下调CACNA2D1对胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR药物敏感性的影响

目的:探讨下调CACNA2D1对胃癌耐药性细胞系SGC7901/ADR耐药的影响。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)的方法检测16对胃癌及癌旁组织以及胃癌细胞系SGC7901和SGC7901/ADR中的CACNA2D1 的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹技术（Western blot）检测CACNA2D1的蛋白表达情况;MTT法检测SGC7901、SGC7901/ADR及转染CACNA2D1 siRNA后SGC7901/ADR的IC50值;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:qRT-PCR结果显示:CACNA2D1在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.01);CACNA2D1在耐药细胞系SGC7901/ADR中的表达明显高于其亲本细胞系SGC7901(P＜0.01)。蛋白免疫印迹技术结果显示相对于转染CACNA2D1 negative control（NC）组,转染CACNA2D1 siRNA组的胃癌细胞CACNA2D1表达降低;MTT结果显示细胞系SGC7901与SGC7901/ADR的阿霉素半数抑制浓度（IC50）分别为（1.3±0.6）μg/ml与（5.5±0.45）μg/ml;SGC7901/ADR转染CACNA2D1 siRNA后对阿霉素的IC50明显下降。流式细胞术检测凋亡结果显示,CACNA2D1的表达下调后,SGC7901/ADR细胞的凋亡比明显增加。 结论:CACNA2D1能够促进胃癌SGC7901/ADR细胞系产生多药耐药。     

MicroRNA let - 7f 对胃癌细胞株 SGC7901 / ADR 耐药性的影响

目的：通过检测胃癌细胞株SGC7901及其阿霉素耐药细胞株SGC7901/ADR中microRNA let-7f的表达差异,探讨let-7f表达与胃癌细胞对ADR耐药的关系.方法：通过实时荧光定量PCR比较SGC7901/ADR与SGC7901两种细胞中 let-7f表达水平的差异;MTT法检测SGC7901,SGC7901/ADR及转染let-7f mimic后SGC7901/ADR的药物敏感性;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western Blot检测凋亡相关分子Bcl-2和Caspase-3蛋白表达情况.结果：qRT-PCR结果显示,let-7f在SGC7901/ADR细胞中的表达较在SGC7901中的表达显著降低（ P＜0.05）.MTT法结果显示SGC7901与SGC7901/ADR两种细胞阿霉素的半数抑制浓度（IC50）分别为（0.95 ±0.08）g/L和（5.40 ±0.28）g/L.SGC7901/ADR细胞转染let-7f mimic后,let-7f表达显著上调,并且对阿霉素的IC50明显降低（ P＜0.05）.凋亡检测结果显示,转染let-7f mimic后,SGC7901/ADR细胞凋亡率明显增加（ P＜0.05）.Western Blot结果表明相较于转染let-7f negative control（NC）组,转染let-7f mimic组cleaved-Caspase-3表达显著降低（P＜0.05）,而两组中的Bcl-2表达水平无差异.结论：let-7f在胃癌阿霉素耐药细胞株SGC7901/ADR中的表达显著降低,逆转let-7f表达可增加其对阿霉素敏感性,并诱导其凋亡.     

下调RPL23对胃癌耐药细胞SGC7901/ADR药物敏感性的影响

目的:检测人胃癌细胞系SGC7901及其阿霉素（ADR）耐药细胞系SGC7901/ADR中RPL23的表达差异,探讨胃癌细胞中RPL23表达对ADR耐药的影响。方法:qPCR检测RPL23在SGC7901/ADR与SGC7901两种细胞系中的表达差异;MTT法检测下调RPL23后SGC7901/ADR细胞对ADR的敏感性;流式细胞仪检测下调RPL23后对细胞凋亡的影响;Western Blot检测凋亡相关分子Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达。结果:qPCR结果显示,RPL23在 SGC7901/ADR细胞系中的表达高于其在SGC7901细胞系中的表达(P＜0.001)。MTT法结果显示,下调RPL23后,在SGC7901/ADR细胞系中ADR的IC50明显升高(P＜0.001)。凋亡检测结果显示,下调RPL23后,SGC7901/ADR细胞凋亡率明显增加(P＜0.001)。Western Blot结果显示,下调RPL23后,细胞中Caspase-3表达明显升高,Bcl-2表达明显降低。结论:RPL23在SGC7901/ADR中的表达高于SGC7901细胞,下调RPL23表达可提高其对ADR的敏感性并促进细胞凋亡,提示RPL23可能通过作用于Bcl-2调节细胞凋亡。     

KLF8在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药中的作用

目的:探讨KLF8（Kruppel-like factor 8）在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药表型中的作用。方法:利用Western blot和实时定量PCR的方法检测三株胃癌细胞系MKN28、MKN45、SGC7901在常氧及缺氧条件下KLF8的表达水平。Western blot和实时定量PCR检测胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR、SGC7901/ADR和亲本细胞系SGC7901中KLF8的表达水平。构建KLF8正义表达载体及KLF8小干扰RNA的慢病毒载体,将其转染入实验细胞中,用Western blot和实时定量PCR的方法检测KLF8表达量的变化。MTT、Annexin V/PI染色法及阿霉素蓄积量与潴留实验检测KLF8在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药表型中的作用。结果:缺氧可诱导胃癌细胞系MKN28、MKN45、SGC7901中KLF8的表达升高。与胃癌亲本细胞系相比,KLF8在胃癌耐药细胞系中的表达升高,并且在SGC7901/VCR细胞中表达升高的更为明显。外源性转染KLF8后可显著增加胃癌细胞中KLF8的表达量,KLF8小干扰RNA可有效降低常氧及缺氧条件下胃癌细胞中KLF8的表达。常氧条件下,外源性转染KLF8的正义表达载体可增加胃癌细胞对不同化疗药物的耐受性,降低化疗药物诱导的胃癌细胞凋亡指数,同时可增加细胞内阿霉素的泵出率。缺氧条件下,KLF8小干扰RNA能够逆转胃癌细胞中上述现象的发生。结论:初步实验结果发现了一个新的缺氧反应分子-KLF8。表型试验证实该分子在缺氧诱导胃癌多药耐药中发挥作用。     

Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中的克隆及表达

目的:在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中对Ro60进行克隆,对Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR和药敏胃癌细胞系SGC7901中的表达情况进行比较分析。方法:应用RT-PCR法克隆Ro60的编码基因,通过DNA序列测定对所克隆的基因进行验证。应用半定量RT-PCR法检测Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR和药敏胃癌细胞系SGC7901中的表达情况。结果:在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中,成功克隆了Ro60的编码基因,其DNA序列与Ro60的cDNA序列完全一致。半定量RT-PCR结果显示,Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中的表达强度显著高于药敏胃癌细胞系SGC7901细胞中的表达强度,P<0.01。结论:Ro60在耐药胃癌细胞系中高表达,该分子可能是一种胃癌多药耐药相关分子。     

反义survivin核酸增强胃癌细胞对多西他赛敏感性及其逆转耐药机制的探讨

目的探讨反义survivin核酸(anti-pcDNA3-svv)对胃癌细胞系SGC7901的凋亡诱导和化疗增敏作用,及其与多药耐药基因(mdr-1)的相关性。方法采用电转染法转染胃癌细胞系SGC7901,并筛选阳性克隆。以Western blot法检测survivin蛋白的表达,用透射电镜观察转染后对SGC7901的凋亡诱导作用,RT-PCR检测mdr-1 mRNA的表达,MTT法检测转染细胞对多西他赛的敏感性。诱导SGC7901细胞耐药,检测耐药mdr-1和survivin的表达。结果转染anti-pcDNA3-svv的SGC7901细胞中,survivin蛋白表达较未转染组明显降低;透射电镜下,转染组细胞呈凋亡晚期变化;转染组的mdr-1 mRNA较未转染组明显降低,转染组与未转染组的MDR指数分别为0.196±0.013和3.126±O.019;转染组多西他赛的IC50值为(16.7±1.98)μg/L,而未转染组为(55.7±1.89)μg/L,差异有统计学意义。耐药SGC7901细胞的survivin mRNA表达随着mdr-1 mRNA表达增加而明显增强。结论反义survivin核酸可诱导SGC7901细胞凋亡,增强多西他赛化疗敏感性,其逆转耐药的机制与mdr-1低表达有关。     

胃癌多药耐药逆转短肽GMBP42的活性鉴定

目的：鉴定短肽GMBP42与胃癌多药耐药细胞（SGC7901/VCR和SGC7901/ADR）的结合特异性及其多药耐药逆转活性。方法：体外培养胃癌亲本细胞SGC7901及多药耐药细胞（SGC7901/VCR和SGC7901/ADR）。免疫细胞化学染色技术鉴定短肽GMBP42与多药耐药细胞的结合特异性。体外药物敏感实验测定短肽GMBP42对多药耐药细胞化疗药物敏感性的影响。结果：免疫细胞化学染色结果显示：短肽GMBP42能够与胃癌多药耐药细胞（SGC7901/VCR和SGC7901/ADR）结合,亚细胞定位于核周胞浆及胞膜,而与亲本细胞无明显结合。体外药物敏感试验结果显示：与对照组相比,短肽GMBP42处理组胃癌多药耐药细胞（SGC7901/VCR和SGC7901/ADR）对化疗药物的IC50值及细胞存活率均降低（P〈0.05）。结论：短肽GMBP42能特异结合于多种胃癌多药耐药细胞,短肽GMBP42可提高胃癌多药耐药细胞对阿霉素的敏感性,部分逆转多药耐药细胞对阿霉素的耐药表型。     

胃癌耐药细胞多药耐药基因表达上调中AP-1作用的研究

目的：探讨人胃腺癌阿霉素耐药细胞系SGC7901／ADR中多药耐药（multi drug resistance，MDR）产生机制，为胃癌多药耐药机制的研究提供新靶点。方法：采用MTT法测定3种常用化疗药物顺铂、表柔比星、5-氟尿嘧啶在人胃癌细胞系SGC7901及其阿霉素耐药细胞系SGC7901／ADR中的作用；应用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测SGC7901和SGC7901／ADR中mdr1、c—Jun的mRNA表达情况；转录因子AP-1分别转染入SGC7901和SGC7901／ADR中，应用双荧光素报告基因检测系统（Dual—Lucikrase reporter assay system）检测其活性；Westem Blot法检测P-gp、c-Jun在蛋白水平的表达。结果：SGC7901与SGC7901／ADR在化疗药物顺铂、表柔比星、5-氟尿嘧啶的不同浓度下作用72小时后，发现SGC7901／ADR中细胞的生存率无明显改变，而SGC7901的生存率却有显著的下降趋势；在mRNA水平对mdrl基因进行检测，SGC7901／ADR中的多药耐药基因的表达显著高于SGC7901，而P-gp在蛋白水平的检测中显示SGC7901／ADR相对与SGC7901，表达活性有明显升高；转录因子AP-1的表达分别在SGC7901及SGC7901／ADR中检测到．但SGC7901／ADR中AP-1的活性明显高于SGC7901；AP-1的主要组成成份c—Jun在SGC7901和SGC7901／ADR做mRNA及蛋白水平的检测，结果显示在SGC7901中禾发现c-Jun的明显表达，而SGC7901／ADR中c—Jun的表达活性均显著升高。结论：在人胃腺癌阿霉素耐药细胞系SGC7901／ADR中有MDR的产生，同时伴多药耐药基因上调；转录因子AP—1的活性表达与胃癌细胞的多药耐药性密切相关，AP—1的表达高低可能是其形成机制之一。     

P-糖蛋白、谷胱甘肽-s转移酶的表达与胃癌细胞耐药的关系研究

目的初步探索胃癌多药耐药细胞系SGC7901／VCR的耐药机制。方法间歇诱导法,胃癌细胞系SGC7901经长春新碱（VCR）短时间诱导后,对长春新碱产生耐药。MTT法检测对VCR、5-氟尿嘧啶、表阿霉索的耐药性。Western blot检测P-糖蛋白（P—glucoprotein,P—gp）、谷胱甘肽-s转移酶（ghtathione—s transferring enzyme,GST—s）的表达。结果耐药细胞SGC7901／VCR对长春新碱耐药提高16．56倍,此耐药株同时对5-氟尿嘧啶、表阿霉素呈交叉耐药,耐药指数分别达6．9、13．05。SGC7901／VCR的P—gP、GST—s出现表达增强。结论长春新碱短时间诱导后,SGC7901产生多药耐药性（multi—drug resistance,MDR）,且P—gp、GST—s表达增强。反之,抑制P—gP、GsT—s蛋白的表达,则有可能降低细胞耐药从而逆转胃癌MDR。     

P13-K抑制剂LY294002逆转P-gP介导的白血病和胃癌细胞耐药

背景与目的：磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B[phosphatidylinositol-3-kinase（P13-K）／proteinkinaseB（Akt）,P13-K／Aktl通路是调控细胞生存的重要信号转导通路之一。本研究旨在探讨P13-K抑制剂LY294002对P-gP过表达的人类白血病K562／DNR和胃癌SGC7901／ADR细胞多药耐药性的逆转作用。方法：将细胞分为单纯药物组和LY294002预处理组,单纯药物组分别以柔红霉素（daunorubicin,DNR）、阿霉素（adriamycin,ADR）、长春新碱（vincristine,VCR）和依托泊甙（etoposide,VP-16）处理,LY294002预处理组在加药前以LY294002进行预处理。用台盼蓝拒染法及MTT法检测药物敏感性及LY294002对细胞耐药性的影响。Westernblot检测K562／DNR和SGC7901／ADR细胞中P．gP及p-Akt的表达。流式细胞术检测细胞内药物浓度。结果：2．5μmol／LLY294002预处理显著降低DNR、ADR、VCR和VP-16对K562／DNR细胞的IC50,相对逆转效率分别为72．4％、64．9％、60．4％和52．8％。此外,LY294002部分逆转SGC7901／ADR对ADR的耐药性,相对逆转效率为31．0％。LY294002预处理可部分抑制p-Akt和P-gP的表达。随着处理时间的延长．K562／DNR、SGC7901／ADR细胞内DNR、ADR的蓄积效应有增强的趋势。结论：LY294002通过抑制P13-K／Akt信号转导通路,部分逆转P-gp介导的白血病和胃癌细胞的多药耐药。     

RPL6/Taxreb107在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR中的差异表达及其与MDR相关性的初步研究

目的 探讨BPL6／Taxreb107在胃癌耐药细胞系SGC7901／ADR与胃癌细胞系SGC7901的差异表达,以及与胃癌多药耐药(MDR)的相关性。方法 提取SGC7901和SGC7901/ADR细胞系总RNA;采用内对照RT-PCR检测RPL6基因和Northem杂交、基因克隆与表达、真核表达载体的构建;以电穿孔法基因转染;以流式细胞仪检测瞬时转染细胞的阿霉素蓄积和潴留。结果 内对照RT-PCR和Northern杂交证实RPL6/Taxreb 107在SGC7901/ADR中高表达。将PCR产物克隆人pUCm-T载体并经测序证实。构建正义和反义真核表达载体(pcDNA3．1)并经酶切鉴定证实后,以电穿孔法将正义真核表达载体转入SGC7901,反义真核表达载体转入SGC7901／ADR。转染48h后检测转染细胞的阿霉素蓄积和潴留,结果提示RPI6／Taxreb107转入细胞后对细胞的耐药性有影响。结论 BPI6／Taxreb107在耐药胃癌细胞中高表达,对胃癌的MDR有影响。     

蛋白激酶C同工酶PKC-α及PKC-βⅠ在胃癌及其耐药细胞中的表达和功能

目的：探讨蛋白激酶C（PKC）不同的同工酶亚型在胃癌细胞多药耐药中的作用。方法应用免疫组织化学、激光共聚焦显微镜及Western blot,观察传统型PKC（cPKCs)的PKC-α与PKC－βⅠ在胃癌细胞SGC7901及其不同剂长春新碱（VCR0．3,0．7,1．0mg/L)诱导的耐药细胞SGC7901／VCR中的表达与分布;以阿霉素（AMD）为指示剂,通过流式细胞仪检测PKC-αP与PKC－βⅠ的相应抗体对SGC7901／VCR细胞内药物蓄积浓度的影响。结果（1）KC-α在SGC7901呈阳性表达;在SGC7901／VCR呈强阳性,其表达强度随耐药剂量的增加而呈增加趋势。（2）PKC－βⅠ在SGC7901及其不同耐药剂量的耐药细胞SGC7901／VCR中均呈弱阳性有表达,相互之间差异无显著性。（3）以ADM为荧光指示剂,通过流式细胞仪检测显示,SGC7901／VCR细胞内药物浓度比SGC7901明显降低,并且随耐药剂量的增加而呈逐渐减少趋势;SGC7901／VCR细胞内药物浓度比SGC7901明显降低,并且随耐药剂量的增加而呈逐渐减少趋势,SGC7901／VCR与抗PKC-α抗体共同孵育后,其细胞内ADM蓄积增加,而与抗PKC－βⅠ抗体共同孵育后,其细胞内ADM浓度无明显变化。结论胃癌细胞SGC701／VCR的耐药机制可能与PKC-α有关,而与PKC－βⅠ无明显相关性。     

RhoB对胃癌细胞SGC7901的负性调控作用

目的研究RhoB对胃癌细胞SGC7901增殖调控作用。方法用PCR扩增出RhoB的全长cDNA，构建RhoB可诱导表达载体pGene／V5-His-RhoB；脂质体介导法将调控载体pSwitch及诱导表达载体pGene／V5-His-RhoB先后转入人胃癌细胞SGC7901中，筛选出稳定抗性克隆；Western blot检测米非斯酮诱导后转染细胞中RhoB蛋白的表达。用MTT assay检测RhoB转染细胞株的生长速度、双苯并咪唑染料(Hoechst 33258)活细胞吸收分析法、流式细胞仪(FCM)检测RhoB对胃癌细胞凋亡指数作用。结果成功构建RhoB可诱导真核表达载体pGene／V5-His-RhoB，并经酶切和测序鉴定；转染后经潮霉素B和Zeocin筛选出稳定抗性克隆SGC7901／RhoB；米非斯酮诱导出RhoB蛋白表达，在诱导24小时后蛋白表达最高；细胞增殖试验结果显示，RhoB表达上调后胃癌细胞增殖受到抑制；细胞凋亡检测提示高表达RhoB可明显诱导胃癌细胞凋亡。结论RhoB对胃癌细胞增殖具有负性调控作用，可诱导胃癌细胞出现凋亡。     

锌带基因ZNRD1在胃癌耐药细胞中的表达和功能

目的 探讨锌带基因ZNRD1在多药耐药胃癌细胞中的表达和作用。方法 应用Northern blot和半定量RT—PCR,观察锌带基因ZNRD1在胃癌细胞SGC7901及其长春新碱(VCR)诱导的耐药细胞SGC7901／VCR中的表达;将反义核酸转染SGC7901／VCR细胞,通过免疫组化检测转导细胞与非转导细胞ZNRD1蛋白的表达;以流式细胞仪检测细胞周期的变化,以MTT实验检测细胞生长曲线和对VCR、阿霉素(ADM)的药敏性。结果 胃癌耐药细胞SGC7901／VCR与非耐药细胞相比,ZNBDl基因的表达明显增高。转导株antiZNRDl—SGC7901／VCR细胞的ZNRD1蛋白水平明显低于非转导株,C1期细胞比例增加而S期比例减少,生长受到抑制,且对VCR、ADM的敏感性明显增高。结论 胃癌耐药细胞与非耐药细胞相比,ZNRDl基因处于高表达状态。反义核酸转染可有效阻断ZNRDl蛋白的表达,在一定程度上逆转人胃癌耐药细胞SGC7901／VCR的多药耐药性。