蛋白激酶Cα在人角膜基质细胞中的表达

目的 观察蛋白激酶Ca（PKCα）在原位及体外培养的人角膜基质细胞中的表达。方法标本来源于北京大学第一医院眼库。人角膜基质细胞体外原代及传代培养，应用免疫组织化学法检测PKCα在培养的人角膜基质细胞中的表达；制作人正常角膜组织冰冻切片，观察PKCα在角膜基质细胞中的表达。结果免疫组织化学法检测显示：正常人原位角膜基质细胞对PKCα无明显表达，而体外培养的人角膜基质细胞有明显阳性表达。结论特殊的角膜创伤模型——体外培养人角膜基质细胞中PKCα有明显阳性表达，提示PKC在角膜基质细胞增生过程中扮演了重要角色，抑制PKC的活性有可能成为治疗角膜瘢痕愈合的一个新途径。     

组织工程角膜基质的体外构建及移植的实验研究

目的探讨利用组织工程技术体外构建角膜基质进行板层角膜移植的可行性和有效性。方法将猪角膜基质去细胞处理后制备成组织工程角膜基质载体;取幼兔角膜基质细胞体外培养,将其种植在载体上,体外构建成组织工程角膜基质,用PKH26荧光标记兔角膜基质细胞示踪角膜基质的构建;将16只兔的角膜基质内植入壳聚糖膜使之形成无菌性角膜溃疡,随机从16只兔中选8只,进行组织工程角膜基质移植;另外8只作为对照组,进行新鲜的同种异体兔板层角膜移植。术后对角膜进行裂隙灯、光学显微镜、透射电镜观察。结果体外构建的组织工程角膜的基质细胞具有活性,其结构与正常角膜基质相近。移植治疗无菌性角膜溃疡术后,1~2周有新生血管侵入组织工程角膜基质植片边缘,植片为灰白色半透明状;3~4周随着新生血管减退,组织工程角膜基质植片局部开始透明变薄;术后8~10周角膜溃疡完全修复,角膜恢复透明性,角膜神经可再生;观察最长达10月,角膜仍保持透明,无免疫排斥发生,与对照组疗效相同。结论体外构建的组织工程角膜基质无免疫原性、具有良好的生物相容性,可作为临床治疗角膜溃疡的移植材料。     

脱细胞猪角膜基质的生物相容性与组织工程化兔角膜上皮移植的研究

目的 探讨脱细胞猪角膜基质的生物相容性,评价组织工程化角膜上皮组织作供体的可行性,观察支架材料的细胞化情况和种子细胞的存活情况.方法 实验研究.采用完全随机化设计的方法,用Dispase-Triton-X-100处理猪角膜基质,脱去角膜细胞;以角膜基质囊袋内植入的方法,观察异种角膜基质植入后的生物相容性,A组:脱细胞猪角膜基质,B组:新鲜猪角膜基质,C组:空白对照组.以组织工程化雄性角膜上皮组织为供体,同种雌性为受体,作板层角膜移植,观察角膜的混浊、水肿、新生血管等情况;组织病理学和免疫组化方法检测支架材料的细胞化情况,Y染色体性别决定基因(SRY)-聚合酶链反应(PCR)方法追踪种子细胞的存活情况.结果 猪角膜基质植入兔角膜囊袋后,角膜逐渐恢复透明,排斥反应指数＜6,组织病理学观察角膜结构完整,胶原纤维平行排列,少许细胞长入脱细胞猪角膜基质边缘,各组免疫组化检测未见CIM+、CD8+T淋巴细胞浸润.组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植后,3～4 d上皮光滑,10～20 d变为透明;15 d时角膜上皮、基质、内皮完整,上皮细胞约4或5层结构,少许基质细胞长入支架,1个月时可见角膜上皮细胞约7或8层细胞,基质纤维排列规则,多量细胞长入脱细胞角膜基质.上皮细胞表达CK3,支架内新生细胞表达波形蛋白.SRY-PCR结果显示种子细胞可以在受体内长期存活.结论 脱细胞猪角膜基质生物相容性良好,组织工程化角膜上皮可作为板层角膜移植的供体,脱细胞猪角膜基质细胞化良好,种子细胞可以在受体内长期存活.     

显微板层角膜移植术后形态学改变及对角膜透明度的影响

目的 了解显微板层角膜移植术后的组织学改变及对角膜透明度的影响。方法 利用光镜、电镜和分光光度计观察了显微板层角膜移植术后不同时期角膜基质的组织学变化、透光度和吸光度，对比观察了显微角膜切刀和准分子激光切削的角膜剖面形态。结果 准分子激光切削的角膜表面有许多变性胶原碎屑。显微角膜切开刀切削的角膜表面光滑，术后１个月，光镜下无明显的瘢痕，透射电镜仅见２～３个角膜板层厚度的界面瘢痕，其下３～４个板层内的角膜细胞有较多伪足，但无炎性细胞浸润。术后１，３个月角膜的透光率和吸光度与未手术角膜比较无显著性差异。结论 显微板层角膜移植术后界面瘢痕轻微，不影响角膜透明度。     

TGF-β在角膜中的作用

转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一个多功能的生长因子,对角膜上皮、内皮和基质细胞均有影响。TGF-β与免疫抑制有着密切的联系,当在培养液内添加TGF-β1时,可使CD69+CD25+和CD25+CD4+、CD25+CD8+、CD71+CD4+、CD71+CD8+的表达受到抑制。有实验证明:局部应用TGF-β1对大鼠的移植排斥反应具有抑制作用,TGF-β1治疗组移植片比对照组透明时间长。用猪角膜作载体,体外构建TGF-β1转基因后板层角膜植片移植给兔,结果表明:角膜内皮细胞内高表达TGF-β1,可抑制免疫排斥反应的发生和延长移植片的成活时间。初步应用TGF-β1滴眼液治疗角膜与免疫相关疾病结果证实,TGF-β1能够提高这些眼病的治愈率,缩短其病程。     

应用GFP基因转染技术示踪组织工程技术构建角膜基质

目的 应用基因转染技术将绿色荧光蛋白(GFP)标记角膜基质绌胞，以此为种子细胞构建角膜基质并对构建过程进行示踪。方法 构建携带EGFP基因的重组逆转录病毒载体PLNCX2-EGFP，转染兔角膜基质细胞，然后将该细胞接种于PGA，形成细胞-生物材料复合物，移植于母兔角膜基质板层内。术后8周，组织学切片，HE染色，荧光显微镜下对绿色荧光蛋白(GFP)进行示踪观察。结果 8周后，组织工程化角膜组织形成，组织学切片显示PGA完全降解，新生组织形成，组织排列规整，荧光显微镜下见新生组织呈绿色，提示EGFP表达。结论 组织工程角膜基质的组织学结构与角膜基质相类似。新生组织表达GFP，证实组织工程角膜基质组织的构成源于供体细胞。     

异种角膜基质的研究现状及问题

在角膜3层(上皮层+Bowman's膜、基质层、内皮层+Descemet's膜)膜中,按等量计算,基质层的免疫原性是最低的.应用脱细胞的异种角膜基质移植后,神经和基质细胞可以再生,术后未见排斥反应,植片获得透明.因此,异种角膜基质有望成为板层角膜移植的供体和组织工程角膜的载体.现就异种角膜基质的研究现状及问题综述如下.     

转化生长因子β诱导基因在人角膜组织及细胞中的表达

背景 临床研究表明多数角膜营养不良的发病与转化生长因子β诱导(TGFBI)基因突变有关,但其发病的分子机制尚不完全清楚. 目的 研究TGFBI基因在人角膜组织及体外培养的角膜上皮细胞和基质细胞中的表达,为进一步研究角膜营养不良的发病机制奠定基础. 方法 对人角膜上皮细胞和基质细胞进行培养和传代,应用逆转录聚合酶链反应( RT-PCR)法检测TGFBI mRNA在人角膜组织及细胞中的表达,将供体角膜组织制成石蜡包埋切片,利用免疫组织化学法检测TGFBI蛋白在角膜组织、人角膜上皮细胞和角膜基质细胞中的表达,采用免疫荧光技术检测TGFBI蛋白在细胞爬片的表达. 结果 RT-PCR检测显示人角膜组织和基质细胞中在1274 bp处可见TGFBI mRNA的清晰条带,而角膜上皮细胞中亦有TGFBImRNA表达.免疫组织化学检测显示,TGFBI蛋白在人角膜组织中基质细胞的细胞质中呈阳性表达,但人角膜上皮细胞中未见TGFBI蛋白表达.免疫荧光检测技术显示,人角膜基质细胞胞质中TGFBI蛋白呈红色荧光,而角膜上皮细胞未见TGFBI蛋白表达. 结论 TGFBI主要在人角膜基质层表达,而在上皮层几乎不表达,有助于进一步研究TGFBI在角膜营养不良发病机制中的作用.     

异种角膜脱细胞基质和几丁糖载体构建角膜基质层的比较

目的探索异种角膜脱细胞基质和几丁糖为载体构建生物角膜组织的可行性，评价二者的结构、功能和生物相容性。方法l％TritonX-100及冷冻干燥处理获得猪角膜脱细胞基质，网状几丁糖材料制备成似角膜片状形态，将体外培养的兔角膜基质细胞种植于两种载体，体外培养2周，形成细胞载体复合物。对构建的角膜组织进行苏木精-伊红染色、扫描电镜观察；同时将两种生物材料移植到兔角膜基质囊袋内，观察其生物相容性。结果角膜基质细胞在两种载体上皆可黏附生长，并分泌细胞外基质。脱细胞基质载体内细胞形态不规则，位于胶原板层间，形成类似正常组织的角膜基质结构；细胞可在几丁糖网状纤维上黏附并包绕生长。两种载体移植到兔角膜囊袋后，脱细胞基质降解较慢，与宿主角膜组织相融性良好，未发生明显排斥及毒性反应；几丁糖载体降解较迅速，但降解产物诱导较严重的排斥反应。结论异种角膜脱细胞基质保留正常组织的胶原板层结构，并具角膜的韧性和良好的生物相容性，更适于作为体外构建生物角膜的载体，而几丁糖材料则需要在构成结构和性能等方面进一步改进．     

脱水保存角膜基质为载体培养角膜内皮细胞的实验研究

目的探讨以脱水保存角膜基质/后弹力层为载体培养角膜内皮细胞,构建组织工程化角膜内皮细胞移植膜的可行性及其机理。设计实验性研究。研究对象体外培养的兔角膜内皮细胞和脱水保存角膜基质/后弹力层。方法兔角膜经中性蛋白酶37°C孵育5min,去除内皮细胞保留后弹力层和角膜基质,无水氯化钙脱水后低温保存,使用前磷酸盐缓冲液复水。纯化的角膜内皮细胞接种于基质载体的后弹力层上进行体外培养,直至生长融合为细胞单层,倒置显微镜下观察细胞形态学变化。在不同时间点(1、2、4、6d)收集植片进行HE染色和电镜检测,分析组织结构的变化。主要指标角膜内皮细胞在脱水保存角膜基质/后弹力层载体上形成单层时间和生长特性,组织工程化角膜内皮细胞移植膜的三维结构和超微结构。结果角膜内皮细胞在载体上快速贴壁生长并增殖,体外培养6～7d即融合成单层,复合角膜内皮组织由基质/后弹力层和单层扁平内皮细胞组成,与生理状态下的角膜内皮组织相近。电镜下组织培养的兔角膜内皮细胞间连接紧密,细胞为多边形,胞核清晰,具有正常兔角膜内皮细胞的超微结构。结论角膜内皮细胞能够在干燥脱水保存基质/后弹力层载体上良好生长,并形成形态结构与正常角膜内皮组织相似的细胞单层,为角膜内皮细胞移植提供了新的载体选择。(眼科,2006,15:164-168)     

Acellular porcine corneal matrix as a carrier scaffold for cultivating human corneal epithelial cells and fibroblasts in vitro

AIM: To investigate the feasibility of corneal anterior lamellar reconstruction with human corneal epithelial cells and fibroblasts, and an acellular porcine cornea matrix (APCM) in vitro. METHODS: The scaffold was prepared from fresh porcine corneas which were treated with 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution and the complete removal of corneal cells was confirmed by hematoxylin-eosin (HE) staining and 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. Human corneal fibroblasts and epithelial cells were cultured with leaching liquid extracted from APCM, and then cell proliferative ability was evaluated by MTT assay. To construct a human corneal anterior lamellar replacement, corneal fibroblasts were injected into the APCM and cultured for 3d, followed by culturing corneal epithelial cells on the stroma construction surface for another 10d. The corneal replacement was analyzed by HE staining, and immunofluorescence staining. RESULTS: Histological examination indicated that there were no cells in the APCM by HE staining, and DAPI staining did not detect any residual DNA. The leaching liquid from APCM had little influence on the proliferation ability of human corneal fibroblasts and epithelial cells. At 10d, a continuous 3 to 5 layers of human corneal epithelial cells covering the surface of the APCM was observed, and the injected corneal fibroblasts distributed within the scaffold. The phenotype of the construction was similar to normal human corneas, with high expression of cytokeratin 12 in the epithelial cell layer and high expression of vimentin in the stroma. CONCLUSION: Corneal anterior lamellar replacement can be reconstructed in vitro by cultivating human corneal epithelial cells and fibroblasts with an acellular porcine cornea matrix. This laid the foundation for the further transplantation in vivo.     

In vitro tissue engineering of lamellar cornea using human amniotic epithelial cells and rabbit cornea stroma

AIM:To reconstruct the lamellar cornea using human amniotic epithelial (HAE) cells and rabbit cornea stroma in vitro using tissue engineering technology.METHODS: Human amnia taken from uncomplicated caesarean sections were digested by collagenase to obtain HAE cells, and the cells were cultured to proliferate. Rabbit corneal epithelial cells were removed by n-heptanol to make lamellar matrix sheets. The second passage of HAE cells were cultured on the corneal stroma sheets for 1 or 2 days, then transferred to an air-liquid interface environment to culture for 2 weeks. Tissue engineered lamellar cornea (TELC) morphology was observed by Hematoxylin-eosin (HE) staining; its ultrastructure was observed by transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM); corneal epithelial cell-specific keratin 3 and keratin 12 were detected with immunofluorescence microscopy.RESULTS:HAE cells grew on the rabbit corneal stroma, forming a monolayer after 1-2 days. About 4-5 layers of epithelial cells developed after 2 weeks of air-liquid interface cultivation, a result similar to normal corneal epithelium. Rabbit corneal stromal cells were significantly reduced after one week, then almost completely disappeared after 2 weeks. TEM showed desmosomes between the epithelial cells; hemidesmosomes formed between the epithelial cells and the basement membrane. SEM revealed that the HAE cells which grew on the lamellar cornea had abundant microvilli. The tissue-engineered cornea expressed keratin 3 and keratin 12, as detected by immunofluorescence assay.CONCLUSION: Functional tissue-engineered lamellar corneal grafts can be constructed in vitro using HAE cells and rabbit corneal stroma.     

异种角膜脱细胞基质为供体进行角膜前板层移植的初步研究

目的探讨以异种猪角膜脱细胞基质为供体植片,分析兔角膜进行前板层移植后的生物相容性：设计实验研究。研究对象新西兰白兔。方法应用1％TritonX-100及冷冻干燥处理制备猪角膜脱细胞基质载体,切取1／3厚度前板层作为供体角膜植片,对兔眼角膜前板层切除后进行移植,同时以新鲜猪角膜板层为供体对兔进行前板层移植作对照。通过术后角膜透明度、组织结构观察,评价猪角膜脱细胞基质的生物相容性及植片转归的情况。主要指标角膜透明度和组织学HE染色。结果制备的猪角膜脱细胞基质植片作前板层移植到兔眼后,未见明显的新生血管、炎症反应、角膜坏死等排斥现象,观察期内植片较透明;脱细胞基质表面上皮化良好,植片基质板层与植床逐渐融合,植片内有宿主细胞迁入生长,板层结构与正常角膜相似。结论猪角膜脱细胞基质具有良好的生物相容性、安全性和低抗原性,有望成为角膜板层移植的供体材料。     

以干燥脱水法保存的异种角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织

目的:观察以干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织的生物学特性。方法:采用组织块培养法获得新西兰大白兔角膜缘干细胞,经胰蛋白酶消化法获得细胞,种植于干燥脱水法保存的鸵鸟角膜板层基质上,采用气液界面培养法进行培养,通过倒置显微镜、透射电子显微镜、荧光显微镜观察其形态学、生长特点,超微结构及免疫学特征。结果:在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质上种植兔角膜缘干细胞,接种72h后,细胞形成单层,移置气液交界面后继续培养7～10d,逐渐形成复层。经光镜、透射电镜、及免疫学检测显示其具有角膜上皮组织的生物学特性。结论:兔角膜缘干细胞能够在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质载体上生长,并可形成复层,基本具有正常角膜上皮细胞的形态、超微结构和生物学特性。     

bFGF对角膜成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)对兔角膜基质成纤维细胞增殖及胶原合成的影响。方法 （1）分组培养正常和切除前板层的角膜成纤维细胞，分别于细胞贴壁后的3、6、9、12、15天观察细胞生长情况，以及bFGF对细胞增殖的影响，并计数。（2）将兔眼分为对照组和实验组，等面积，等深度切除角膜板层后，对照组滴生理盐水，实验组滴bFGF滴眼液，15天后取材，常规电镜制片，观察并比较角膜基质层胶原合成的状况。结果 （1）bFGF可显著促进正常和受损角膜成纤维细胞的增殖。（2）实验组与对照组相比，前者胶原纤维密度高。纤维结构排列明显有序，规律。结论 bFGF可促进角膜成纤维细胞增殖和胶原的合成，使基质层纤维排列更有序。     

Effects of quercetin on diabetic retinopathy and its association with NLRP3 inflammasome and autophagy

AIM: To investigate the effects of quercetin on diabetic retinopathy (DR) and its association with nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors 3 (NLRP3) inflammasome and autophagy using retinal endothelial cell as an experimental model. METHODS: Human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs) were cultured in vitro and assigned into the control group, high-glucose (HG) group, and HG+different concentrations of quercetin groups. Cellular viability, migration, and tube formation in these groups was detected by MTT, transwell and matrigel assay, respectively. Expressions of NLRP3, apoptosis-associated speck-like protein (ASC), cysteiny aspartate-specific protease-1 (Caspase-1) as well as microtubule-related protein 1 light chain 3 (LC3) and Beclin-1 were detected by Western blotting. Expressions of IL-1β and IL-18 were detected by ELISA and cellular autophagy was detected by Cyto-ID® autophagy detection kit. RESULTS: Under an HG condition, the viability, migration, tube formation of HRMECs, and the protein expressions of NLRP3, ASC, Caspase-1, IL-1β, IL-18, LC3, and Beclin-1 as well as autophagy were all increased. Quercetin inhibited angiogenesis of HRMECs as well as the expressions of NLRP3, ASC, Caspase-1, IL-1β, IL-18, LC3, Beclin-1, and autophagy of HRMECs under a HG condition. The inhibitory effects of quercetin on angiogenesis, NLRP3 inflammasome and autophagy increased with the increase of its concentration. CONCLUSION: The therapeutic potential of quercetin in retinal neovascularization of DR, and inhibition of NLRP3 inflammasome and autophagy signaling pathway may be involved.     

种植人骨髓间充质干细胞的猪角膜板层移植治疗兔角膜损伤的初步研究

目的研究种植人骨髓间充质干细胞（MSCs）的猪角膜基质治疗兔角膜损伤的可能性。方法用全骨髓贴壁法分离纯化人MSCs并传代,流式细胞仪检测免疫表型及诱导成脂、成骨分化鉴定。12只新西兰白兔随机分为2组,实验组取第3代MSCs接种于去上皮的猪角膜基质上,培养4 d后移植到广泛损伤的兔角膜上,对照组单纯移植去上皮猪角膜基质。术后2、4、8周,取各实验眼行组织学检查,观察移植的MSCs及猪角膜基质的存活、转归及移植局部的反应。免疫组织化学、免疫荧光染色检测移植后角膜上皮细胞角蛋白12的表达。结果培养获得的MSCs中CD29阳性者占95.97%,CD44阳性者占96.49%,CD90阳性者占92.79%,CD105阳性者占94.66%,CD34阳性者占0.59%,CD45阳性者占0.36%,符合MCSs的免疫表型,并可以诱导成脂及成骨分化。实验组MSCs接种到去上皮猪角膜基质后贴附、生长迅速,术后植片在植床上存活良好,无排斥反应,角膜较对照组透明,新生血管少,而对照组在移植后发生排斥反应。实验组角膜免疫组织化学及免疫荧光染色均检测出CK12阳性细胞。结论种植MSCs的猪角膜基质移植到损伤兔角膜后可以存活,MSCs可以分化为角膜上皮样细胞,具有构建组织工程角膜的潜能。     

经角膜基质细胞诱导的大鼠骨髓间充质干细胞在人羊膜上构建角膜上皮移植片

目的:研究将骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)诱导分化后在羊膜表面培养构建角膜上皮移植片的可行性。方法:取SD大鼠骨髓间充质干细胞和角膜基质细胞,分别培养并传2代后进行共培养,取共培养7d后的MSC覆载于新鲜人羊膜,再培养7d。对MSC及诱导后MSC进行免疫荧光染色和扫描电镜检查;对覆载细胞的羊膜进行HE染色及免疫荧光染色。结果:MSC在体外培养条件下贴壁生长,免疫荧光染色CD29和CD44阳性,CK12阴性。经角膜基质细胞诱导分化后,MSC细胞CK12染色转为阳性。诱导后MSC接种到羊膜表面,迅速贴壁生长,组织学特性无明显改变,CK12染色仍为阳性。结论:经角膜基质细胞诱导的MSC表现出角膜上皮细胞特征,在羊膜上生长后保持不变。     

组织工程角膜研究和应用进展

中国角膜供体材料的严重缺乏导致众多的角膜盲患者不能通过角膜移植来复明仍是临床棘手的问题。近年来,细胞生物学、组织工程学和材料学的发展为替代人角膜材料开辟了更广阔的前景;而且以深板层移植和内皮移植为代表的成分板层移植的推陈出新从临床技术上有力地推动了组织工程角膜的研发。现就脱细胞角膜基质板层材料、上皮细胞和内皮细胞组织工程的基础研究和临床应用进展进行述评。