常用消毒剂对Sabin株脊髓灰质炎病毒的杀灭效果

目的  评价杀孢子剂、“84”消毒液、酸性苯酚盐、碱性苯酚盐对Sabin株脊髓灰质炎病毒的杀灭效果。方法  首先采用中和剂鉴定试验鉴定消毒剂的中和剂,然后通过悬液定量病毒杀灭试验比较4种消毒剂对Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅱ型的杀灭效果。杀灭对数值>4.0 lg半数细胞培养感染量（50% cell culture infective dose,CCID50）/ml,表示达到消毒效果。结果  中和剂鉴定结果表明,0.5% 硫代硫酸钠可有效中和杀孢子剂和“84”消毒液对病毒的杀灭作用,10%胰蛋白胨大豆肉汤培养基可有效中和酸性苯酚盐和碱性苯酚盐对病毒的杀灭作用。杀孢子剂和1.0%“84”消毒液分别与病毒作用30 min,平均杀灭对数值均>4.0 lgCCID50/ml,达到消毒效果。0.5%“84”消毒液、酸性苯酚盐、碱性苯酚盐分别与病毒作用45 min,平均杀灭对数值仍<4.0 lgCCID50/ml,没有达到预期的消毒效果。结论  杀孢子剂和氯含量较高的“84”消毒液对Sabin株脊髓灰质炎病毒的杀灭效果远大于氯含量较低的“84”消毒液以及酸性和碱性苯酚盐。     

国产与进口无血清培养基和重组胰蛋白酶规模化培养Vero细胞效果的比较

目的   比较国产物料与进口物料对Vero细胞的培养效果及消化效果,以判断国产物料VirusPro^® VP无血清培养基（serum-free medium,SFM）（干粉）和Trpzyme重组胰蛋白酶是否适用于规模化Vero细胞培养。  方法 选取国产物料VirusPro^® VP SFM（干粉）和Trpzyme作为实验组,选取进口物料粉剂VP SFM和TryPLe Select作为对照组,在T瓶、10层细胞工厂（10-layer cell factory,CF10）和CF40连续规模化生产中,对特定代次、特定传代规模分别进行独立样本t检验,比较总消化时长、细胞收获密度和细胞存活率。结果  各代次中,国产物料组与进口物料组的细胞生长状态均相似且良好。T瓶、CF10和CF40传代的独立样本t检验结果显示,虽然国产物料组的T瓶、CF10、CF40总消化时长（17.33、19.17、19.17 mm）均分别大于进口物料组（9.17、16.33、17.42 mm）,但仅T瓶总消化时长差异具有统计学意义（t=-5.58,P＜0.05）。两组间细胞收获密度及细胞存活率的差异均不具有统计学意义（P>0.05）,T瓶传代阶段的细胞收获密度（进口物料组：3.03×10⁶ ml^-1;国产物料组：3.11×10⁶ ml^-1）均高于CF10（进口物料组：1.22×10⁶ ml^-1 ;国产物料组：1.13 ×10⁶ ml^-1）和CF40（进口物料组：9.90×10⁵ ml^-1;国产物料组：8.73×10⁵ ml^-1）。结论 国产物料VirusPro^® VP SFM（干粉）、Trpzyme均符合规模化Vero细胞培养所需。     

冻干Vero细胞狂犬病纯化疫苗在120例门诊病人中的临床效果

目的:观察国产冻干非洲绿猴肾传代细胞(Vero细胞)为基质制备的狂犬病纯化疫苗临床应用的免疫效果和安全性。方法:选择门诊部就诊的犬致伤者240例,分为试验组和对照组。试验组接种冻干Vero细胞狂犬病纯化疫苗,对照组接种地鼠肾狂犬病纯化疫苗。2组人群均按照狂犬病疫苗暴露后常规免疫程序进行接种,于全程接种后15d测定中和抗体,并观察不良反应。结果:试验组抗体阳性率为96.7%,明显高于对照组的90.0%,P<0.05;不良反应发生率为10.8%,明显低于对照组的21.7%,P<0.05。结论:Vero细胞纯化疫苗抗体阳转率高、不良反应发生率低,临床应用优于地鼠肾纯化疫苗,适宜推广使用。     

疫苗生产环境用消毒剂的效果验证

目的 对疫苗生产环境中使用的4种消毒剂的消毒效果进行验证.方法 配制0.5％硫代硫酸钠+2.0％吐温80+0.2％卵磷脂复方中和剂,并对其进行鉴定.用爱尔施、洗必泰、过氧乙酸、百毒杀对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌黑色变种芽胞和白念珠菌4种标准菌株进行定量悬液杀灭试验,细菌和霉菌的杀灭对数值分别≥5.00和≥4.00判为有效.结合环境监测所获得的菌型,选取环境中的常见菌进行不锈钢板载体菌杀灭试验,细菌杀灭对数值≥3.00判为有效.结果 复方中和剂能有效中和消毒剂的杀菌作用.4种消毒剂对标准菌株的定量悬液杀灭试验均达到可接受标准,细菌杀灭对数值为5.11～8.32,霉菌杀灭对数值为4.05～7.32.环境监测所获得的环境菌主要为莱拉/藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌、人葡萄球菌和沃氏葡萄球菌.4种消毒剂对环境常见菌能起到很好的杀灭作用,杀灭对数值为4.89～6.37.结论 爱尔施、洗必泰、过氧乙酸、百毒杀4种消毒剂的消毒效果达到了验证要求,能用于疫苗生产环境消毒.     

不同培养基和胰蛋白酶对Vero细胞培养及消化效果的比较

目的 比较不同公司生产的无血清培养基对病毒性疫苗生产用Vero细胞培养效果,及基因工程胰蛋白酶的细胞消化效果,以判断是否适用。方法 实验组用VirusPro Vero-A培养基进行Vero细胞的培养,用Trpzyme消化细胞。对照组用VP-SFM培养基进行细胞培养,用TrypLE Select消化细胞。两组Vero细胞以相同密度接种在T175培养瓶中,以相同的培养条件和传代方法在T175瓶和细胞工厂中各培养3代。培养期间观察细胞的上清液、形态以及汇合度,消化后检测细胞活率并计算细胞收获量。采用配对t检验比较两组消化液的pH值、总消化时长、37 ℃消化孵育时长、细胞活率以及细胞收获量。结果 两组细胞生长状态均良好。配对t检验显示,实验组消化液的pH值（6.99）、总消化时长（17.28 min）和37 ℃消化孵育时长（6.93 min）均值均大于对照组消化液的（分别为6.75、12.34 min、3.30 min）,细胞活率（94.79%）及细胞收获量（T175瓶：3.91×10⁷个;细胞工厂：1.90×10⁹个）均值均高于对照组的（分别为90.20%、3.33×10⁷个、1.26×10⁹个）,且差异有统计学意义（t值分别为9.17、3.46、2.98、2.31和4.38,P值均<0.05）。结论 实验组无血清培养基培养效果较好,基因工程胰蛋白酶细胞消化液温和、细胞损伤小,均适用于Vero细胞。     

消毒液擦拭法对胃癌肿瘤细胞灭活作用的体外实验研究

目的探讨消毒液擦拭法对手术器械上携带胃癌细胞(NCI-N87)的灭活作用,为术中器械的灭瘤处理提供实验依据。方法选用NCI-N87胃癌细胞为研究对象,采用15%朗索皮肤黏膜消毒碘、25%朗索皮肤黏膜消毒碘、无水乙醇、灭菌注射用水分别擦拭携带胃癌细胞的血管钳5、10、15s,再培养48、72h后,通过显微镜观察细胞形态和生长情况并进行细胞计数。结果各种消毒液擦拭对比0.9%氯化钠注射液擦拭对胃癌细胞都更具有灭活作用,各组比较差异具有统计学意义(P<0.01),其中25%朗索皮肤黏膜消毒碘擦拭对胃癌肿瘤细胞的灭活作用最佳,且随着擦拭时间的延长对胃癌肿瘤细胞的灭活作用越大。结论胃癌手术中,消毒液擦拭的方法对胃癌肿瘤细胞都有灭活作用,且25%朗索皮肤黏膜消毒碘擦拭对胃癌肿瘤细胞具有显著作用。     

轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在Vero细胞上的适应性培养及免疫原性分析

目的:研究轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在Vero细胞上的适应性及其免疫原性。方法:将轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在Vero细胞上连续传代20代,进行适应培养,通过RNA-PAGE、PCR、核酸电泳、病毒滴度及小鼠免疫试验鉴定其遗传稳定性和免疫原性。结果:筛选出1株Vero细胞适应株(Ls)。该毒株在Vero细胞上稳定传代20代,具有遗传稳定性,且自第5代后病毒滴度均稳定在7.0 lgTCID50.mL-1以上。动物免疫结果表明,Vero细胞适应株Ls诱导小鼠产生高滴度的血清抗体。结论:Ls株可在Vero细胞上稳定增殖,具有遗传稳定性和良好的免疫原性。     

肠道病毒71型H6株在Vero细胞上的传代适应及理化特性

目的 研究肠道病毒71型(EV71)在Veto细胞上传代适应的可行性,为用Vero细胞制备EV71疫苗提供科学依据.方法 将EV71 H6株病毒在Veto细胞上进行3次蚀斑筛选并连续传代培养,然后检测适应株的生物学性状及稳定性.结果 经筛选后的Vero细胞适应株可被特异抗EVT1血清中和.传至第5代,病毒滴度可达8.13 LogCCID50/ml.制备毒种的适宜感染剂量(MOI)为0.01,在96 h左右收获的病毒滴度较高.理化学试验结果表明,EV71核酸类型为RNA,不具有耐热性,但可耐受乙醚、酸的作用.结论 EV71 H6株能较好的适应Vero细胞,并保持稳定的生物学性状.     

产ESBLs肺炎克雷伯菌中整合子和耐消毒剂基因的研究

目的:研究产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌整合子携带耐药基因状况及其对常用消毒剂的耐药性。方法:采用PCR方法检测77株产ESBLs和71株非产ESBLs肺炎克雷伯菌Ⅰ整合酶基因,分析Ⅰ类整合子与耐药性关系,并用耐消毒剂试验对耐消毒剂基因予以证实。结果:产ESBLs和非产ESBLs菌株中Ⅰ类整合酶扩增阳性率分别为66.2%(51/77株)和10.0%(2/20株),两者差异有统计学意义(P<0.05)。整合子阳性株对磺胺类、氨基糖苷类和环丙沙星的耐药率较高,与整合子阴性相比差异具有统计学意义(均P<0.01);耐消毒剂基因阳性株对常用消毒剂耐药能力高于阴性株。结论:Ⅰ类整合子在产ESBLs肺炎克雷伯菌中的分布明显高于非产酶株,并参与产ESBLs株多重耐药性的形成,携带耐消毒剂基因的菌株具有抗常用消毒剂的能力。     

国产与进口牛血清促进Vero细胞生长的比较

 目的  通过对国产与进口牛血清促进Vero细胞生长的比较,筛选可替代进口血清用于轮状病毒疫苗生产中Vero细胞培养的国产牛血清。方法  以国产的3批胎牛血清和1批新生牛血清为待评血清,以进口胎牛血清为对照血清,制备细胞培养液。在T175细胞培养瓶（T瓶）和2层细胞工厂中连续传代培养Vero细胞各3代,观察每一代次的培养上清液、细胞形态和细胞汇合度,计算细胞收获量和与对照血清相比较的相对增长率。采用单样本t检验对细胞收获量与生产要求的细胞产量（T瓶：>1.50×10⁷ 个/ml;细胞工厂：>3.00×10⁸ 个/ml）进行比较。根据细胞相对增长率判断国产血清与进口对照血清促细胞生长活性的相近程度。结果  国产血清培养的Vero细胞生长状态均良好。T瓶培养时,国产血清组的细胞收获量为（1.56～9.30）×10⁷ 个/ml,与生产要求细胞产量的差异有统计学意义（t=2.44～3.76,P<0.05）,且t值均>0,说明符合生产要求。细胞相对增长率接近或超过100%。细胞工厂培养时,国产血清组的细胞收获量为（1.80～4.92）×10⁸ 个/ml,与生产要求产量的差异无统计学意义（t=－0.23～1.16,P>0.05）,但是只有1批胎牛血清和新生牛血清的细胞收获量均值>3.00×10⁸ 个/ml,且细胞相对增长率>90%。 结论  经与进口牛血清比较,国产的1批胎牛血清和1批新生牛血清可替代进口血清,用于轮状病毒疫苗生产中的Vero细胞培养。     

Vero细胞在无血清条件下制备乙型脑炎灭活疫苗

目的 探索Vero细胞在无血清条件下制备乙型脑炎灭活疫苗的工艺. 方法 用无血清培养基培养Vero细胞,并将乙型脑炎病毒P3V2株毒种接种于培养的Vero细胞,观察细胞和病毒的生长情况.收获病毒液,通过灭活、纯化制备乙型脑炎灭活疫苗,检测疫苗各项指标,并与有血清培养工艺制备的疫苗(2013年生产的疫苗)进行比较.结果 无血清培养基培养的Vero细胞生长良好,培养5d的细胞呈致密单层生长.3批无血清培养工艺制备的疫苗的第1、2和3次收获液的平均病毒滴度分别为8.847、8.319和7.194 lgLD50/ml.3批无血清培养工艺制备的疫苗半成品的平均抗原含量(1.51 EU/ml)与有血清培养工艺制备的疫苗(1.41 EU/ml)相当,但前者的宿主细胞蛋白含量(19.69 μg/L)则明显低于后者(63.90 μg/L).结论 乙型脑炎病毒可在无血清Vero细胞中良好生长,Vero细胞无血清培养工艺制备乙型脑炎灭活疫苗是可行的.     

检测白喉毒素特异性细胞毒性的Vero细胞/MTT法的建立

目的 建立检测白喉毒素（diphtheria toxin,DT）特异性细胞毒性的Vero细胞/MTT法.方法 用MEM培养液对DT进行不同倍数的预稀释,用目测法确定DT的最适预稀释倍数.用建立的方法检测以最适预稀释倍数稀释的DT,以确定该法的灵敏度和细胞病变半数抑制浓度（IC50）,同时绘制剂量-反应曲线以验证该法的重复性.用建立的方法于不同pH、盐浓度或蔗糖浓度条件下检测DT,计算DT回收率以验证该法的耐用性.结果 目测法确定的DT最适预稀释倍数为106倍.建立的方法的平均检测灵敏度为（6.01±1.44）×10^-5 lf/ml DT,细胞病变半数抑制率对数值（log IC50）范围为5.02 ～ 5.82,变异系数为5.82％,该法具有较好的重复性.用建立的方法检测不同条件下的DT显示,DT的平均回收率为93.7％ ～ 110.4％,该法具有较好的耐用性.结论 Vero细胞/MTr法可用于检测DT特异性细胞毒性.     

Vero细胞洗换方式对轮状病毒活疫苗收获液的影响

目的  探讨Vero细胞洗换方式对口服六价轮状病毒活疫苗收获液的影响。方法  采用3种不同方式洗换Vero细胞后,观察相应的致细胞病变效应,使用ELISA检测洗换前后牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）残留、快速荧光灶法检测收获液病毒滴度,并测定病毒收获液浊度及粒径,比较3种洗换方式的差异。结果  使用方式1、2、3洗换后,方式1、2致细胞病变进程明显较方式3快;收获液BSA残留（均值±标准差）分别为（15.0±4.1）、（16.3±4.0）、（52.6±4.7） ng/ml,方式1、2较方式3收获液BSA残留明显下降;方式1、2、3洗换的收获液病毒滴度分别为（7.27±0.06）、（7.23±0.06）、（6.97±0.06） lg荧光灶单位/ml,方式1、2较方式3收获液病毒滴度明显上升。不同洗换方式处理后,病毒收获液浊度和粒径的差异无统计学意义。方式1、2、3处理后,病毒收获液BSA残留、病毒滴度、浊度与粒径均符合标准。结论  结合实际生产条件,滴度较高、BSA含量较低的方式1适合作为后续的大规模原液制备过程中的洗换方式。     

Non-Linear Relationships between Aflatoxin B1 Levels and the Biological Response of Monkey Kidney Vero Cells

Aflatoxin-producing fungi contaminate food and feed during pre-harvest, storage and processing periods. Once consumed, aflatoxins (AFs) accumulate in tissues, causing illnesses in animals and humans. Most human exposure to AF seems to be a result of consumption of contaminated plant and animal products. The policy of blending and dilution of grain containing higher levels of aflatoxins with uncontaminated grains for use in animal feed implicitly assumes that the deleterious effects of low levels of the toxins are linearly correlated to concentration. This assumption may not be justified, since it involves extrapolation of these nontoxic levels in feed, which are not of further concern. To develop a better understanding of the significance of low dose effects, in the present study, we developed quantitative methods for the detection of biologically active aflatoxin B₁ (AFB1) in Vero cells by two independent assays: the green fluorescent protein (GFP) assay, as a measure of protein synthesis by the cells, and the microculture tetrazolium (MTT) assay, as a measure of cell viability. The results demonstrate a non-linear dose-response relationship at the cellular level. AFB1 at low concentrations has an opposite biological effect to higher doses that inhibit protein synthesis. Additional studies showed that heat does not affect the stability of AFB1 in milk and that the Vero cell model can be used to determine the presence of bioactive AFB1 in spiked beef, lamb and turkey meat. The implication of the results for the cumulative effects of low amounts of AFB1 in numerous foods is discussed.     

Investigation of the genotoxicity of quinocetone,carbadox and olaquindox in vitro using Vero cells

Quinoxaline-1,4-dioxides derivatives have been widely used as animal growth promoter. This study was conducted to investigate the cytotoxicity and genotoxicity of quinoxaline-1,4-dioxides derivatives, namely carbadox, olaquindox and quinocetone, in Vero cells. The cell viability results from MTT assay demonstrated the severe inhibitory effects by these chemicals in both dose and time dependent manner. Among these chemicals quinocetone exhibited the highest cytotoxicity followed by olaquindox and carbadox. DNA damage analyses using alkalic comet assay revealed pronounced increase of DNA fragmentation in all three compound treated cells. In contrast, DNA damage was significantly decreased after incubation with S9 mix. These findings suggest that the intermediate metabolites of these compounds exerted lower genotoxicity than their parent drugs. We further described chromosomal damage induced by these drugs employing cytokinesis-block micronucleus assay (MN assays). The micronucleus frequency was significantly higher in these drugs treated cells than that of controls and the nuclear division index was also markedly reduced with increasing drug concentration applied. Similar to the observation in comet assay, incorporation of S9 mix in the MN assays was able to markedly alleviate the chromosome damage. In conclusion, our results strengthened previous reports on the cytotoxicity and genotoxicity of carbadox, olaquindox and quinocetone.