K115对TGF-β1诱导的人Tenon 囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及其机制

目的　探讨K115对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人Tenon 囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及其机制。方法　人Tenon 囊成纤维细胞取自于河北省人民医院眼科行青光眼手术的患者。采用CCK-8实验检测K115对人Tenon 囊成纤维细胞增殖的影响,筛选出TGF-β1对细胞增殖最佳作用浓度为5.0 μg·L^-1,最佳作用时间为24 h;K115对细胞增殖起始作用浓度为5.0 μmol·L^-1,最佳作用浓度为10.0 μmol·L^-1。依据这两个浓度进行分组,分别是对照组（不加TGF-β1与K115）,TGF-β1组（加5.0 μg·L^-1 TGF-β1）,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组（加5.0 μg·L^-1TGF-β1和5.0 μmol·L^-1的K115）,TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组（加5.0 μg·L^-1 TGF-β1和10.0 μmol·L^-1 的K115）。采用Transwell 实验检测K115对人Tenon 囊成纤维细胞迁移的影响;免疫荧光法测定人Tenon 囊成纤维细胞中α-SMA蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况。对实验所得各指标进行统计学分析。结果　本研究细胞培养状态良好,6～8周可见人Tenon 囊成纤维细胞铺满培养瓶瓶底。用CCK-8 试剂盒检测各组细胞增殖情况结果显示,对照组、TGF-β1组、TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组、TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组光密度值分别为0.977±0.042、1.306±0.059、0.862±0.035、0.558±0.042,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组、TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组光密度值均小于TGF-β1组 (均为P<0.05),并且呈现浓度依赖性减小,K115浓度越大细胞增殖减少幅度越大。Transwell 实验结果显示,对照组、TGF-β1组、TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组、TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组迁移细胞数分别为（38.67±3.06）个、（81.00±4.00）个、（44.33±3.21）个、（23.67±2.52）个;TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组与TGF-β1组比较,迁移细胞数降低,差异有统计学意义（P<0.05）;TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组与对照组及TGF-β1组比较,迁移细胞数均明显降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。各组细胞内α-SMA蛋白免疫荧光染色结果显示,对照组人Tenon 囊成纤维细胞胞浆内可见散在分布的绿色荧光物质,TGF-β1处理后24 h（TGF-β1组）,胞浆内绿色丝状荧光物质明显增加,荧光强度差异有统计学意义（P<0.05）;与TGF-β1组比较,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组和 TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组细胞胞浆内的荧光强度呈浓度依赖性减弱,K115浓度越高荧光强度减弱越明显(均为P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,对照组细胞凋亡率为（2.400±0.346）%,TGF-β1组为（0.900±0.173）%,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组为（1.333±0.252）%,TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组为（1.067±0.058）%;TGF-β1组的细胞凋亡率较对照组降低（P<0.05）; TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组和TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组的细胞凋亡率均较对照组降低（均为P<0.05）,而与TGF-β1组比较,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　K115对TGF-β1诱导的人Tenon 囊成纤维细胞增殖和迁移有明确的抑制作用,其作用机制可能与K115抑制了TGF-β1诱导的细胞内α-SMA的表达进而调控了细胞活化有关。     

ALK5抑制剂对转化生长因子-β1（TGF-β1）致视网膜色素上皮细胞纤维化的干预作用

目的　探讨转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞向成纤维细胞转化的影响，及活化素受体样激酶5（activated receptor kinase 5，ALK5）抑制剂（SB-431542）对这一影响的干预作用。方法　体外培养人RPE细胞，随机分为对照组、TGF-β1处理组、TGF-β1+SB-431542处理组、SB-431542处理组。对照组不做任何处理，其余三组分别用10 μg·L^-1 TGF-β1、10 μg·L^-1 TGF-β1+30 μmol·L^-1 SB-431542、30 μmol·L^-1 SB-431542处理细胞24 h。MTT法检测各组RPE细胞增殖率；划痕实验观察各组处理后0 h、12 h、24 h RPE细胞迁移情况；免疫荧光法检测各组细胞ALK5蛋白的分布和表达；Western blot法检测各组ALK5、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ，ColⅠ）以及纤维粘连素（fibronectin，FN）蛋白的表达。结果　与对照组相比，TGF-β1作用于RPE细胞24 h后，可改变RPE细胞表型，使其呈成纤维细胞样外观，并明显促进RPE细胞增殖和迁移。10.0 g·L^-1 TGF-β1作用24 h后RPE细胞增殖率为对照组的（1.33±0.08）倍，30 μmol·L^-1 SB-431542作用24 h后RPE细胞增殖率为10.0 g·L^-1 TGF-β1处理组的（67.77±6.78）%。经TGF-β1作用24 h后RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白的表达显著上调，分别是对照组的（3.69±0.37）倍、（1.76±0.05）倍、（2.58±0.18）倍、（1.86±0.11）倍、（1.74±0.08）倍；SB-431542可逆转TGF-β1诱导的ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白表达上调，分别是TGF-β1处理组的（67.73±5.15）%、（71.71±3.50）%、（79.87±0.05）%、（63.59±3.16）%、（83.07±2.31）%，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　TGF-β1可促进RPE细胞增殖、迁移，向成纤维细胞转化，并能显著上调RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白的表达；SB-431542可通过抑制TGF-β1的作用而抑制RPE细胞的纤维化。     

不同浓度多西环素对碱烧伤大鼠角膜中转化生长因子β1和基质金属蛋白酶9表达的影响

目的　探讨不同浓度多西环素对碱烧伤大鼠角膜中转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）表达的影响及其调节作用。方法　SD大鼠右眼制备成角膜碱烧伤模型，随机分为对照组、0.5 g·L^-1多西环素组和1.0 g·L^-1多西环素组，每组15只。3组分别于造模后每天给予20 μL眼液溶媒、0.5 g·L^-1多西环素、1.0 g·L^-1多西环素滴眼至观察期末。于碱烧伤后第3天、第7天、第14天对角膜混浊程度进行评分，并行RT-PCR和ELISA检测角膜组织中TGF-β1、MMP-9 mRNA和蛋白的表达情况。结果　与对照组相比，碱烧伤后第7天、第14天，0.5 g·L^-1多西环素组［（2.80±0.45）分、（2.20±0.45）分］和1.0 g·L^-1多西环素组［（2.00±0.00）分、（0.60±0.55）分］角膜混浊程度评分降低，且1.0 g·L^-1多西环素组更低，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。碱烧伤后第3天、第7天、第14 天，0.5 g·L^-1多西环素组、1.0 g·L^-1多西环素组TGF-β1 mRNA及蛋白表达量均较对照组低，且1.0 g·L^-1多西环素组表达更低，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。碱烧伤后第3天、第7天，0.5 g·L^-1多西环素组、1.0 g·L^-1多西环素组MMP-9 mRNA及蛋白表达均较对照组低，且1.0 g·L^-1多西环素组表达更低，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　多西环素可下调碱烧伤大鼠角膜中TGF-β1和MMP-9的表达，促进角膜愈合，并呈一定程度的剂量依赖性。     

丹参酮ⅡA对人角膜基质细胞纤维化的抑制作用

目的　研究丹参酮ⅡA （tanshinoneⅡA,TSN） 对转化生长因子β1 （transforming growth factor-β1,TGF-β1） 诱导的人角膜基质细胞 （human keratocyte,HK） 纤维化的作用,探索该药物是否具有防治角膜瘢痕的潜能。方法　采用胰蛋白酶消化培养HK,并传代至4-7代用于实验。通过TGF-β1诱导建立HK纤维化模型,并分别用5.0 μg·L^-1 TGF-β1和不同浓度的TSN联合给药方法对HK进行处理。采用Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）与Vimentin的表达,qPCR检测纤连蛋白 （fibronectin,FN） 和I型胶原（collgen I,COL I） mRNA的表达;利用细胞免疫荧光染色观察HK细胞形态的改变。结果　5.0 μg·L^-1 TGF-β1可以显著上调α-SMA与Vimentin蛋白的表达和胞外基质成分FN mRNA（2.238±0.227）、COL I mRNA（3.554±0.526）的表达。2.5 μmol·L^-1和5.0 μmol·L^-1 TSN均能抑制α-SMA蛋白的表达和FN mRNA（0.619±0.017、0.263±0.006）、COL I mRNA（0.631±0.011、0.275±0.081）的表达。5.0 μg·L^-1 TGF-β1诱导组HK形态呈长梭形,具有两极,细胞呈极性分布;5.0 μmol·L^-1 TSN联合5.0 μg·L^-1 TGF-β1培养HK形态同原始细胞形态,细胞呈三角形或星形。结论　TSN可抑制TGF-β1诱导的HK纤维化,具有抗角膜瘢痕的潜力。     

骨形态发生蛋白-6对转化生长因子-β2所致视网膜色素上皮细胞迁移的影响

目的　探讨骨形态发生蛋白-6（BMP-6）对转化生长因子-β2(TGF-β2)所致视网膜色素上皮（RPE）细胞迁移的影响。方法　RPE细胞常规培养后,用5 μg·L^-1 TGF-β2处理48 h,Western blot检测细胞中BMP-6蛋白水平的变化,Transwell法检测细胞迁移能力变化。随后,筛选BMP-6 siRNA抑制率最高的片段用于后续实验,构建BMP-6过表达质粒并进行鉴定后用于后续实验,RPE细胞随机分组,即（1）对照组:加入正常培养基培养48 h;（2）TGF-β2组:培养基中加入5 μg·L^-1 TGF-β2培养48 h;（3）BMP-6 siRNA组:转染BMP-6-homo-1087后培养48 h;（4）BMP-6过表达组:转染BMP-6过表达质粒后培养48 h;(5)TGF-β2+BMP-6过表达组:转染BMP-6过表达质粒24 h后,加入5 μg·L^-1TGF-β2继续培养48 h。Transwell法检测细胞迁移数的变化,倒置显微镜观察细胞形态的变化。结果　TGF-β2组迁移细胞数为（122.00±5.57）个,与对照组［（63.67±4.04）个］相比差异有统计学意义（P=0.000）。TGF-β2组BMP-6蛋白表达水平为0.41±0.13,与对照组（0.70±0.08）相比差异具有统计学意义（P=0.031）。BMP-6 siRNA组迁移细胞数为（115.67±1.53）个,与对照组［（57.00±7.00）个］相比差异具有统计学意义（P=0.000）。BMP-6过表达组迁移细胞数为(44.33±5.51)个,与对照组［（60.00±6.25）个］相比差异无统计学意义（P=0.076）。TGF-β2 +BMP-6过表达组迁移细胞数为(90.33±3.51)个,与TGF-β2组［(112.00±9.64)个］相比差异具有统计学意义（P=0.016）。结论　BMP-6可以阻止TGF-β2所致的RPE细胞的迁移,为增生性玻璃体视网膜病变的防治提供新的视角。     

地塞米松对脂多糖诱导人视网膜色素上皮细胞炎症损伤及NLRP3/Caspase-1通路的影响

目的　探究地塞米松（Dex）对脂多糖（LPS）诱导人视网膜色素上皮（HRPE）细胞炎症损伤及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）通路的影响。方法　体外培养ARPE-19细胞株,MMT法检测不同浓度Dex处理细胞24 h、48 h、74 h对LPS诱导ARPE-19细胞存活率的影响,确定Dex最佳处理浓度和时间。ARPE细胞随机分为:正常对照组（NC组）、LPS组（5 mg·L^-1 LPS）、Dex组（0.20 mol·L^-1 Dex）、Dex+LPS组（0.20 mol·L^-1 Dex+5 mg·L^-1 LPS）,RT-qPCR检测各组细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达量,ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达水平,Western blot检测NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平。结果　同一时间点,与NC组比较,LPS组ARPE-19细胞存活率均显著降低（均为P<0.05）,且随着Dex浓度增加,细胞存活率呈先升高后下降的趋势;0.20 mol·L^-1 Dex作用LPS诱导的ARPE-19细胞24 h时细胞存活率为(90.77±5.73)%,接近NC组,因此选用0.20 mol·L^-1Dex作用24 h用于后续实验。NC组与Dex组间TNF-α、IL-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达量差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。与NC组、Dex组比较,LPS组、Dex+LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6、 NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均显著升高,且Dex+LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6 、NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均显著低于LPS组（均为P<0.05）。结论　Dex可能通过抑制NLRP3/Caspase-1通路减轻LPS诱导的HRPE炎症损伤。     

PPAR-γ受体激动剂罗格列酮对兔准分子激光角膜切削术后角膜上皮下雾状混浊的影响

目的　探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）激动剂罗格列酮对兔准分子激光角膜切削术（photorefractive keratectomy，PRK）术后角膜上皮下雾状混浊（haze）的影响。方法　选取普通级新西兰大白兔64只（64眼），随机分为28 μmol·L^-1罗格列酮组、14 μmol·L^-1罗格列酮组、1 g·L^-1二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）+生理盐水组、单纯PRK组，每组16只（16眼）。均行右眼PRK手术，术后分别给予28 μmol·L^-1罗格列酮、14 μmol·L^-1罗格列酮、1 g·L^-1DMSO+生理盐水滴眼，单纯PRK组未作任何特殊处理。术后各组用裂隙灯观察并比较角膜上皮愈合情况；分别于PRK术后7 d、28 d比较各组haze情况并行眼前节照相；每组分别于PRK术后7 d、28 d分批处死8只兔，取角膜行免疫组织化学法比较各组转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）的表达。结果　PRK术后角膜上皮愈合时间组间差异无统计学意义（P＞0.05）；PRK术后7 d、28 d，各组haze分级及TGF-β1、α-SMA、MMP-2的表达情况，组间差异均有统计学意义（均为P＜0.05），其中28 μmol·L^-1罗格列酮组haze最轻，14 μmol·L^-1罗格列酮组其次，明显轻于1 g·L^-1 DMSO+生理盐水组及单纯PRK组，除1 g·L^-1DMSO+生理盐水组及单纯PRK组组间差异均无统计学意义（均为P＞0.05）外，其余组间两两比较差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　PPAR-γ受体激动剂罗格列酮对兔PRK术后haze有抑制作用，呈浓度依赖性，可能由TGF-β1/Smad通路介导。     

氧化损伤对视网膜色素上皮细胞三联组氨酸核苷结合蛋白1（HINT1）表达的影响

目的　探讨过氧化氢（hydrogen peroxide,H₂O₂）诱导人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞氧化损伤对三联组氨酸核苷结合蛋白1（histidine triad nucleotide binding protein 1,HINT1）表达的影响。方法　将人ARPE-19细胞系分别用0 μmol·L^-1 H₂O₂（对照组）、50 μmol·L^-1 H₂O₂、100 μmol·L^-1 H₂O₂、200 μmol·L^-1 H₂O₂、400 μmol·L^-1 H₂O₂、600 μmol·L^-1 H₂O₂ 6个浓度梯度处理。采用Live/Dead荧光双染法和MTT法分别检测细胞活力和增殖能力;采用Western blot检测RPE细胞内BAX、BCL-2以及HINT1的表达水平。结果　H₂O₂处理6 h后,对照组及50 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1及600 μmol·L^-1 H₂O₂组RPE细胞死亡率分别为（0.35±0.11）%、（2.03±0.87）%、（3.76±1.41）%、（12.17±1.26）%、（17.69±2.24）%、（25.22±0.59）%,RPE细胞死亡率呈剂量依赖性升高（P<0.05）。H₂O₂作用后对照组及50 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1、600 μmol·L^-1 H₂O₂组RPE细胞生存率分别为（40.72±2.71）%、（37.75±0.62）%、（35.30±0.68）%、（34.10±0.74）%、（33.61±0.71）%、（31.05±1.41）%,RPE细胞增殖明显减少（P<0.05）,具有剂量-效应关系。随着H₂O₂浓度的增加,BAX蛋白表达逐渐上升（P<0.01）,而抗凋亡BCL-2蛋白表达则逐渐下降（P<0.01）,BAX/BCL-2比值相比对照组分别升高1.85倍（50 μmol·L^-1 H₂O₂组）、2.35倍（100 μmol·L^-1 H₂O₂组）、2.86倍（200 μmol·L^-1 H₂O₂组）、3.97倍（400 μmol·L^-1 H₂O₂组）、8.50倍（600 μmol·L^-1 H₂O₂组）;HINT1在H₂O₂处理的RPE细胞中以剂量依赖性方式逐渐下降（P<0.01）,分别下降0.78倍（50 μmol·L^-1 H₂O₂组）、0.59倍（100 μmol·L^-1 H₂O₂组）、0.45倍（200 μmol·L^-1 H₂O₂组）、0.42倍（400 μmol·L^-1 H₂O₂组）、0.38倍（600 μmol·L^-1 H₂O₂组）。结论　H₂O₂氧化损伤诱导RPE细胞活力显著减弱,细胞凋亡相关蛋白BAX表达升高;同时,细胞中HINT1表达下调,表明HINT1可能通过影响细胞凋亡参与年龄相关性黄斑变性的发生,为其药物作用的潜在靶点。     

视网膜色素上皮细胞 LncRNA MEG3在不同葡萄糖浓度下的表达情况及对VEGF和 TGF-β1表达的影响

目的　探讨长链非编码RNA母系表达基因3（LncRNA MEG3）在不同浓度葡萄糖下表达情况及对血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响。 方法　按照不同浓度d-葡萄糖培养ARPE-19细胞,随机分为5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、30 mmol·L^-1d-葡萄糖组。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测各组ARPE-19细胞LncRNA MEG3、VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平。ARPE-19细胞转染PCDNA-MEG3及PCDNA-NC质粒,建立LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞及转染空质粒的ARPE-19细胞。以含30 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM分别培养以下各组ARPE-19细胞:LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞(O组);转染空质粒的ARPE-19细胞（NC组）;加入PBS的正常ARPE-19细胞(G组);同时以含5 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM培养正常ARPE-19细胞（C组）;以上各组细胞培养24 h后,采用RT-qPCR法及Western blot法检测各组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白的相对表达水平。 结果　与5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组和30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与G组和NC组比较,O组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白相对表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论　高糖下调ARPE-19细胞LncRNA MEG3的表达,上调VEGF和 TGF-β1的表达。LncRNA MEG3过表达降低高糖诱导的VEGF和 TGF-β1表达的升高。LncRNA MEG3可能通过抑制VEGF和 TGF-β1的表达调节糖尿病视网膜病变的发展。     

吴茱萸碱对视网膜母细胞瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响

目的　探讨吴茱萸碱对视网膜母细胞瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响,分析整合素β2-反义RNA1（ITGB2-AS1）在视网膜母细胞瘤中的表达和作用。方法　取对数生长期HXO-Rb44细胞铺在96孔板上,用终浓度为1 μmol·L^-1、2 μmol·L^-1、4 μmol·L^-1吴茱萸碱处理细胞24 h,记为吴茱萸碱1 μmol·L^-1组、吴茱萸碱2 μmol·L^-1组、吴茱萸碱4 μmol·L^-1组,同时将不经吴茱萸碱处理的细胞设为对照组;按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书将si-NC、si-ITGB2-AS1转染细胞,记为si-NC组、si-ITGB2-AS1组;将pcDNA、pcDNA-ITGB2-AS1转染细胞,再用4 μmol·L^-1吴茱萸碱处理,记为吴茱萸碱4 μmol·L^-1+pcDNA组、吴茱萸碱4 μmol·L^-1+pcDNA-ITGB2-AS1组。采用MTT法测定细胞存活率,平板克隆实验计数克隆形成数, 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况,qRT-PCR检测ITGB2-AS1表达。结果　吴茱萸碱2 μmol·L^-1组、吴茱萸碱4 μmol·L^-1组细胞存活率和克隆形成数较对照组、吴茱萸碱1 μmol·L^-1组减小,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;吴茱萸碱4 μmol·L^-1组细胞存活率和克隆形成数较吴茱萸碱2 μmol·L^-1组减小,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。吴茱萸碱2 μmol·L^-1组、吴茱萸碱4 μmol·L^-1组G₀-G₁期细胞比例较对照组、吴茱萸碱1 μmol·L^-1组下降,G₂-M期细胞比例较对照组、吴茱萸碱1 μmol·L^-1组升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;吴茱萸碱4 μmol·L^-1组G₀-G₁期细胞比例较吴茱萸碱2 μmol·L^-1组下降,G₂-M期细胞比例较吴茱萸碱2 μmol·L^-1组升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。吴茱萸碱2 μmol·L^-1组、吴茱萸碱4 μmol·L^-1组细胞凋亡率较对照组、吴茱萸碱1 μmol·L^-1组升高,ITGB2-AS1表达量较对照组、吴茱萸碱1 μmol·L^-1组降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;吴茱萸碱4 μmol·L^-1组细胞凋亡率较吴茱萸碱2 μmol·L^-1组升高,ITGB2-AS1表达量较吴茱萸碱2 μmol·L^-1组降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。si-ITGB2-AS1组ITGB2-AS1表达量、细胞存活率、克隆形成数和G₀-G₁期细胞比例均较si-NC组降低,G₂-M期细胞比例、细胞凋亡率均较si-NC组升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。吴茱萸碱4 μmol·L^-1+pcDNA-ITGB2-AS1组细胞ITGB2-AS1表达量、细胞存活率和克隆形成数均较吴茱萸碱4 μmol·L^-1+pcDNA组升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。吴茱萸碱4 μmol·L^-1+pcDNA-ITGB2-AS1组G₀-G₁期细胞比例较吴茱萸碱4 μmol·L^-1+pcDNA组高, G₂-M期细胞比例、细胞凋亡率较吴茱萸碱4 μmol·L^-1+pcDNA组低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　吴茱萸碱通过抑制ITGB2-AS1表达降低视网膜母细胞瘤细胞增殖,阻滞G₂-M期细胞周期,并促进细胞凋亡。     

槲皮素对转化生长因子β1介导的视网膜色素上皮细胞上皮-间质转化过程的影响

目的 探讨槲皮素对转化生长因子β1(TGF-β1)介导的视网膜色素上皮(RPE)细胞增殖、迁移、I型胶原蛋白含量、上皮-间质转化相关标志物表达以及Smad信号通路的影响.方法 取人RPE细胞系(ARPE-19细胞)进行培养,依据干预药物浓度筛选结果设置4个组:对照组、10.0 mg·L-1 TGF-β1组、10.0 m...     

藤黄酸通过CYLD/NF-κB信号通路抑制高糖环境下RPE细胞上皮-间充质转化的作用

目的 基于去泛素化酶圆柱瘤蛋白/核因子κB(CYLD/NF-κB)通路,研究藤黄酸(GA)对高糖环境下视网膜色素上皮(RPE)细胞上皮-间充质转化(EMT)的作用。方法 体外培养ARPE-19细胞,高糖诱导,实验分为NC组(含5.5 mmol·L^-1葡萄糖),HG组(含30 mmol·L^-1葡萄糖),HG+不同剂量GA组(2μmol·L^-1、4μmol·L^-1、8μmol·L^-1GA分别预处理RPE细胞1 h,加30 mmol·L^-1葡萄糖)。CCK-8检测各组RPE细胞增殖活力,免疫荧光染色检测RPE细胞中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、去泛素化酶圆柱瘤蛋白(CYLD)表达;Western blot检测RPE细胞中α-SMA、CYLD、磷酸化核转录因子κB(p-NF-κB)蛋白表达。结果 与NC组相比,HG组RPE细胞出现明显增殖,RPE细胞中α-SMA、p-NF-κB蛋白表达均增加,CYLD蛋白表达减少(均为P<0.01);与HG组相比,HG+不...     

缓激肽对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导视网膜色素上皮细胞发生上皮间充质转化的影响

目的　制作增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）细胞模型,研究缓激肽（bradykinin,BK）对视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞发生EMT的影响,并探讨BK对PVR的影响机制。方法　体外培养人RPE细胞株ARPE-19细胞,采用不同浓度转化生长因子-β1（transforming growth factor- β1,TGF- β1）分别作用于ARPE-19细胞24 h、48 h,于倒置显微镜下观察细胞形态变化;采用CCK-8检测细胞增殖情况,确定TGF-β1浓度及作用时间;利用Western blot和细胞免疫荧光检测EMT标志蛋白E-钙黏素、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和波形蛋白（Viminten）表达情况;细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移能力。同时采用Western blot检测TGF/Smad通路下游pSmad3和Smad7的表达。结果　TGF- β1刺激ARPE-19细胞后可以成功诱导EMT体外细胞模型。当TGF-β1浓度为10 μg·L^-1、作用时间为48 h时,细胞增殖最明显。BK在TGF- β1诱导的EMT中可以降低α-SMA、Viminten的表达,升高E-钙黏素的表达并且降低细胞迁移能力。这些影响能被BK-2受体拮抗剂HOE-140逆转。TGF-β1诱导ARPE-19细胞发生EMT时,pSmad3表达量升高;TGF-β1刺激前给予BK刺激,pSmad3表达量减少;加入BK前预敷HOE-140,然后给予TGF-β1刺激,BK作用减弱,pSmad3表达量升高。Smad7表达趋势与pSmad3表达趋势相反。结论　10 μg·L^-1 TGF-β1可导致ARPE-19细胞发生EMT。BK通过TGF-/Smad信号通路上调Smad 7的表达、下调pSmad 3的表达,从而逆转TGF-β1诱导的EMT。提示BK可能是一种新的、有效的治疗PVR的方法。     

氧化应激诱导视网膜色素上皮细胞中钙蛋白酶激活作用研究

目的　观察一定浓度H₂O₂氧化应激体外培养人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE） 细胞中钙蛋白酶（Calpain）含量及细胞活性改变。方法　常规培养商品化人RPE细胞系ARPE-19作为对照组,培养基内加入终浓度为10 μmol·L^-1 及 100 μmol·L^-1的H₂O₂作为实验组,培养4 h、8 h、16 h及32 h进行测定。MTT法测定不同浓度H₂O₂刺激下RPE细胞不同检测时间点细胞增殖率的变化;Fluo-3/AM、ester钙离子荧光探针标记细胞内钙离子,激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测RPE细胞内钙离子荧光值,间接观察钙离子浓度变化。10 μmol·L^-1 H₂O₂氧化刺激RPE细胞8 h,用Western-Blot法及实时荧光定量PCR法检测细胞内Calpain蛋白及RNA含量的变化。结果　与对照组相比,10 μmol·L^-1 H₂O₂刺激RPE细胞4 h、8 h、16 h及100 μmol·L^-1 H₂O₂刺激RPE细胞4 h及8 h后增殖率（r值） 升高差异均具有显著统计学意义（均为P<0.01）。100 μmol·L^-1 H₂O₂刺激16 h及32 h细胞增殖率均较对照组下降（均为P<0.01）。10 μmol·L^-1 H₂O₂刺激RPE细胞8 h后胞内钙离子荧光强度（563.27±77.10）U较对照组（170.77±20.11）U显著升高（P<0.01）、Calpain在mRNA和蛋白水平均较对照组显著升高（均为P<0.05）,而在同时使用Calpain抑制剂SNJ-1945（SNJ）的实验组这些变化可被有效抑制。结论　RPE细胞中钙超载激活Calpain参与H₂O₂氧化刺激RPE细胞的氧化应激改变。