcinogens, hepatocarcinogenesis and so forth. These current studies were reviewed.     

沉默Nanog联合SNX-2112对人食管癌干细胞样细胞的抑制作用

目的:通过沉默Nanog探讨其对Hsp90抑制剂SNX-2112诱导食管癌干细胞样细胞的裸鼠移植瘤抑制效果。方法:CCK-8分析细胞受到药物作用活性，Ki-67检测细胞增殖情况，Western blotting检测凋亡蛋白Bcl2、Bax、Bcl-xL表达情况。建立BALB/c裸鼠移植瘤模型，裸鼠分为四组，包括DMSO组、shNanog组、SNX-2112组、shNanog与SNX-2112联合用药组，每组3只。隔天给药，总共给药7次，脱颈处死小鼠，测量小鼠体重，瘤组织经HE染色，免疫组化分析Caspase3的表达情况与Hsp90客户蛋白pErk表达情况。结果:联合用药组细胞活性显著受到抑制（P<0.05），Ki-67实验显示联合用药组细胞增殖受到抑制（P<0.05），Bcl2与Bcl-xL蛋白表达下调（P<0.05），Bax表达水平上调（P<0.05）。联合用药组小鼠瘤重明显低于SNX-2112组以及shNanog组（P<0.05），HE染色结果显示沉默Nanog与SNX-2112联合用药显著性诱导肿瘤细胞凋亡，免疫组化研究显示Caspase3在两者联合用药组表达水平较高（P<0.05），Hsp90客户蛋白pErk表达有下调的趋势（P<0.05）。结论:沉默Nanog有助于提高SNX-2112诱导食管癌干细胞样细胞的裸鼠移植瘤细胞凋亡作用。     

免疫磁珠阴性富集法在恶性胸腔积液细胞块制作中的应用

目的:探讨应用免疫磁珠阴性富集法制作恶性胸腔积液细胞块的可行性及其应用价值。方法:收集确诊为肺腺癌的胸腔积液57例，每例标本平均分成两份，分别用传统直接离心沉淀法（A法）和免疫磁珠阴性富集法(B法)制作细胞块，对两种方法获得的细胞块的HE染色、免疫组化效果及提取DNA的合格率、EGFR基因突变检测结果进行比较。结果:免疫磁珠阴性富集法的HE、免疫组化效果均优于传统的直接离心沉淀法；直接离心沉淀法提取的DNA浓度普遍高于免疫磁珠阴性富集法；直接离心沉淀法和免疫磁珠阴性富集法提取DNA的合格率分别为96.61%（57/59）和98.31%（58/59），两者差异无统计学意义（P>0.05）；免疫磁珠阴性富集法EGFR基因突变阳性率为59.32%（35/59），高于直接离心沉淀法的54.24%（32/59），两者差异无统计学意义（P>0.05）。结论:应用免疫磁珠阴性富集法制作恶性胸腔积液细胞块的方法可行，在HE染色、免疫组化以及后续的分子病理检测与传统的直接离心沉淀法相比较均显示出较大的优势。     

Peroxisome proliferators do not increase DNA synthesis in purified rat hepatocytes

There have been numerous reports that chemicals which induce peroxisomes in rodent liver increase DNA synthesis in isolated hepatic parenchymal cells, but not as well in vitro as in vivo. It is also known that tumour necrosis factor alpha (TNFalpha) is mitogenic in isolated hepatocytes. Since Kupffer cells are a major source of TNFalpha in the liver and have recently been shown to be activated by peroxisome proliferators, the possibility exists that the effect of peroxisome proliferators on DNA synthesis in parenchymal cells is via Kupffer cell contamination of isolated hepatocyte preparations. The purpose of this study was to evaluate this hypothesis by studying the effect of model peroxisome proliferators on purified hepatocyte preparations. Hepatocytes were prepared from rat liver by standard calcium-free and collagenase perfusion. Subsequently, cells were centrifuged through Percoll to remove contaminating non-parenchymal cells. Cells were at least 99.9% pure as assessed by cell counting using specific markers for hepatocytes (resorufin O-glucoside) and Kupffer cells (FITC-labelled latex beads). Hepatocytes were cultured in Williams medium + 10% fetal bovine serum for 24 h followed by culture for 48 h in Williams medium plus or minus drug or mitogen additions. Under these conditions epidermal growth factor stimulated DNA synthesis assessed by incorporation of [3H]thymidine approximately 5-fold over control levels. The peroxisome proliferators WY,14-643 and nafenopin, however, had no effect on DNA synthesis, although they did increase acyl-CoA oxidase as expected. In contrast, TNFalpha increased cell proliferation nearly 10-fold in purified hepatocytes, an effect nearly doubled by WY-14,643. Further, when conditioned medium from purified Kupffer cells incubated with WY-14,643 was added to pure hepatocytes, DNA synthesis was increased over 2-fold in a time-dependent manner. Collectively, these data support the hypothesis that peroxisome proliferators do not influence DNA synthesis in isolated hepatocytes per se. Rather, they stimulate cytokine production by Kupffer cells which in turn increases DNA synthesis in parenchymal cells. An increase in mitogenic cytokine production by Kupffer cells is necessary for stimulation of DNA synthesis in purified rat parenchymal cells.     

miR-520b靶向DAD1调控肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制

目的:探讨miR-520b和抗细胞凋亡因子（DAD1）对肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制。方法:qRT-PCR和Western blot实验检测A498人肾癌细胞中miR-520b和DAD1表达。将miR-520b mimics或DAD1 siRNA转染至A498细胞，MTT和Transwell实验检测细胞活力、迁移和侵袭。Targetscan在线预测、双荧光素酶报告基因和Western blot实验验证miR-520b和DAD1的靶向关系。将miR-520b mimics和pcDNA-DAD1共转染至A498细胞，检测细胞活力、迁移和侵袭。结果:在A498细胞中，miR-520b表达下调而DAD1表达上调。在A498细胞中过表达miR-520b或敲减DAD1，细胞活力下降，迁移和侵袭细胞数减少。Targetscan在线预测、双荧光素酶报告基因和Western blot实验结果表明，miR-520b可负调控DAD1蛋白表达。过表达DAD1可逆转miR-520b对A498细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论:miR-520b能够通过靶向调节DAD1表达抑制A498细胞增殖、迁移和侵袭。     

A NEW METHOD OF ISOLATING KUPFFER CELLS FROM BIOPSY TISSUE OF RAT LIVER

The isolation of a high yield and purity of Kupffer cells has been reported in detail.1 This paper reports into the research about isolation Kupffer cells from biopsy tissue of liver. This method includes 5 important steps: (1) take fresh liver tissue, and mince with scissors. (2) spin at low speed to wash off red blood cells. (3) digest in collagenase for suitable time. (4) isolate Kupffer cells on a percoll density gradient. (5) cell charaterization was observed by N.S.E stain and peroxidatic activity with lumino-meter measurement and phagocytosis with latex beads.2.3     

靶向抑制ZNF281基因表达对直肠癌细胞生长抑制及化疗增敏作用的机 制探讨

目的:探讨抑制ZNF281基因表达对直肠癌细胞活力、凋亡率及5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗敏感性的影响。方法:以LipofectamineTM 2000（Lipo2000）为载体，将siRNA转染人直肠癌Colo320细胞，Colo320细胞分为NC组（阴性对照siRNA）、si-ZNF281组（靶向抑制ZNF281表达的小干扰RNA）和si-ZNF281+5-FU组，MTT检测细胞活力，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western blotting检测β-catenin、PCNA和Survivin的蛋白表达。结果:ZNF281 siRNA转染Colo320细胞后，ZNF281表达显著低于空白组（P<0.05）。与NC组比较，si-ZNF281组细胞活力降低，凋亡率升高，β-catenin、PCNA和Survivin的蛋白表达降低，差异均具有统计学意义（P<0.05）。与si-ZNF281组比较，si-ZNF281+5-FU组细胞活力降低，凋亡率升高，β-catenin、PCNA和Survivin的蛋白表达降低，差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:抑制ZNF281基因表达可降低直肠癌细胞活力及诱导细胞凋亡，且可增加5-FU化疗敏感性，机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

扁塑藤素抑制人胶质母细胞瘤U251细胞增殖的机制探讨

目的:探讨扁塑藤素对人胶质母细胞瘤U251细胞增殖的影响及其机制。方法:2、4和8 μmol/L的扁塑藤素作用U251细胞24 h后，使用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测U251细胞活力；Cell cycle staining Kit检测U251细胞周期；免疫印迹法检测增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白和p-PI3K、PI3K、p-AKT以及AKT蛋白表达。结果:2、4和8 μmol/L的扁塑藤素显著降低U251细胞的活力，且具有浓度依赖性。扁塑藤素可下调U251细胞PCNA蛋白的表达。扁塑藤素处理U251细胞后，G1期细胞数明显增加，S期细胞数明显减少。扁塑藤素处理可明显降低U251细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的比值。结论:扁塑藤素可能通过抑制PI3K/AKT信号通路的活化抑制人胶质母细胞瘤的细胞增殖。     

RNA干扰RhoBTB1表达促进结肠癌HT29细胞增殖、抑制其凋亡的相关研究

目的:探究RNA干扰RhoBTB1基因表达对结肠癌HT29细胞增殖、凋亡的影响。方法:采用Lipofectamine 2000将siRNA RhoBTB1或siRNA NC转入HT29细胞中，实验分为Control组、转染对照组和siRNA Rho组，噻唑蓝（MTT）和流式细胞术分别检测细胞的的活力和凋亡率，蛋白质印迹法（Western Blot）检测细胞中RhoBTB1、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达量。结果:与对照组相比，HT29细胞转染siRNA RhoBTB1后，细胞中RhoBTB1蛋白的表达量显著低于对照组（P<0.05），细胞活力显著升高（P<0.05），凋亡率显著降低（P<0.05），Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平明显降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平显著增加（P<0.05）。结论:RNA干扰RhoBTB1表达促进结肠癌HT29细胞增殖，抑制其凋亡，可能通过调节线粒体凋亡通路相关蛋白的表达量发挥作用。