国产与进口无血清培养基和重组胰蛋白酶规模化培养Vero细胞效果的比较

目的   比较国产物料与进口物料对Vero细胞的培养效果及消化效果,以判断国产物料VirusPro^® VP无血清培养基（serum-free medium,SFM）（干粉）和Trpzyme重组胰蛋白酶是否适用于规模化Vero细胞培养。  方法 选取国产物料VirusPro^® VP SFM（干粉）和Trpzyme作为实验组,选取进口物料粉剂VP SFM和TryPLe Select作为对照组,在T瓶、10层细胞工厂（10-layer cell factory,CF10）和CF40连续规模化生产中,对特定代次、特定传代规模分别进行独立样本t检验,比较总消化时长、细胞收获密度和细胞存活率。结果  各代次中,国产物料组与进口物料组的细胞生长状态均相似且良好。T瓶、CF10和CF40传代的独立样本t检验结果显示,虽然国产物料组的T瓶、CF10、CF40总消化时长（17.33、19.17、19.17 mm）均分别大于进口物料组（9.17、16.33、17.42 mm）,但仅T瓶总消化时长差异具有统计学意义（t=-5.58,P＜0.05）。两组间细胞收获密度及细胞存活率的差异均不具有统计学意义（P>0.05）,T瓶传代阶段的细胞收获密度（进口物料组：3.03×10⁶ ml^-1;国产物料组：3.11×10⁶ ml^-1）均高于CF10（进口物料组：1.22×10⁶ ml^-1 ;国产物料组：1.13 ×10⁶ ml^-1）和CF40（进口物料组：9.90×10⁵ ml^-1;国产物料组：8.73×10⁵ ml^-1）。结论 国产物料VirusPro^® VP SFM（干粉）、Trpzyme均符合规模化Vero细胞培养所需。     

不同培养基和胰蛋白酶对Vero细胞培养及消化效果的比较

目的 比较不同公司生产的无血清培养基对病毒性疫苗生产用Vero细胞培养效果,及基因工程胰蛋白酶的细胞消化效果,以判断是否适用。方法 实验组用VirusPro Vero-A培养基进行Vero细胞的培养,用Trpzyme消化细胞。对照组用VP-SFM培养基进行细胞培养,用TrypLE Select消化细胞。两组Vero细胞以相同密度接种在T175培养瓶中,以相同的培养条件和传代方法在T175瓶和细胞工厂中各培养3代。培养期间观察细胞的上清液、形态以及汇合度,消化后检测细胞活率并计算细胞收获量。采用配对t检验比较两组消化液的pH值、总消化时长、37 ℃消化孵育时长、细胞活率以及细胞收获量。结果 两组细胞生长状态均良好。配对t检验显示,实验组消化液的pH值（6.99）、总消化时长（17.28 min）和37 ℃消化孵育时长（6.93 min）均值均大于对照组消化液的（分别为6.75、12.34 min、3.30 min）,细胞活率（94.79%）及细胞收获量（T175瓶：3.91×10⁷个;细胞工厂：1.90×10⁹个）均值均高于对照组的（分别为90.20%、3.33×10⁷个、1.26×10⁹个）,且差异有统计学意义（t值分别为9.17、3.46、2.98、2.31和4.38,P值均<0.05）。结论 实验组无血清培养基培养效果较好,基因工程胰蛋白酶细胞消化液温和、细胞损伤小,均适用于Vero细胞。     

疫苗生产中使用的酸性和碱性苯酚对MRC-5细胞生长的影响

 目的   观察疫苗生产中使用的消毒剂酸性苯酚和碱性苯酚对MRC-5细胞生长的影响。 方法   将酸性苯酚（0.37%）和碱性苯酚（0.74%）分别加入MRC-5细胞培养瓶中,观察细胞生长形态,绘制细胞生长曲线,测定细胞贴壁率。分别采用t检验和x²检验对结果进行比较。 结果  加入酸性和碱性苯酚后,第7天的细胞数分别为6.65×10⁵和7.12×10⁵,与对照组（6.93×10⁵）相比,差异无统计学意义（t=0.476,P=0.654;t=0.334,P=0.752）;第8小时的细胞贴壁率分别为88.3%和96.0%,与对照组（90.3%）相比,差异亦无统计学意义（x²=0.765,P=0.659;x²=0.376,P=0.585）。 结论  微量酸性和碱性苯酚对MRC-5细胞的生长没有显著影响。     

重组痘苗病毒艾滋病疫苗细胞免疫评价方法的优化

目的  优化酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT）方法,提高其在重组天坛株痘苗病毒艾滋病疫苗细胞免疫评价中的灵敏度。方法  将疫苗或对照痘苗病毒皮内免疫BALB/c小鼠,50 μl/只,6周后无菌采集小鼠脾脏。用ELISPOT对分泌IFN-γ的脾淋巴细胞〔斑点形成细胞（spot-forming cell,SFC）〕进行检测。比较不同脾淋巴细胞密度（2×10⁵、1×10⁶、2×10⁶个/孔）和不同刺激肽质量浓度（2、4 μg/ml）对SFC的影响。分别采用单因素方差分析和t检验进行多组间和两组间数据比较。结果  3个细胞密度组（F=0.023,P>0.05）和2个刺激肽浓度组（t=-1.762~-0.110,P值均>0.05）间的SFC数差异均无统计学意义。当细胞密度为2×10⁵个/孔、刺激肽质量浓度为4 μg/ml时,疫苗组的SFC数达到（107.00±42.01）个/106细胞,高于原实验条件（细胞密度为1×10⁶个/孔、刺激肽质量浓度为2 μg/ml）的SFC数〔（76.55±64.45）个/10⁶细胞〕,但两者间的差异无统计学意义（t=1.252,P>0.05）。前者的SFC阳性率达到100%,而后者仅为50%。结论  通过优化ELISPOT方法中的细胞密度和刺激肽浓度,进一步提升了该法在重组痘苗病毒艾滋病疫苗细胞免疫评价中的灵敏度。     

细胞工厂培养原代地鼠肾细胞工艺的建立及优化

 目的  采用40层细胞工厂(40-layer cell factory, CF40)工艺培养原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞,优化乙脑减毒活疫苗的生产工艺。 方法  用不同浓度新生牛血清培养不同接种密度PHK细胞,比较各组PHK细胞数量,确定CF40工艺的PHK细胞接种密度和新生牛血清浓度。通过对比CF40和15 L转瓶采用不同新生牛血清的PHK细胞培养情况,比较两种工艺对新生牛血清的选择性。对4个厂家CF40培养的PHK细胞数量进行单因素方差分析,判定对CF40的选择性。结果  CF40工艺的最有条件为PHK细胞接种密度为6.1×10⁵ ml^-1、新生牛血清浓度6%。CF40工艺对新生牛血清的选择性较低,能比转瓶工艺更稳定地培养更多的PHK细胞。4个厂家CF40培养的PHK细胞数量之间的差异无统计学意义（F=0.23,P＞0.05）,对CF40选择性低。 结论  采用CF40可以制备出满足乙脑减毒活疫苗生产要求的PHK细胞。     

细胞工厂培养原代地鼠肾细胞工艺的建立及优化

 目的  采用40层细胞工厂(40-layer cell factory, CF40)工艺培养原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞,优化乙脑减毒活疫苗的生产工艺。 方法  用不同浓度新生牛血清培养不同接种密度PHK细胞,比较各组PHK细胞数量,确定CF40工艺的PHK细胞接种密度和新生牛血清浓度。通过对比CF40和15 L转瓶采用不同新生牛血清的PHK细胞培养情况,比较两种工艺对新生牛血清的选择性。对4个厂家CF40培养的PHK细胞数量进行单因素方差分析,判定对CF40的选择性。结果  CF40工艺的最有条件为PHK细胞接种密度为6.1×10⁵ ml^-1、新生牛血清浓度6%。CF40工艺对新生牛血清的选择性较低,能比转瓶工艺更稳定地培养更多的PHK细胞。4个厂家CF40培养的PHK细胞数量之间的差异无统计学意义（F=0.23,P＞0.05）,对CF40选择性低。 结论  采用CF40可以制备出满足乙脑减毒活疫苗生产要求的PHK细胞。     

大豆蛋白水解物促进MDCK细胞生长及流感病毒增殖的实验研究

目的  研究大豆蛋白水解物对Madin-Darby犬肾（Madin-Darby canine kidney,MDCK）细胞生长和流感病毒增殖的促进作用。方法  比较MDCK细胞在10%进口胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）-Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM）,10%国产新生牛血清（newborn calf serum,NCS）-DMEM和添加2、4、8 g/L大豆蛋白水解物SHEFF-VAX PLUS PF ACF（PF ACF）的10% 国产NCS -DMEM中的生长情况,以及甲型H7N9流感病毒接种细胞后的血凝素（hemagglutinin,HA）效价。结果  采用培养瓶静置培养时,5种培养体系中的细胞数在第3天达到最高,分别为（8.67±1.54）×106、（4.78±0.64）×106、（10.60±0.23）×106、（9.17±0.51）×106和（4.79±0.19）×106。采用搅拌瓶内微载体培养时,FBS-DMEM、NCS-DMEM和添加2、4 g/L PF ACF的NCS-DMEM中的细胞密度最高可达到（2.56±0.68）×106、（1.74±1.77）×106、（2.20±1.48）×106和（2.50±1.25）×106细胞/ml。流感病毒接种细胞后,FBS-DMEM、NCS-DMEM和添加4 g/L PF ACF的NCS-DMEM中测得的病毒HA效价分别为8.0、3.5和8.0 log2HAU/50 μl。结论  含国产NCS的培养基在添加4 g/L  PF ACF后,MDCK细胞密度和流感病毒产量与含进口FBS的培养基的培养结果相仿,因此,大豆蛋白水解物可作为培养基添加物应用于MDCK细胞培养和流感病毒增殖。     

乙型脑炎减毒活疫苗病毒滴定用BHK21细胞密度和代次的确认

 目的  确定乙型脑炎（乙脑）减毒活疫苗病毒滴定使用的BHK₂₁细胞的密度和代次范围。方法  抽取20批不同代次BHK21细胞在6孔细胞板内培养成单层,进行细胞计数,计算细胞密度,滴定同批次乙脑病毒滴度国家参考品。将BHK₂₁细胞从P95传代至P105,观察细胞形态及生长情况,与已用于检定的BHK21细胞（＜P95）对比。用P95~P105 BHK₂₁细胞重复6次滴定同批参考品,对滴度结果进行双因素方差分析,并与21细胞的病毒滴度检测结果进行趋势分析比较。结果  20批6孔板单层BHK21细胞密度均值1.55×10⁶  个/ml,差异较大（95%置信区间：7.89×10⁴～3.02×10⁶  个/ml）。病毒滴度结果均在规定范围内（6.48~7.12 lg蚀斑形成单位/ml,相对标准偏差<5%）,单层细胞密度对滴度结果无显著影响。P95~P105 BHK21细胞的生长情况及细胞形态与F=0.13,P=0.721 4）、不同细胞代次（F=1.17,P=0.337 6）及两者的交互作用（F=0.30,P=0.978 0）对检测结果的影响无统计学意义,试验结果与较低代次细胞（21细胞密度对滴度检测结果无显著影响。     

流感疫苗病毒株在MDCK细胞中的培养条件

 目的   研究4价流感疫苗所用病毒株在MDCK细胞中的扩增条件。方法 在6孔细胞培养板中以不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）（0.100 0、0.010 0、0.001 0、0.000 1）和对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）-胰蛋白酶（胰酶）浓度（0、2、4、8 μg/ml）进行病毒接种和扩增,感染后72 h收获细胞上清液,检测病毒血凝素效价,确定病毒最佳扩增条件。随后,在搅拌瓶中进行MDCK细胞微载体悬浮培养,研究不同起始细胞接种密度（1.5×10⁵、2.0×10⁵、3.0×10⁵ 个/ml）和微载体浓度（3、5、10 g/L）对MDCK细胞生长的影响,确定细胞最佳扩增条件。根据确定的最佳扩增条件,在搅拌瓶培养体系中扩增4种病毒。结果 6孔板中4种流感病毒的最佳接种条件分别是,A/Michigan/45/2015(H1N1) pdm09：MOI 0.010 0、TPCK-胰酶浓度2 μg/ml;A/Hongkong/4801/2014(H3N2)：MOI 0.010 0、TPCK-胰酶浓度4 μg/ml;B/Brisbane/60/2008：MOI 0.001 0、TPCK-胰酶浓度4 μg/ml;B/Phuket/3073/2013：MOI 0.010 0、TPCK-胰酶浓度4 μg/ml。在搅拌瓶中以3.0×10⁵ 个/ml初始细胞密度接种,3 g/L微载体浓度培养,MDCK细胞能够实现较好的扩增,最高密度可达2.1×10⁶ 个/ml;搅拌瓶悬浮培养,以最佳接种条件接种后,4种病毒的血凝素效价为：6.75~8.42log₂ 血凝素单位/50 μl。结论   通过摸索病毒接种最佳MOI、TPCK-胰酶浓度及优化MDCK细胞微载体悬浮培养条件,能够在MDCK细胞微载体悬浮培养体系中有效扩增4价流感疫苗用病毒株,为后期工艺放大研究奠定基础。     

皮内注射用卡介苗关键质量指标关联性分析

目的  对皮内注射用卡介苗（卡介苗）关键质量指标进行关联性分析,为生产工艺控制提供一定的依据。方法  用统计软件（Minitab 17和SPSSAU）对211批卡介苗的菌种代次、半成品沉降率、半成品活菌数、成品活菌数、成品效力和成品渗透压摩尔浓度等关键质量指标进行统计分析,探寻各指标间相互影响的规律。结果  第6、9和12代卡介菌生产的卡介苗成品活菌数均值分别为5.07×10⁶、5.49×10⁶和6.02×10⁶ 菌落形成单位（colony-forming unit,CFU）/mg,Pearson相关系数为0.200（P<0.05）,成品活菌数随卡介苗生产用菌种代次的升高而略有增加。半成品沉降率处于0.00%~7.99%、8.00%~12.00%和12.00%~20.00%的卡介苗成品活菌数均值分别为5.57×10⁶、5.52×10⁶和5.06×10⁶ CFU/mg,Pearson相关系数为-0.182（P<0.05）,成品活菌数随半成品沉降率提高而略有降低。半成品活菌数处于1.00×10⁷~1.99×10⁷、2.00×10⁷~2.99×10⁷和3.00×10⁷~4.00×10⁷ CFU/mg的卡介苗成品活菌数均值分别为4.61×10⁶、5.69×10⁶和6.53×10⁶ CFU/mg,Pearson相关系数为0.537（P<0.05）,成品活菌数随半成品活菌数增加而显著增加。成品活菌数处于1.00×10⁶~3.99×10⁶、4.00×10⁶~5.99×10⁶和6.00×10⁶~8.00×10⁶ CFU/mg的卡介苗成品效力均值分别为17.61、16.51和16.55 mm,Pearson相关系数为-0.187（P<0.05）,成品效力随成品活菌数增加而先略有降低再趋于平稳。成品活菌数处于1.00×10⁶~3.99×10⁶、4.00×10⁶~5.99×10⁶和6.00×10⁶~8.00×10⁶  CFU/mg的卡介苗成品渗透压摩尔浓度均值分别为363.61、363.21和368.68 mOsmol/kg,Pearson相关系数为0.210（P<0.05）,成品渗透压摩尔浓度随着成品活菌数增加而略有升高。结论  在企业标准范围内,成品活菌数受半成品活菌数的影响较大,受菌种代次、半成品沉降率的影响较小。成品活菌数对成品效力和成品渗透压摩尔浓度的影响较小。     

靶向CD19嵌合抗原受体T细胞体外构建、扩增及抗肿瘤活性研究

目的  探索特异性靶向CD19的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）T细胞的构建与制备方法,并研究其体外杀伤靶细胞的效果。方法  通过基因合成和分子克隆手段构建anti-CD19-CAR片段并将其插入plenti6.3慢病毒载体,利用293FT悬浮细胞系包装慢病毒并转染人外周血单个核细胞来源的CD3⁺ T细胞,通过流式细胞术鉴定转染效率,并通过实时无标记细胞分析法和细胞计数试剂盒8检测anti-CD19-CAR-T细胞体外杀伤效果。结果  获得了表达抗CD19的单链抗体基因的慢病毒,病毒滴度可达3.2×10⁸ 噬斑形成单位/ml。经慢病毒转染的CD3⁺ T细胞在体外培养14 d后,细胞扩增效率达(60.2±11.5)倍,anti-CD19-CAR-T细胞阳性率达90.57%。经检测,anti-CD19-CAR-T细胞均可有效杀伤CD19⁺靶细胞。结论  建立了基于无血清悬浮细胞系的anti-CD19-CAR慢病毒包装系统,成功构建靶向CD19抗原的CAR-T细胞,能特异性杀伤CD19+肿瘤细胞。     

Antiviral activity of enterocin CRL35 against herpesviruses

Enterocin CRL35 is an antibacterial polypeptide of 3.5×10³ Da produced by Enterococcus faecium CRL35. A series of experiments are described that show the enterocin also had antiviral activity against thymidine-kinase positive (tk⁺) and deficient (tk⁻) strains of herpes simplex (HSV) type 1 and 2 in Vero and BHK-21 cells. This activity was observed at 100 μg/ml, 15-fold lower than the cytotoxic concentration. In both cell lines there was a 2 log inhibition of infectivity. The compound inhibited viral multiplication in a dose-dependent manner and had no virucidal effect. Enterocin CRL35 also inhibited the virion-associated host shutoff in infected Vero cells showing that intracellular viral multiplication was affected.