基于二代测序技术的转录组测序生物信息分析

随着二代测序技术和生物信息学的发展,越来越多的科研人员通过转录组测序(RNAseq)研究基因表达调控、疾病发生机制和遗传育种上的问题。面对测序所产生的大量数据,生物信息学分析策略对于数据的解读显得尤为重要。本文结合不同RNA(mRNA、LncRNA、miRNA和circRNA)的特点,对转录组测序中的几类分析流程及其所涉及的软件和数据库分别做简要的介绍,为RNAseq的生信分析研究提供参考。     

单细胞转录组测序联合空间转录组测序在纤维化疾病研究中的应用进展

单细胞转录组测序联合空间转录组测序可解析组织内每一个细胞的转录组表达谱和空间位置信息,有助于探究细胞的基因表达水平和组织的三维重建,解读细胞异质性,理解细胞间的联系和相互作用,对于深入探讨疾病发生和发展的细胞与分子机制具有重要意义。纤维化疾病累及全身多个器官,病程极为复杂,缺乏有效的抗纤维化治疗方法,因此仍需加强对此类疾病的全面认识。近年来,单细胞转录组测序联合空间转录组测序已应用于纤维化疾病的病理生理机制研究中,取得了较多进展。本文简要介绍单细胞转录组测序联合空间转录组测序技术,并对其在纤维化疾病研究中的应用进展作一综述。     

基于转录组测序分析并验证与肝癌预后相关的miRNA

目的：利用转录组RNA测序分析筛选与肝癌（HCC）预后相关的miRNA。方法：对正常肝细胞HL7702和HCC细胞Huh7、HepG2和Hep3B进行转录本RNA测序,筛选出HCC细胞与正常肝细胞之间的差异表达miRNAs,对差异表达miRNAs进行生物信息学分析,RT-qPCR验证miR-429表达水平,文献分析miR-429与HCC关系。结果：筛选出在Huh7、HepG2和Hep3B中差异表达的miRNAs共100个,其中上调39个,下调61个;KEGG通路分析表明,差异表达miRNAs主要富集于在多糖降解、癌症中的蛋白聚糖、ErbB等信号通路,其中miR-429在4条信号通路中被富集到。转录组RNA测序和RT-qPCR实验显示miR-429在HCC细胞中高表达,利用Kaplan-Meier plotter数据库对其进行生存分析发现,miR-429高表达的HCC患者总体生存期短（HR=1.63,95%CI:1.14～2.31,P<0.05）,文献分析发现miR-429在HCC组织和细胞中高表达,且miR-429高表达是HCC患者生存时间的危险因素。结论：miRNA在HCC细胞...     

塑化剂邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯诱导大鼠尿道下裂的研究

目的采用塑化剂邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)宫内暴露诱导建立大鼠尿道下裂模型,观察DEHP的外生殖器毒性作用。方法孕鼠40只,完全随机分成4组:正常对照组和DEHP低中高3个剂量组[分别为500、750、1 000 mg/(kg.d)]。在怀孕天数(GD)第12～19天连续灌胃,出生后(PND)第1天即对新生鼠进行计数,称体质量和测量肛门至生殖器之间的距离(AGD);PND30测量阴茎长度,观察每组雄性仔鼠的尿道开口位置,判断有无尿道下裂及其严重程度并切取整个阴茎进行病理组织HE染色。结果与对照组相比,随着DEHP暴露剂量增大,每窝产活仔数及雄性活仔数均较对照组有显著减少;同时仔鼠的体质量减轻、AGD和阴茎长度缩短明显(P<0.05,P<0.01)。DEHP低、中、高剂量组诱导出雄性仔鼠尿道下裂发生率分别为10.7%、30.6%和37.0%,与正常对照组比较,差异显著(P<0.05,P<0.01);重型尿道下裂发生率分别为0、8.3%和22.2%;阴茎组织横截面石蜡切片HE染色予以验证。结论 DEHP大鼠宫内暴露成功建立尿道下裂模型,且对子代具有一定的发育和外生殖器毒性效应。     

基于转录组测序的煤工尘肺大鼠模型中线粒体相关差异基因筛选及分析

目的 应用高通量转录组测序技术,对煤工尘肺大鼠模型中线粒体相关差异基因进行筛选及分析。方法 选取无特定病原体（SPF）级SD雄性大鼠30只,根据随机数表法分为对照组、煤尘组、矽尘组,每组10只,采用一次性非暴露式气管内灌注法造模,并常规饲养90 d。取肺组织制作病理标本,观察其病理改变,采用Masson染色观察其纤维化情况,免疫组化检测肺组织的胶原蛋白Ⅰ（COL-Ⅰ）表达情况来确定造模情况。利用转录组测序技术对样本间基因进行差异表达分析,筛选出差异表达基因,然后对差异基因进行GO和KEGG生物信息学分析,进一步筛选出大鼠煤工尘肺模型中与线粒体有关的差异基因,并进行生物信息学分析。结果 HE、Masson染色及免疫组化结果显示,煤尘组与矽尘组中COL-Ⅰ表达量增高。对对照组与煤尘组的差异基因进行筛选,其中与线粒体有关的基因一共35个（上调28个和下调7个）。对对照组与矽尘组的差异基因进行筛选,其中与线粒体有关的基因一共302个（上调202个和下调100个）。通过GO富集分析发现,在生物过程中,细胞过程、单一的有机体过程较为重要;在分子功能中,以活动分子传感器、催化活性为主;在细胞组分中,...     

转录组测序技术在癫痫诊疗中的应用

随着时代发展,转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)技术逐渐广泛应用于医学、动植物学等领域,通过高通量测序平台,对一个生物体中全部的RNA进行测序分析,获得高通量转录组数据,可揭示物种基因表达的规律及差异.癫痫是一种多病因脑部疾病,发病机制尚未明确,RNA-seq技术对癫痫诊治及新药研发有重要价值,...     

茯苓菌落褐变的转录组测序分析

【目的】探究中药茯苓菌落褐变的相关基因,为进一步验证茯苓菌丝褐变相关基因及探讨其分子机理奠定基础。【方法】对茯苓正常与褐变菌丝体共4个样品的转录组进行测序,并与茯苓参考基因组进行序列比对,并基于比对结果进行各基因在不同样品中的表达量分析。【结果】共鉴定到12 383个转录本,发掘新基因1 017个,其中260个得到功能注释;发现正常菌落与3个不同程度褐变菌落有336个共同差异基因。【结论】茯苓菌落褐变的转录组测序分析发现系列差异表达基因,部分基因的表达量倍数差异达到数百倍甚至上千倍,它们的相关功能值得进行深入分析。     

邻苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯通过氧化应激、凋亡诱导大鼠尿道下裂

目的 探讨邻苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]诱导大鼠发生尿道下裂的发生机制.方法 20只成年孕SD大鼠[10 ～ 12周龄,体质量(240 ±20)g]按完全随机分为:玉米油对照组[750 mg/(kg·d),n=10]和DEHP暴露组[750 mg/(kg·d),n=10],于妊娠期(gestation day,GD)第8.5 ～18.5日每日灌胃,于GD19.5时剖宫取出胎鼠,以有无睾丸分辨雌雄,并在解剖显微镜下观察有无尿道下裂的发生,将DEHP暴露组有尿道下裂的列入尿道下裂组,以玉米油对照组雄性无尿道下裂的胎鼠作为正常对照组.测量雄鼠胎鼠的肛门生殖器距离(anogenital distance,AGD)和肛门生殖指数(anogenital index,AGI),扫描电镜和HE染色观察阴茎组织形态改变情况,高效液相色谱法检测胎鼠肝脏中的维生素A、E水平,Westem blot检测阴茎组织中氧化应激相关蛋白Nrf2、HO-1、SOD1、Gpx和凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax、Bcl2的表达水平,TUNEL法检测阴茎组织中的细胞凋亡.结果玉米油对照组胎鼠无尿道下裂发生,DEHP暴露组胎鼠出现尿道下裂,发生率为27.59％.与正常对照组相比,尿道下裂组AGD、AGI均明显降低(P＜0.05);尿道下裂胎鼠阴茎出现腹侧尿道皱褶融合障碍及尿道口开口异常;此外,尿道下裂胎鼠体内维生素A、E的水平明显降低(P＜0.05);阴茎组织中Nrf2、HO-1、Gpx、SOD1和Bcl2蛋白表达水平明显下降(P＜0.05),cleaved caspase-3和Bax蛋白表达水平则明显增高(P＜0.05),细胞凋亡显著增加(P＜0.05).结论DEHP诱导SD大鼠发生尿道下裂,可能与机体氧化应激失衡、Nrf2-HO-1信号通路被抑制后阴茎组织中细胞凋亡异常增加有关.     

邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯胚胎期暴露对子代大鼠发育的影响

目的通过大鼠孕期邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）暴露,评价DEHP对子代大鼠发育的影响,初步探讨DEHP的发育神经毒性机制。方法成熟雌性Wistar大鼠从妊娠日起用10mg/（kg.d）、100mg/（kg.d）、500mg/（kg.d）及1000mg/（kg.d）DEHP连续灌胃染毒至孕19天。动态观察孕鼠一般自然情况及生产率、仔鼠的体重变化及仔鼠的行为畸胎学指标。结果1000mg/（kg.d）DEHP剂量组孕鼠食欲降低,体重增长受限,而其他各组孕鼠一般自然情况良好;与对照组相比,DEHP不同剂量组生产率受到一定影响,1000mg/（kg.d）DEHP剂量组孕鼠生产率为0,出现吸收胎的现象;10mg/（kg.d）、100mg/（kg.d）、500 mg/（kg.d）各剂量组仔鼠第1天、4天、7天、14天体重比对照组有降低趋势;第21天500 mg/（kg.d）DEHP组的仔鼠体重增长受限,差别具有显著性;仔鼠开眼时间、平面翻正、断崖回避、触须定位、听觉惊愕反射实验各剂量组仔鼠的达标时间均有稍落后于对照组的趋势;负趋地性反射实验显示500 mg/（kg.d）DEHP组与对照组相比,达标时间延迟,空中翻正实验100mg/（kg.d）、500 mg/（kg.d）组与对照组相比,达标时间延迟,差别具有显著性。结论2-乙基DEHP胚胎期暴露影响子代大鼠的发育,存在着一定的剂量反应关系。     

Di(2-ethylhexyl) phthalate Disorders Lipid Metabolism via TYK2/STAT1 and Autophagy in Rats

Objective Previous studies have indicated that the plasticizer di(2-ethylhexyl) phthalate(DEHP) affects lipid accumulation;however, its underlying mechanism remains unclear. We aim to clarify the effect of DEHP on lipid metabolism and the role of TYK2/STAT1 and autophagy. Methods In total, 160 Wistar rats were exposed to DEHP [0, 5, 50, 500 mg/(kg·d)] for 8 weeks. Lipid levels, as well as mRNA and protein levels of TYK2, STAT1, PPARγ, AOX, FAS, LPL, and LC3 were detected. Results The results indicate that DEHP exposure may lead to increased weight gain and altered serum lipids. We observed that DEHP exposure affected liver parenchyma and increased the volume or number of fat cells. In adipose tissue, decreased TYK2 and STAT1 promoted the expression of PPARγ and FAS. The mRNA and protein expression of LC3 in 50 and 500 mg/(kg·d) groups was increased significantly. In the liver, TYK2 and STAT1 increased compensatorily;however, the expression of FAS and AOX increased, while LPL expression decreased. Joint exposure to both a high-fat diet and DEHP led to complete disorder of lipid metabolism. Conclusion It is suggested that DEHP induces lipid metabolism disorder by regulating TYK2/STAT1. Autophagy may play a potential role in this process as well. High-fat diet, in combination with DEHP exposure, may jointly have an effect on lipid metabolism disorder.     

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和邻苯二甲酸二丁酯联合染毒对青春期大鼠精子生成的影响

目的:探讨邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)和邻苯二甲酸二丁酯(DBP)联合染毒对青春期大鼠精子生成的影响。方法:6周龄SD大鼠(56只)随机分为染毒[375、750和1 500 mg/(kg.d)]组[予等质量DEHP和DBP混合物(溶解于玉米油中)灌胃]和对照组(予等量玉米油),每组14只。两组2、4周末断头各处死7只,并观察生精功能和附睾组织学改变。结果:染毒2周,750、1 500 mg/(kg.d)组睾丸内精子头数目、每日精子生成量和附睾精子总数及精子畸形率与对照组比有统计学意义(P<0.05);染毒4周,1 500 mg/(kg.d)组睾丸内精子头数目、每日精子生成量和附睾精子总数及精子畸形率与对照组比有统计学意义(P<0.05)。染毒2、4周,染毒组附睾管厚度与对照组比有统计学意义(P<0.01)。结论:DEHP和DBP联合染毒对青春期大鼠有明显的生殖毒性作用,可严重影响精子生成数量和质量,且对附睾有一定的毒害作用。     

Identification of Key Blood Biomarkers Linking Di(2-ethylhexyl) Phthalate and Autoimmune Diseases in Adolescents Mice

<正>Di（2-ethylhexyl） phthalate（DEHP） is a widely used plasticizer known for its reproductive developmental and immune system toxicity, mainly through esophagal, dermal, and respiratory exposure^[1-3]. Maternal exposure to DEHP during pregnancy can lead to adverse birth outcomes in offspring, including impacts on the thyroid system of adolescent offspring^[2-4].     

邻苯二甲酸二乙基己酯及代谢产物邻苯二酸-单-2-乙基己酯对雄性幼鼠生精细胞凋亡的影响

目的了解环境内分泌干扰因子邻苯二甲酸二乙基已酯（DEHP）及代谢产物邻苯二酸-单-2-乙基己酯（MEHP）对雄性幼鼠
生精细胞凋亡有否影响。方法生后2周龄的Wistar雄性幼鼠98只,随机分为14组,7只/组。随机选择1组行生理盐水（0.9%
NS0.2ml·kg-1 ·d-1）灌胃喂养3周,作为正常对照组（NC组）;再选1组行环磷酰胺（CTX100mg·kg
-1 ·d-1）灌胃喂养1周,作为阳性对照组（PC组）;余各组分别用DEHP、MEHP按低剂量（100mg·kg
-1 ·d-1）、中剂量（200mg·kg-1 ·d-1）、高剂量（300mg·kg-1 ·d-1）灌胃喂养1周;以及分别按低剂量（100mg·kg
-1 ·d-1）灌胃喂养1、2、3周分组,建立动物模型。观察不同时期、不同剂量下睾丸生精细胞
的形态学变化,并应用TUNEL法检查睾丸生精细胞凋亡情况,放射免疫法检测血清性激素（卵泡刺激素FSH、黄体生成素LH以
及睾酮T）水平。结果（1）睾丸生精细胞的变化：用药组生精细胞萎缩、发育落后、数量少,线粒体肿胀、空泡化等;在喂养1周的
不同剂量组内,随剂量增加生精细胞损害加重,在低剂量不同喂养时间组内,随喂养时间的延长生精细胞损害亦加重;（ 2）睾丸
组织中生精细胞凋亡：与NC组比较,用药组生精细胞凋亡显著增多（P<0.01）;在喂养1周的不同剂量组内、以及低剂量不同喂
养时间组内生精细胞凋亡间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）;（3）血清性激素水平：与NC组比较,用药组FSH、LH水平升
高,T水平下降（P<0.05）;在喂养1周的不同剂量组内、以及低剂量不同喂养时间组内性激素水平间比较,差异也有统计学意义
（P<0.05）。结论DEHP及代谢产物MEHP对幼鼠生精细胞凋亡有明显影响,且呈时间-量效依赖效应。
     

卵巢颗粒细胞体外培养体系的建立及DEHP、MEHP对其增殖功能的影响

目的：建立卵巢颗粒细胞的原代培养体系，探讨邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）及其活性中间产物邻苯二甲酸单（2-乙基）己酯（MEHP）对原代培养的卵巢颗粒细胞增殖作用的影响。方法：选用21～25日龄未成年雌性Wistar大鼠，皮下注射孕马血清（PMSG），48h后断头处死，收集卵巢颗粒细胞，在DMEM—F12培养液中培养。卵巢颗粒细胞原代培养体系建立成功后分别将不同剂量的DEHP（1μM、5μM、25μM、50μM、100μM）和MEHP（1μM、5μM、25μM、50μM、100μM）作用细胞24h及48h，以CCK-8法检测细胞增殖情况。结果：DEHP作用卵巢颗粒细胞24h时，1μM DEHP和100μM DEHP均能明显抑制卵巢颗粒细胞增殖，差异有统计学意义（P〈0．05）。DEHP作用卵巢颗粒细胞48h时，1μM DEHP和100μMDEHP均能明显促进卵巢颗粒细胞增殖，差异有统计学意义（P〈0.05）。而MEHP作用卵巢颗粒细胞24h及48h，MEHP各染毒剂量组均无统计学差异（P〉0．05）。结论：DEHP能促进卵巢颗粒细胞增殖，并且和作用时间长短有关。MEHP在观察剂量下，尚未显示有促进卵巢颗粒细胞增殖的作用。     

胰岛素样因子3在邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯诱导隐睾发生过程中的表达分析

目的：研究环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二（2-乙已基）酯（Di-（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP）作用于孕鼠后,其胎鼠睾丸组织中胰岛素样因子3（Insulin like factor3,INSL3）mRNA和蛋白质的表达情况;探讨DEHP诱发小鼠隐睾的分子机制.方法：妊娠KM小鼠随机分为3组：正常对照组、玉米油对照组和DEHP实验组.玉米油对照组和DEHP实验组自妊娠12.5d到妊娠18d分别持续经口予以玉米油和DEHP500mg/（kg.d）,正常对照组不予灌药.结果：正常对照组和玉米油对照组睾丸组织中INSL3 mRNA和蛋白质的表达均无差异（P〉0.05）;DEHP实验组INSL3 mRNA的表达量约为对照组的1/3,与对照组相比其差异具有显著性（P〈0.05）;实验组INSL3蛋白质的表达量约为对照组的1/4,与对照组相比其差异具有显著性（P〈0.05）.结论：环境内分泌干扰物DEHP下调睾丸间质细胞INSL3 mRNA和蛋白质的表达,影响睾丸引带发育,可能是DEHP诱发隐睾的分子机制之一.     

寿胎丸对邻苯二甲酸二乙酯染毒孕鼠免疫功能及氧化应激的影响

目的 探讨寿胎丸对邻苯二甲酸二乙酯（DEHP）染毒孕鼠免疫功能及氧化应激的影响。方法 将36只性成熟雌性SD大鼠随机分为对照组、模型组、中药组,每组12只。确认妊娠后,分别予对照组玉米油10 mL/kg+生理盐水10 mL/kg、模型组DEHP500 mg/kg+生理盐水10 mL/kg、中药组DEHP 500 mg/kg+寿胎丸10 mL/kg灌胃,至妊娠第19天处死孕鼠。剖腹取出胎鼠,记录各组胎鼠体质量、孕鼠活胎数、死胎数;检测血清白介素-6（IL-6）、白介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、雌二醇、孕激素水平;记录各组胎盘外观、色泽、质量情况,取胎盘组织做病理切片;检测胎盘组织中总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）水平。结果 与对照组比较,模型组大鼠孕中后期体质量增加缓慢,胎鼠质量显著降低（P<0.05）,血清IL-2、IL-6、TNF-α水平降低,雌二醇水平升高（P<0.05）,胎盘T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT水平显著降低,ROS、MDA水平显著升高（P<0.01）。与模型组比较,中药组大鼠孕中后期体质量明显增加,胎鼠质量增加（P<0.05）;血清IL-2、IL-6升高,雌二醇降低（P<0.05）,TNF-α有升高趋势（P>0.05）,胎盘T-AOC、GSH-Px、CAT水平升高,MDA值明显降低（P<0.05）,SOD升高,ROS降低（P>0.05）。孕激素各组皆无统计学差异（P>0.05）。HE染色结果显示,模型组胎盘组织海绵滋养层明显疏松杂乱,出现较多空泡。中药组胎盘组织结构完整,迷路带、海绵滋养层、巨细胞滋养层均清晰可见,各层中细胞分布均优于模型组。结论 寿胎丸可调节孕鼠免疫功能,机制可能与其拮抗DEHP的雌激素样作用,调节血清免疫因子含量有关;寿胎丸可能通过纠正DEHP引起的胎盘组织内氧化应激失衡状态,减少胎盘组织损伤,改善妊娠结局。     

5a-还原酶的表达和睾酮测定与尿道下裂的关系

目的 探讨尿道下裂患者5a-还原酶2(SRD5A2)表达和睾酮值异常.方法 选择20例轻至中度尿道下裂患儿为病例组,另选20例尿道外口正常儿童作为对照组.应用RT-PCR方法对所有样本包皮组织中SRD5A2-mRNA的表达进行检测,并结合计算机图像分析病例组和对照组的SRD5A2的含量进行比较;同时抽血查2组睾酮值.结果 所有样本中均有SRD5A2表达,尿道下裂患者和尿道外口正常儿童包皮组织中SRD5A2-mRNA表达水平相比差异没有显著性(P＞0.05).两组睾酮值均在正常范围,相比差异没有显著性(P＞0.05).结论 5a-还原酶2(SRD5A2)可能与轻至中度先天性尿道下裂的发生无关.轻至中度先天性尿道下裂睾酮合成并不受影响.