MTS1基因β启动子E2F1结合位点序列突变重组质粒的构建与表达

目的：深入研究MTS1基因β启动子的转录激活与E2F1转录因子的相互作用关系，阐明该转录水平的调控机制。方法：用PCR定点突变方法或酶切连接法，构建β启动子0.38kb SacⅡ-Sac I酶切片段中E2F1 A，B，C任意2个位点或3个位点均突变的pGL3重组质粒。用脂质体介导的基因瞬时转染法，将构建的重组质粒转染MTS1基因双等位缺失的急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞，检测pGL3重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：构建的E2F1 A，B，C结合位点突变的重组质粒经Sac I或Nae I酶切鉴定和DNA序列分析得到证实。与E2F1位点野生型重组质粒比较，突变型重组质粒在Jurkat细胞中荧光素酶报告基因的表达量减少，以3个位点均突变的重组质粒为明显。结论：构建的E2F1 A，B，C2个或3个结合位点均突变重组质粒成功，可通过基因转染用于研究MTS1基因的功能试验中；MTS1基因β启动子的转录活性可能与E2F1转录因子的反式激活有关。     

MLAA-22基因上游调控区的分离及启动子活性分析

目的:分离MLAA-22 基因上游转录调控区序列，进行启动子活性鉴定。方法:人工合成MLAA-22 基因上游转录调控区序列MLAA-22（-999～+1)和MLAA-22（-1999～+1)两个区段，将两个区段插入到双荧光素酶报告基因表达载体psiCHECK-2的BglⅡ/NheI限制性内切酶位点中，构建双荧光素酶报告基因表达质粒，将重组质粒分别命名为psiCHECK-2-MLAA-22（-999～+1)和psiCHECK-2-MLAA-22（-1999～+1）；采用双荧光素酶报告基因系统检测所分离区段的启动子活性。结果:MLAA-22（-999～+1)和MLAA-22（-1999～+1）两个区段均具有较强的相对荧光素酶活性，并且MLAA-22（-999～+1)区段的相对荧光素酶活性明显高于MLAA-22（-1999～+1）区段。结论:MLAA-22 基因上游转录调控区（-999～+1）区段将是今后我们进行MLAA-22 基因上游转录调控区启动子活性研究的重点区域。     

HIF-1α调控Snail基因启动子活性及作用位点的鉴定

摘 要： ［目的］ 探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对Snail启动子活性的作用,并鉴定其作用位点。［方法］ 应用transfac软件分析Snail启动子区域潜在的HIF-1α结合位点。通过荧光素酶报告基因载体、电泳迁移率实验（EMSA）和染色质免疫沉淀（ChIP）实验研究HIF-1α是否能够与Snail启动子区域潜在的位点结合,直接调控Snail的表达。［结果］ 生物信息学分析发现Snail启动子区域存在2个HIF-1α可能的结合位点（-653,-649）和（-543,-538）。双荧光素酶报告基因检测发现（-543,-538）位点是HIF-1α特异性结合于Snail的位点,HIF-1α蛋白与之结合后调节Snail基因转录活性。EMSA和ChIP实验证实了HIF-1α蛋白和Snail启动子区（-543,-538）结合,直接上调Snail的表达。［结论］ Snail启动子区域存在HIF-1α的结合位点,HIF-1α与之结合后直接调控Snail的表达。     

SNHG17通过与转录因子E2F1结合激活CENPE促进肾透明细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的:探讨SNHG17通过与转录因子E2F1结合激活CENPE对肾透明细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:生信分析SNHG17、E2F1和CENPE在肾透明细胞癌肿瘤组织中的表达,生信分析三者的调控关系。qRT-PCR检测SNHG17、E2F1和CENPE的mRNA水平。Western blot检测E2F1和CENPE的蛋白表达。CCK-8、Transwell实验分别检测细胞增殖、迁移和侵袭情况。RIP实验验证SNHG17与E2F1的结合关系;ChIP实验检测E2F1与CENPE的结合关系。构建异种瘤模型验证SNHG17对肾透明细胞癌生长的影响。结果:SNHG17和CENPE在肾透明细胞癌组织和细胞系中的表达水平均显著上调。沉默SNHG17转染肾透明细胞后,癌细胞的增殖、迁移和侵袭受到明显抑制。体内实验也验证了沉默SNHG17抑制肾透明细胞癌的生长。此外,RIP实验显示SNHG17能够与转录因子E2F1结合。ChIP实验检测转录因子E2F1与CENPE启动子区的结合,结果表明E2F1能够显著富集在CENPE的启动子区。体外功能实验表明SNHG17通过招募E2F1激活CENPE表达从...     

转录因子Runx1对RPL4启动子的调节作用

摘　要　目的:儿童白血病细胞全基因组芯片数据聚类分析发现，核糖体蛋白L4（ribosomal protein L4, RPL4）启动子区域具有转录因子Runx1的结合位点TTCATTCT，由此推测Runx1可能与该基因启动子之间存在调控作用。 本研究通过观察Runx1蛋白与RPL4启动子之间的相互作用，了解Runx1对RPL4启动子转录活性的影响，探讨其在儿童白血病发生机制中的意义。方法：构建含RPL4启动子及其突变体的荧光素酶报告质粒，与Runx1的表达质粒共转染293T细胞，进行荧光素酶活性分析。结果：Runx1蛋白可使RPL4启动子的转录活性降低（P<0.01）；随着Runx1剂量的增加，RPL4启动子的转录水平呈剂量依赖性降低（P<0.01）；Runx1蛋白对RPL4启动子的突变体转录活性无调控作用（P>0.05）。结论：Runx1蛋白对RPL4启动子具有转录抑制作用，且具有明显的剂量依赖性；Runx1蛋白通过结合RPL4启动子区域的TTCATTCT位点发挥调控作用。     

HeLa细胞ezrin基因基本启动子区转录调控元件的鉴定

 目的 鉴定HeLa细胞中调控ezrin基因基本启动子活性的顺式作用元件,探讨ezrin基因在HeLa细胞的表达调控机制。 方法 采用碱基定点突变实验和双荧光素酶报告基因分析系统,检测在HeLa细胞中Sp1结合位点(-75/-69, 相对于转录起始位点)和AP 1结合位点(-64/-58)对人ezrin基因基本启动子活性的影响;采用电泳迁移率变动分析法(EMSA)实验,检测ezrin基因基本启动子区序列与HeLa细胞核蛋白提取物的特异性结合活性。 结果 在HeLa细胞中,单独删除和置换Sp1结合位点或AP 1结合位点,ezrin基因基本启动子活性降低50％左右;同时置换Sp1结合位点和AP 1结合位点,启动子活性几乎完全丧失。ezrin基因基本启动子序列能够与HeLa细胞核蛋白提取物相结合。 结论 HeLa细胞中,Sp1结合位点和AP 1结合位点为ezrin基因基本启动子区的重要转录调控元件,有可能存在某种转录因子与之结合,激活ezrin基因转录。     

E2F1对 TFDP3 表达的调控及其对前列腺癌PC3细胞凋亡的影响

目的：构建含TFDP3基因启动子和荧光素酶报告基因的重组载体pGL3-TFDP3-promoter,观察E2F1对TFDP3转录及表达的调控作用以及TFDP3对E2F1诱导肿瘤细胞凋亡的影响。方法：以人前列腺癌PC3细胞系基因组DNA为模板,PCR扩增TFDP3启动子序列并克隆入荧光素酶报告基因载体,与E2F1表达载体pCMV-E2F1-HA瞬时单独或共同转染PC3细胞,测定荧光素酶活性以观察E2F1对TFDP3启动子的调控作用,Western blotting检测pCMV-E2F1-HA转染对PC3细胞内TFDP3表达的影响,流式细胞术检测TFDP3与E2F1相互作用对前列腺癌细胞凋亡的影响。结果：成功构建TFDP3基因启动子重组质粒pGL3-TFDP3-promoter,与E2F1表达载体pCMV-E2F1-HA共转染PC3细胞后,TFDP3启动子诱导的荧光素酶活性较单独转染pGL3-TFDP3-promoter显著升高[（1.14±0.06）vs（0.61±0.05）, P<0.05]。转染pCMV-E2F1-HA的PC3细胞的TFDP3蛋白表达是未转染细胞的2.7倍[（0.24±0.03）vs（0.09±0.02）, P<0.05]。pCMV-E2F1-HA转染后PC3细胞凋亡率较未转染组显著上升[（7.10±0.003）% vs（2.66±0.001)%,P<0.05],而pCMV-E2F1-HA与pcDNA3.1-TFDP3共转染后细胞凋亡率较pCMV-E2F1-HA组显著下降[（4.92±0.002）% vs（7.10±0.003）%,P<0.05]。结论：E2F1可增强TFDP3启动子的活性,增加TFDP3蛋白的表达,其可能通过此机制抑制E2F1诱导的前列腺癌细胞凋亡。     

不同截短型癌基因AEG-1启动子活性分析

目的:分析不同截短型癌基因AEG-1启动子活性,证实与E6/E7表达相关的转录调控因子对AEG-1启动子活性的影响。方法:以宫颈癌HeLa细胞基因组DNA为模版,扩增AEG-1启动子全长序列（-2710/-491）,并应用本实验室改造的启动子活性研究专用绿色荧光蛋白报告载体构建pGL3-basic-EGFP/AEG-1质粒,通过转染HeLa细胞及血管内皮细胞ECV304检测启动子活性。同时,根据AEG-1启动子序列上与E6/E7作用相关的转录调控因子结合位点位置,设计不同截短型AEG-1启动子序列引物,应用pGL3-basic-EGFP载体构建不同截短型AEG-1启动子载体,并分别转染细胞检测启动子活性。结果:AEG-1启动子全长序列pGL3-basic-EGFP/AEG-1载体转染HeLa细胞可见明显绿色荧光蛋白表达,而在血管内皮细胞ECV304中表达为痕量。包含不同转录调控因子C-Myc、SP1、NF-κB、E2F结合位点的不同截短型AEG-1启动子载体在肿瘤细胞中有活性但存在差异。结论:AEG-1启动子为肿瘤特异性启动子,含有与E6/E7表达相关的转录调控因子NF-κB、E2F结合位点的启动子序列为影响AEG-1基因启动子活性的关键区域。     

FOXJ2转录激活胃癌细胞PD-L1表达并抑制T细胞抗肿瘤免疫的研究

摘 要：［目的］ 研究免疫检查点PD-L1在胃癌细胞中的转录调控机制;探讨转录因子FOXJ2对PD-L1的转录调控,两者表达的相关性及其与胃癌患者预后的关系;揭示FOXJ2在调控T细胞抗肿瘤免疫中发挥的生物学功能。［方法］ 利用生物信息学方法筛选能够调控PD-L1的转录因子;免疫组化及免疫荧光检测FOXJ2和PD-L1在胃癌临床标本中的表达以及FOXJ2与CD8+ T细胞浸润的关系;qRT-PCR与Western blot检测FOXJ2和PD-L1在胃癌细胞中的表达;ChIP实验验证FOXJ2与PD-L1基因启动子的直接相互作用;胃癌细胞与T细胞共培养实验检测T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力;流式细胞术检测肿瘤细胞中PD-L1表达情况及T细胞中TNF-α和IFN-γ的表达情况。［结果］ JASPAR和PROMO数据库筛选出24个可能调控PD-L1的候选转录因子;癌症公共数据库显示FOXJ2与PD-L1的表达呈正相关（P<0.05）,高表达FOXJ2的胃癌患者生存期明显缩短（P<0.01）。FOXJ2在胃癌组织中的表达较癌旁组织显著上调,且与PD-L1的表达呈正相关关系（R=0.629,P<0.01）。qRT-PCR与Western blot证实胃癌细胞中敲低FOXJ2表达后PD-L1表达下降。ChIP实验证实FOXJ2与PD-L1基因启动子区域的直接相互作用。下调胃癌细胞中FOXJ2表达后,T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力增强;流式细胞术显示肿瘤细胞中的PD-L1下降,而T细胞中TNF-α和IFN-γ的表达升高。［结论］ FOXJ2与PD-L1表达和胃癌患者的生存密切相关,阻断FOXJ2对PD-L1的转录调控有望成为胃癌免疫治疗的新靶点。     

E2F转录因子与肿瘤基因治疗

E2F转录因子与细胞增殖、凋亡及癌变密切相关.各种与E2F转录因子相关的肿瘤基因治疗已在动物实验中取得良好效果.早期基因1A区的2保守区(E1A-CR2)缺失和携带E2F1启动子的增殖型腺病毒载体,可选择性在多种肿瘤细胞中增殖,其增殖能力甚至超过了野生腺病毒,是非常有潜力的肿瘤基因治疗手段.现对E2F转录因子在细胞周期调控、凋亡、肿瘤发生及相关肿瘤基因治疗等方面的研究作一综述.     

miR-34a通过靶基因Notch1调控子宫内膜癌细胞的增殖和凋亡

目的:探讨miR-34a通过靶基因Notch1调控子宫内膜癌细胞的增殖和凋亡。方法:通过荧光定量PCR检测miR-34a在子宫内膜癌和癌旁组织中的表达,并通过双荧光素酶报告基因检测miR-34a的靶基因,子宫内膜癌Ishikawa细胞转染miR-34a mimics及对照miR-NC,并转染Notch表达载体,通过MTT和流式细胞术分别检测miR-34a和Notch1对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响,并通过Western blot检测miR-34a对Notch1蛋白表达的影响。结果:miR-34a在人子宫内膜癌组织中表达显著下调（P<0.05）,双荧光素酶报告基因实验证实miR-34a能与Notch1 3' UTR结合,miR-34a mimics能够显著抑制细胞活力（P<0.05）,促进细胞凋亡（P<0.05）,并且miR-34a mimics显著抑制Notch1蛋白表达（P<0.05）。结论:miR-34a能够通过调控靶基因Notch1的表达,抑制子宫内膜癌细胞的增殖,促进细胞凋亡。     

ETS2在乳腺癌细胞中调控CXCR4转录的机制研究

背景与目的：肿瘤转移是乳腺癌患者死亡的主要原因。趋化因子受体CXCR4与乳腺癌转移密切相关。本研究探讨转录因子ETS2(人红血细胞增多症病毒致癌基因同源体2)对人乳腺癌细胞中趋化因子受体CXCR4表达的影响,以及ETS2调控CXCR4转录的分子机制。方法：在MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌细胞株中,本研究通过瞬时转染技术,以及RNAi技术,检测过表达ETS2或抑制ETS2的表达。然后分别应用RT-PCR以及ELISA检测CXCR4 mRNA的表达和蛋白水平,荧光酶素报告基因实验检测启动子活性,ChIP实验检测结合到CXCR4启动子上的ETS2的量。并且对CXCR4启动子上的2个ETS结合位点进行突变,通过荧光报告基因实验,检测突变对CXCR4启动子活性的影响。结果：转染了ETS2过表达质粒的MDA-MB-231和MCF-7人乳腺癌细胞中,CXCR4的表达在mRNA和蛋白水平都升高;报告基因实验结果提示,ETS2通过激活CXCR4启动子的活性提高CXCR4的表达;通过ChIP实验发现,在转染了ETS2表达质粒的MDA-MB-231和MCF-7人乳腺癌细胞中,结合到CXCR4启动子上的ETS2的蛋白量増高,提示ETS2通过直接结合到CXCR4启动子上,从而提高CXCR4启动子的活性;利用RNA干扰技术,抑制ETS2的表达,可以显著减弱CXCR4启动子的活性,降低CXCR4的表达和结合到CXCR4启动子上的ETS2的量;荧光酶素报告基因的结果显示,任意一个位点的突变都降低了CXCR4启动子的活性,2个位点的同时突变使CXCR4启动子的活性进一步降低。结论：在人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231细胞中,ETS2通过直接结合到CXCR4启动子上的2个结合位点(-540到-535和-240到-235),活化CXCR4启动子活性,从而对CXCR4发挥转录调控的作用。     

人急性单核细胞白血病相关抗原22RNA干扰序列的筛选及鉴定

目的筛选获得急性单核细胞白血病相关抗原22（MLAA-22）最佳RNA干扰序列,为后期MLAA-22功能研究奠定基础。方法采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）克隆MLAA-22蛋白质编码区序列（CDS）,将测序正确的MLAA-22CDS插入pEGFP-N1-3FLAG载体,构建真核pEGFP-N1-3FLAG表达载体,同时构建4个MLAA-22靶向RNA干扰载体,共转染293T细胞后通过细胞荧光强度分析及蛋白印迹法筛选最佳MLAA-22RNA干扰序列。结果成功构建了MIJAA-22真核pEGFP-N1-3FLAG表达载体,同时构建了4个RNA干扰载体,共转染293T细胞后筛选获得KD2为最佳干扰序列。结论KD2是靶向MLAA-22抗原基因的最佳RNA干扰序列。