甲醛溶液对Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活效果研究

 目的  验证4%甲醛溶液使Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎（脊灰）病毒达到预期灭活效果所需要的时间。方法  用4%甲醛溶液对15批Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒在(36.5±1) ℃ 环境进行灭活,同时以15批未加入4%甲醛溶液的病毒纯化液作为对照组,按照企业注册标准采用微量细胞病变法测定病毒滴度。为了消除4%甲醛溶液对Hep-2细胞的影响,取4%甲醛溶液接种Hep-2细胞作为实验组,同时设置Hep-2细胞为对照组,每天观察对比两组细胞形态。对同一个Hep-2细胞悬液的总细胞数和活细胞数采用传统手工计数和全自动细胞计数仪计数,并比较分析结果。结果  实验组随着灭活时间的延长病毒滴度呈下降趋势,在灭活到第4天起,3个型别样品均检测不到病毒滴度;对照组病毒滴度在每毫升9.1～10.6 lg半数细胞培养物感染量范围内,符合企业注册标准的要求。4%甲醛溶液对Hep-2细胞生长有抑制作用,在培养观察到第3天时细胞全部失去活力死亡;对照组细胞形态良好呈多边形长成致密单层,活细胞组t值为18.098,总细胞组t值为4.005,P值均＜0.05,差异有统计学意义。结论  脊灰病毒在第4天能被彻底灭活,在进行此实验时应先消除甲醛对细胞培养的影响,避免结果出现假病变现象,确保结果的准确性;应用全自动细胞计数能提高计数结果的精确度。     

Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活疫苗的制备及免疫原性评价

目的:建立Sabin株毒种制备脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliovirus vaccine, IPV)生产工艺并评价其免疫原性。方法:采用Vero细胞培养Sabin株脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒,制备3价Sabin株IPV(Sabin strain IPV, sIPV)。通过ELISA检测D抗原含量。...     

疫苗生产环境用消毒剂的效果验证

目的 对疫苗生产环境中使用的4种消毒剂的消毒效果进行验证.方法 配制0.5％硫代硫酸钠+2.0％吐温80+0.2％卵磷脂复方中和剂,并对其进行鉴定.用爱尔施、洗必泰、过氧乙酸、百毒杀对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌黑色变种芽胞和白念珠菌4种标准菌株进行定量悬液杀灭试验,细菌和霉菌的杀灭对数值分别≥5.00和≥4.00判为有效.结合环境监测所获得的菌型,选取环境中的常见菌进行不锈钢板载体菌杀灭试验,细菌杀灭对数值≥3.00判为有效.结果 复方中和剂能有效中和消毒剂的杀菌作用.4种消毒剂对标准菌株的定量悬液杀灭试验均达到可接受标准,细菌杀灭对数值为5.11～8.32,霉菌杀灭对数值为4.05～7.32.环境监测所获得的环境菌主要为莱拉/藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌、人葡萄球菌和沃氏葡萄球菌.4种消毒剂对环境常见菌能起到很好的杀灭作用,杀灭对数值为4.89～6.37.结论 爱尔施、洗必泰、过氧乙酸、百毒杀4种消毒剂的消毒效果达到了验证要求,能用于疫苗生产环境消毒.     

Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化的离子交换层析条件研究

目的  研究Sabin株脊髓灰质炎病毒（Sabin strain polio virus,sPV）纯化的离子交换层析（ion exchange chromatography,IEC）条件。 方法  在不同层析条件下对sPV凝胶层析粗纯液进行IEC,设定的层析参数分别为介质Q Sepharose FF或Eshmuno Q、上样量30%或40%柱体积、流速（150±5）或（240±8） cm/h。分别检测各型sPV纯化液的D抗原含量、蛋白浓度、病毒滴度、宿主细胞蛋白残留量和Vero细胞DNA残留量,计算D抗原回收率和比活。结果  Eshmuno Q IEC纯化的各型sPV纯化液的D抗原回收率均明显高于Q Sepharose FF IEC。在上样量40% 柱体积、流速（150±5） cm/h条件下,Eshmuno Q IEC纯化的各型sPV纯化液的D抗原比活均高于Q Sepharose FF IEC,差异均有统计学意义（Ⅰ型：t=4.23,Ⅱ型：t=5.73,Ⅲ型：t=4.18,P值均<0.05）,而且前者的宿主细胞蛋白残留量（Ⅰ型：t=8.29,Ⅱ型：t=7.89,Ⅲ型：t=8.18,P值均<0.05）和Vero细胞DNA残留量（Ⅰ型：t=4.23,Ⅱ型：t=4.56,Ⅲ型：t=4.78,P值均<0.05）均低于后者,差异均有统计学意义。结论  用IEC纯化sPV进行纯化时,以Eshmuno Q代替Q Sepharose FF可增加上样量和流速,从而缩短IEC时间,提高纯化效率。     

洁净区消毒剂消毒方式研究

目的:确认洁净区使用消毒剂的消毒方式,保证对洁净区的有效消毒。方法:选取新洁尔灭和过氧乙酸对洁净区进行消毒,取样检测微生物限度并检测消毒剂残留,考察消毒面积、接触的不同材质、消毒剂作用时间对消毒效果的影响。结果:采用任一种消毒剂,每4平方米更换1次完全浸湿消毒剂的无尘抹布,消毒剂与待消毒界面接触5 min后,微生物消杀...     

两种方法对Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒神经毒力的共同评价

目的 研究PCR和限制性内切酶分析突变（mutant analysis by PCR and restriction enzyme cleavage,MAPREC）技术和猴体神经毒力试验（monkey neurovirulence test,MNVT）评价同一批Ⅰ型Sabin株脊灰病毒神经毒力的结果差异。方法 采用MAPREC技术,检测Ⅰ型Sabin株脊灰病毒神经毒力关键位点480和525位点突变率;采用MNVT病理切片分析,评价Ⅰ型Sabin株脊灰病毒神经毒力。结果 MAPREC检测待测样品核酸480和525位点突变率均值为0.460%,低于高突变参考品的1.288%。MNVT切片结果分析表明,有效猴病变分值差合格。结论 对同一批样品,MAPREC与MNVT分析结果一致。     

3种中和剂对常用消毒剂在Vero细胞上的中和效果

 目的  研究0.5%硫代硫酸钠、10%胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth， TSB）培养基、10%Letheen肉汤培养基对实验室常用的4种消毒剂的中和效果，为疫苗生产和检定中科学选择中和剂提供依据。 方法  取生长良好的Vero细胞接种于96孔培养板，每组8个复孔，置于37 ℃、5% CO2培养过夜。将3种中和剂分别与杀孢子剂、0.5%“84”消毒液、酸性苯酸盐、碱性苯酚盐4种消毒剂中和后，接种于单层生长的Vero细胞，显微镜下观察细胞生长情况。结果  0.5%硫代硫酸钠分别与杀孢子剂、0.5%“84”消毒液中和后接种细胞，8孔细胞全部存活；而0.5%硫代硫酸钠分别与酸性苯酚盐和碱性苯酚盐的中和产物接种细胞后，细胞全部死亡。10% TSB培养基分别与酸性苯酚盐、碱性苯酚盐中和后接种细胞，8孔细胞全部存活；而10% TSB培养基分别与杀孢子剂和0.5%“84”消毒液的中和产物接种细胞后，细胞全部死亡。10%Letheen肉汤培养基接种细胞后，8个孔细胞全部死亡。结论  0.5%硫代硫酸钠可中和杀孢子剂和0.5%“84”消毒液的消毒作用，10%TSB培养基可中和酸性苯酚盐和碱性苯酚盐的消毒作用。10%Letheen肉汤培养对Vero细胞有毒性作用。     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗宿主细胞DNA残留量检测方法研究

目的 建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留量的检测方法.方法 提取Vero细胞基因组DNA,制备地高辛标记探针.比较样品不同处理方式的检测差异.对建立的残留DNA检测方法进行特异性、灵敏度和稳定性验证.结果 Vero细胞基因组DNA的质量浓度为295 μg/ml,260nm与280nm波长处的吸光度比值为1.88.探针灵敏度达到0.01 pg/μl.采用苯酚抽提方式处理DNA参考品,检测灵敏度为1 ng;而用碘化钠处理DNA参考品,灵敏度达到10 pg.特异性检测表明,探针与非同源DNA无杂交.灵敏度和稳定性检测结果显示,探针于-70℃保存9个月,灵敏度仍为10 pg.结论 建立了Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留量的检测方法.采用碘化钠提取DNA,回收率高,操作简单,适用于Vero细胞的残留DNA检测.     

复合季铵盐新型手部消毒剂使用效果

目的为改善社区卫生服务中心医务人员手卫生消毒状况不理想导致的交叉感染,选择一种高效手部消毒方法,比较复合季铵盐、0.1%醋酸氯已定及75%乙醇3种消毒剂对社区医护人员手部消毒情况的临床疗效。方法选取2014年8月至2015年4月抽样调查的120例社区门诊及住院部医护人员,按随机数字表法分成三组:复合季铵盐组、0.1%醋酸氯已定组和75%乙醇组,每组40例。消毒前后均取样进行细菌培养,并得出菌落培养优势菌群及各消毒剂对不同细菌的有效率。手部消毒后随访观察不良反应,进行刺激性评价。对三组结果进行对比分析。结果消毒表面细菌培养结果以大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌为主。复合季铵盐组的消毒有效率(90.63%)高于0.1%醋酸氯已定组(78.13%)和75%乙醇组(71.42%),差异均有统计学意义(P<0.05)。120例患者随访观察期间均未见与消毒剂使用相关不良反应。结论进行手部消毒时使用复合季铵盐消毒剂比其他传统的消毒剂清除致病菌更有效,对于手皮肤表面的耐药菌可能有更好的消毒效果。     

脊髓灰质炎疫苗衍生病毒循环的现状

本文介绍了脊髓灰质炎疫苗衍生病毒(VDPV)循环和引起脊髓灰质炎爆发的情况，循环VDPV(cVDPV)出现和传播的危险因素，cVDPV分离株的特性及实验室监测，cVDPV对全球消灭脊髓灰质炎策略的影响。     

植物药消毒剂对产科母婴病房消毒效果观察研究

目的观察植物药消毒剂对医院产科母婴病房空间消毒效果。方法选择医院产科母婴病房一间,逢单日用紫外线照射灭菌法进行空间消毒,逢双日用植物药消毒剂喷雾进行空间消毒,消毒前30min及消毒后60min、240min各取样一次,进行空气微生物培养,对照比较空间消毒效果。结果消毒后60min植物药消毒剂细菌杀灭率91.83%,紫外线照射灭菌法细菌杀灭率80.10%,结果差异有统计学意义（P〈0.05）。结论植物药消毒剂空间杀菌效果优于紫外线照射灭菌法,效果理想。     

不同方法配制的DTaP-sIPV中sIPV的免疫原性研究

目的 对采用不同配制方式制备的,含不同剂量Sabin株脊髓灰质炎(脊灰)灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovirus vaccine,sIPV)的DTaP-sIPV联合疫苗中sIPV的免疫原性进行研究.方法 按照2种不同方式配制含高、低剂量sIPV的DTaP-sIPV联合疫苗.将70只大鼠按简单随机法分成7组,分别为F1H(DTaP-sIPV高剂量组,配制方式1)、F2H(DTaP-sIPV高剂量组,配制方式2)、sIPV-H(sIPV高剂量组)、F1L(DTaP-sIPV低剂量组,配制方式1)、F2L (DTaP-sIPV低剂量组,配制方式2)、sIPV-L(sIPV低剂量组)、赛诺菲巴斯德五联疫苗潘太欣对照组.每组10只大鼠,间隔3周双侧后腿肌内注射,0.5 ml/只,共免疫3针.于第0、3、6、9、13、17、21、25周眼眶采血、分离血清,采用微量细胞病变效应抑制法分别测定血清中抗I、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒中和抗体滴度,并进行多样本均数方差分析.结果 每针免疫后,各组抗各型中和抗体滴度均持续上升,第9周均达到最高水平,第13周开始显著下降,至第25周仍维持在一定水平.3针免疫完成后3周,F2H组的抗Ⅰ型脊灰病毒中和抗体几何平均滴度显著高于潘太欣组(F=0.988,P=0.027);抗Ⅱ型中和抗体,F2H组显著高于F1H组,sIPV-H组显著高于F1H和潘太欣组(F=2.391,P值均＜0.05);抗Ⅲ型中和抗体,各组间差异均无统计学意义.3针基础免疫后各时间点F2H组抗各型中和抗体滴度均为最高,但除第9周其抗Ⅱ型中和抗体显著高于F1H组外,其他差异均无统计学意义.结论 DTaP-sIPV联合疫苗免疫大鼠后可以诱导产生抗各型脊灰病毒中和抗体,且其滴度和持续时间均优于或等同于潘太欣组.DTaP-sIPV诱导的中和抗体滴度不低于相应剂量的sIPV.虽然配制方式2可能更佳,但2种配制方式间sIPV的免疫原性差异无统计学意义.     

白喉-破伤风-无细胞百日咳-脊髓灰质炎灭活疫苗的临床免疫原性研究进展(续)

目前,国内许多疫苗生产厂家都在致力于研制以白喉-破伤风-无细胞组分百日咳疫苗（diphtheria,tetanus,acelluar component pertussis vaccine,DTacP）为基础的联合疫苗,而国外不同厂家该类联合疫苗在临床试验中的免疫后抗体检测方法和保护性评判标准有较大差异。此文旨在通过比较不同DTacP-灭活脊髓灰质炎疫苗的临床免疫原性结果,包括血清保护率/血清阳转率和不同方法测定的抗体几何平均滴度,为临床试验方案设计提供依据和思路。     

测定脊髓灰质炎病毒滴度的结晶紫染色法的建立及验证

目的 建立测定脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)滴度的结晶紫染色法,并对该法进行验证。方法 基于PV的半数细胞培养感染量(50% cell culture infective dose,CCID50),用结晶紫染色和酶标仪确定PV的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),并验证该法的准确度、精密度、线性范围和耐用性。分别采用建立的结晶紫染色法和传统的显微镜观察法测定66批口服Ⅰ型Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗的病毒滴度,通过Pearson相关分析评价2种检测方法的相关性。将细胞板浸泡液盲传3代,观察培养物的CPE,并通过逆转录PCR确定病毒灭活情况。结果 用建立的方法测定理论滴度8.00、6.00和4.00 lgCCID50/ml的PV样品,回收率为98%~104%。细胞板内和板间测定结果的变异系数(coefficient of variation,CV)为0%~7.85%,同一工作日和不同工作日测定结果的CV分别不超过6.44%和5.27%,不同实验人员测定结果的CV不超过5.10%。该法测定PV滴度的线性范围为2.00~8.00 lgCCID50/ml。该法具有较好的耐用性,以不同细胞浓度(F=1.624,P=0.215)或不同培养时间(F=2.731,P=0.055)培养对PV滴度的测定结果没有影响。该法与显微镜观察法的检测结果具有相关性,Pearson相关系数0.918。实验用细胞板的浸泡液在Hep-2细胞上盲传3代后,培养物未观察到CPE,逆转录PCR测定结果为阴性。结论 建立的结晶紫染色法具有较好的安全性、准确度、精密度和耐用性,适用于口服脊髓灰质炎减毒活疫苗的病毒滴度测定。