调节性T细胞治疗实验性小鼠多发性肌炎及机制研究

目的探讨CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞对于实验性自身免疫性肌炎（EAM）小鼠的治疗价值及机制。方法免疫磁珠分
选技术从BALC/c小鼠脾脏中分选出足量CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞以备回输,观察干预组及未干预组EAM小鼠肌肉组织
病理学变化,流式细胞仪检测两组小鼠脾脏CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞表面PD-1及CTLA-4的表达变化,双抗体夹心ELISA
法检测外周血IL-10、TGF-β的变化。结果干预组小鼠较未干预组肌肉病理炎性细胞浸润明显减轻,其外周血IL-10、TGF-β含
量较未干预组明显升高（P<0.05）,脾脏CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞表面PD-1及CTLA-4表达明显升高（P<0.05）。结论CD4+
CD25+ Foxp3+ Treg细胞回输对于EAM小鼠的治疗效果是通过增加外周血IL-10及TGF-β水平和增高脾脏CD4+ CD25+ Foxp3+
Treg细胞表面PD-1及CTLA-4的表达发挥作用。
     

雷帕霉素对哮喘小鼠CD4+CD25+调节性T细胞的作用

目的：建立哮喘小鼠动物模型并给予吸入雷帕霉素治疗,观察雷帕霉素治疗哮喘的效果及其对CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）比例及扩增能力的影响,探讨雷帕霉素治疗哮喘的相关机制。方法：采用随机数字表法将30只雌性BALB/c 小鼠分成3组,每组10只,分别为：对照组、模型组和雷帕霉素治疗组。采用Underwood方法对小鼠肺组织进行评分;采用流式细胞术观察小鼠外周血和肺组织中CD4+CD25+Treg细胞比例;不同浓度（50、100 nmol/L）雷帕霉素处理小鼠CD4+ T细胞后,采用流式细胞术和RT-PCR方法分别检测CD4+CD25+Treg细胞形成比例和Foxp3 mRNA表达情况,观察雷帕霉素对小鼠的影响。结果：与模型组相比,雷帕霉素治疗能够显著改善小鼠肺组织病理评分情况;雷帕霉素治疗后,与模型组相比,外周血单个核细胞和肺组织中CD4+CD25+Treg均显著升高（P<0.01）;50、100 mol/L雷帕霉素处理小鼠CD4+T细胞后,CD4+CD25+Treg细胞比例分别为（7.47±1.84）%和（10.93±2.74）%,与对照组［（4.84±0.76）%］相比,雷帕霉素处理可显著促进CD4+CD25+Treg细胞增殖（P<0.01）;RT-PCR结果与流式细胞结果一致,雷帕霉素处理可显著促进CD4+T细胞中Foxp3的表达（P<0.01）。结论：雷帕霉素可能通过促进CD4+CD25+Treg细胞增殖,增加哮喘小鼠外周血和肺组织中CD4+CD25+Treg细胞比例,进而对小鼠哮喘发挥治疗作用。     

肿瘤微环境中Treg细胞和Th17细胞对鼻咽癌进展和预后的影响

目的：研究免疫微环境中Treg细胞和Th17细胞对鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）进展和预后的影响。方法：收集2001年1月～2003年12月在中山大学肿瘤防治中心经病理证实为鼻咽癌的石蜡标本557例。所有患者均为初次诊断且未进行任何治疗,随访时间均超过5年。采用免疫组化双染色法检测Treg细胞分子标志物CD4和Foxp3、Th17细胞分子标志物CD4和IL-17,观察并计数,CD4+Foxp3+Treg细胞、CD4+IL-17+Th17细胞在癌巢和间质不同部位的表达数目,统计分析其阳性细胞数目与临床病理特征及与鼻咽癌患者预后的关系。结果：CD4+Foxp3+Treg调节性T细胞主要在肿瘤间质浸润（中位数：2.0/HPF）,然而,在557例鼻咽癌组织石蜡切片染色中均未观察到CD4+IL-17+双阳性信号。Kaplan-Meier生存曲线和log-rank统计分析结果表明,间质中的CD4+Foxp3+Treg调节性T细胞与鼻咽癌患者的无瘤生存时间显著正相关,而与总体生存时间虽然存在正相关趋势,但没有达到统计学意义。单因素Cox比例风险模型显示,肿瘤间质中CD4+Foxp3+Treg调节T细胞高数量组发生治疗后转移复发的风险低于数量较少的患者,能一定程度降低患者的死亡风险,但没有达到统计学意义。CD4+Foxp3+Treg调节T细胞在NPC间质中的数量与肿瘤转移复发呈负相关。结论：肿瘤间质中CD4+Foxp3+Treg细胞浸润数量增多与鼻咽癌患者预后呈正相关,降低局部复发,但不能降低死亡风险;在鼻咽癌肿瘤组织中未观察到CD4+IL-17+双阳性信号。     

成人微小病变肾病患者外周血CD4+Foxp3+调节性T细胞的研究

目的 研究CD4+Foxp3+调节性T细胞（CD4+Foxp3+Treg）及亚群在成人微小病变肾病（MCD）患者外周血CD4+T细胞中的分布,探讨CD4+Foxp3+Treg参与MCD发病的可能机制。方法 以27例经肾穿刺活检确诊为MCD的初发成人患者作为研究对象,采用Foxp3-FITC/CD45RA-PE/CD3-ECD/CD4-PC7抗体组合经流式细胞仪检测外周血单个核细胞（PBMCs）中CD4+Foxp3+Treg及亚群占CD4+T细胞的百分比。Real-Time PCR检测PBMCs中Foxp3、Th17转录因子RORc以及细胞因子TGF-β1、IL-6、IL-17A 、IL-23 mRNA表达。设立正常对照。结果 流式细胞检测显示CD4+Foxp3+Treg分成3个细胞群体,分别为CD45RA+Foxp3low(Ⅰ区,静息期Treg)、CD45RA-Foxp3high（Ⅱ区,活化Treg)和CD45RA-Foxp3low(Ⅲ区)。MCD组Ⅰ区+Ⅱ区细胞和Ⅱ区细胞占CD4+T细胞的百分比显著低于对照组（P<0.01）。MCD组PBMCs中Foxp3 mRNA表达较对照组下调（P<0.05）,RORc mRNA表达较对照组上调（P<0.05）,IL-6、IL-17A、IL-23 mRNA表达均显著高于对照组（P<0.05和P<0.01）。相关性分析显示,MCD组IL-17A mRNA表达与Ⅱ区细胞占CD4+T细胞的百分比呈显著负相关（r=－0.81,P<0.05）。结论 成人MCD患者外周血Treg及其活化功能亚群减少,同时伴有Th17转录基因及其相关细胞因子表达的异常升高。提示Treg Foxp3 mRNA表达下调及Treg/Th17细胞比例失衡可能与MCD的发病有关。     

肺癌模型小鼠肿瘤和主要免疫器官组织中调节性T细胞和NK细胞的数量变化及其意义

目的：探讨肺癌小鼠CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞（Treg）和自然杀伤细胞（NK）在外周免疫器官和肿瘤组织中数量的变化,阐明其对肿瘤发展的影响。方法：C57BL/6小鼠分为Lewis肺癌细胞系（LLC）注射组和正常对照组,LLC注射组小鼠采用LLC腋窝注射制备皮下肿瘤模型,正常对照组小鼠采用生理盐水等量注射。采用细胞表面和细胞内特异荧光抗体染色和流式细胞术检测肺癌小鼠脾脏、淋巴结和肿瘤组织中CD4⁺CD25⁺T细胞、Treg细胞及脾脏组织中NK细胞数量。结果：与正常对照组比较,LLC注射组小鼠脾脏和淋巴结中CD4⁺CD25⁺ T细胞占CD4⁺T细胞比例及Foxp3⁺在CD4⁺CD25⁺T细胞中的表达比例明显升高（P < 0.05）,CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg细胞数量也明显升高（P < 0.05或P < 0.01）。LLC接种组小鼠肿瘤组织中CD4⁺CD25⁺ T细胞占CD4⁺T细胞比例及Foxp3⁺在CD4⁺CD25⁺T细胞中的表达比例明显高于脾脏和淋巴结（P < 0.05）。与正常对照组比较,LLC注射组小鼠脾脏组织中NK细胞比例明显降低（P < 0.05）。结论：肺癌小鼠主要免疫脏器官组织中Treg细胞比例和数量升高,NK细胞比例降低,其可促进肿瘤发展,抑制机体对肿瘤细胞的免疫应答。     

自体灭活T细胞免疫后诱导Treg下调的机制

目的 探讨自体灭活T细胞免疫注射后诱导体内调节性T细胞（Treg）下调的机制。方法 自体T细胞体外用刀豆蛋白(ConA)刺激活化,照射灭活T细胞给小鼠进行皮下和腹腔免疫（每只小鼠5×106/次）,每隔5 d免疫一次,免疫3次后检测小鼠体内Treg的数量及功能;对照组小鼠皮下注射PBS。ELISA法检测血清中抗鼠CD25抗体。免疫小鼠血清分离后经尾静脉注入未免疫小鼠体内,检测受体小鼠Treg的数量及功能变化。结果 免疫小鼠体内CD4+CD25+Foxp3+ Treg数量较对照组减少（P<0.01）,抑制功能也显著降低（P<0.01）,但血清中抗CD25的抗体增加（P<0.01）。正常小鼠接受免疫小鼠血清后,Treg的数量和抑制功能下调（P<0.01）。结论 采用ConA 活化的自体灭活T细胞免疫,可诱导抗CD25抗体增加,进而减少体内CD4+CD25+Foxp3+ Treg 细胞数量和功能。     

老年2型糖尿病周围神经病变患者外周血调节性T细胞的检测及其临床意义

目的：探讨2型糖尿病周围神经病变（DPN）患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg）的变化及其检测的临床应用。方法：采用流式细胞技术多色荧光分析法,对20例初诊老年DPN患者、20例初诊老年2型糖尿病（T2DM）不伴并发症患者及20例性别年龄匹配的健康对照（CON）者外周血中Treg细胞测定,对两组结果进行统计学分析。结果：与正常对照组比较,DPN组和DM组患者外周血CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞数量均显著减少（P<0.05）,且DPN组患者较DM组患者亦显著减少（P<0.05）;DPN组患者外周血CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞比例与MNSI评分呈负相关,但无统计学意义,而与MDNS评分则呈显著负相关（r=-0.339,P<0.05）。结论：老年DPN患者中CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞数量减少,可能在DPN的发生发展中起到一定作用。     

异基因造血干细胞移植后aGVHD与调节性T细胞、IL-35的相关性

目的   探索异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后发生急性移植物抗宿主病（aGVHD）的患者外周血中调节性T细胞及其相关转录因子、细胞因子的水平,以期获得能够有效预测患者发生aGVHD的生物学指标。方法   外周血样品采自接受造血干细胞移植术的患者和健康人,其中aGVHD阳性组13例,aGVHD阴性组10例,正常对照组21例。采用流式细胞术检测各组外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞占CD4+T淋巴细胞的百分比,应用实时定量PCR检测外周血单个核细胞中Foxp3转录因子的相对表达量,应用酶联免疫吸附试验检测外周血血浆中Treg相关细胞因子IL-35的表达水平。结果   aGVHD阳性组外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比、单个核细胞中Foxp3转录因子的相对表达量、血浆中IL-35的表达水平较aGVHD阴性组和正常对照组明显降低（P<0.05）,且经有效治疗后各指标显著升高。在aGVHD阳性组中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比、Foxp3的相对表达量与aGVHD的危险度分级呈负相关（P<0.05）。配对样本资料分析显示,aGVHD发生时外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比、Foxp3 mRNA的相对表达量与aGVHD发生前1~2周相比明显下降（P<0.05）。结论   异基因造血干细胞移植后患者发生aGVHD时CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的百分比、其转录因子的表达量及IL-35水平均发生明显降低,且在治疗后明显升高,可以为临床预测aGVHD的发生发展及预后提供理论依据和实验基础。     

屋尘螨过敏原DNA疫苗对哮喘模型小鼠Foxp3+调节性T细胞功能的影响

目的 观察编码屋尘螨主要过敏原Der p1和Der p2的质粒DNA疫苗对哮喘小鼠脾细胞Foxp3 调节性T细胞(regulatory T cells,Treg细胞)功能的影响.方法 以屋尘螨提取液复制哮喘模型后,将编码Der p1、Der p2的真核表达质粒pDs-Der p1、pCI-neo-Der p2等量混合接种小鼠后对小鼠进行再次激发.分离小鼠脾脏细胞,以流式细胞仪方法检测CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞比例.采用磁珠法分离CD4 CD25 T细胞,流式细胞仪检测其Foxp3基因的表达,并以IL-2进行刺激观察其增殖反应,测定其上清液中的IL-10、TGF-β含量.将分离的Treg细胞与哮喘小鼠CD4 CD25-T细胞共同培养,观察Treg细胞对CD4 CD25-T细胞增殖及IL-4、IL-5、IFN-γ的影响.结果 哮喘组小鼠脾脏CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞比例显著低于对照组,经DNA疫苗治疗后CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞显著增加.体外培养发现各组CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞增殖能力均显著低于CD4 CD25-T细胞,培养液上清中均未检测到IL-10和TGF-β存在.3组CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞均可显著抑制哮喘CD4 CD25-T细胞的增殖及IL-4、IL-5和IFN-γ的分泌,但在3组Treg细胞中,哮喘组Treg细胞作用显著低于其他两组.结论 Treg细胞可显著抑制哮喘CD4 CD25-T细胞的增殖及炎性介质的分泌,哮喘小鼠不仅出现CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞数量的减少,而且其功能也可能出现缺陷.DNA疫苗治疗可以诱导CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞增加,并恢复其功能活性.     

屋尘螨过敏症母亲脐血中调节性T细胞数量上存在的缺陷

目的:探讨屋尘螨过敏症母亲脐血中CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T(Treg)细胞和CD4+ IL-10+调节性T(Treg)细胞是否存在数量上的缺陷.方法:收集7例患屋尘螨过敏症及14例无过敏症母亲的脐血,分离脐血单个核细胞(CBMC)后体外培养,分别用及不用天然屋尘螨抗原1(nDer pl)刺激,用流式细胞术检测刺激及不刺激时CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞及CD4+ IL-10+ Treg细胞占CD4+T细胞的比率.结果:不刺激时,过敏症母亲组CBMC中的CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞占CD4+T细胞的比率为(1.13±0.36)％,显著低于无过敏症母亲组的比率(3.11±1.13)％(P＜0.01).尘螨抗原刺激后,两组CD4+ CD25+ Foxp3Treg细胞比率均较不刺激时升高(P＜0.01),过敏症母亲组增加的比率为(0.67±0.25)％,低于无过敏症母亲组增加的比率(1.50±0.40)％(P＜0.01);不刺激时,过敏症母亲组CD4+IL-10+ Treg细胞比率的中位数为0.41％,显著低于无过敏症母亲组的1.04％(P＜0.01);尘螨刺激后,无过敏症组CD4+ IL-10+ Treg细胞比率2.26％较该组不刺激时比率1.04％升高(P＜0.05),显著高于过敏症母亲组的比率0.61％ (P＜0.01),但两组提高的幅度未见统计学差异(P＞0.05).结论:过敏症母亲脐血中CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞及CD4+ IL-10+ Treg细胞在数量上存在缺陷.     

CD4+CD25+、CD4+CD25hig调节性T细胞和Foxp3 mRNA在婴幼儿喘息中的表达及意义

目的探讨婴幼儿喘息CD4+CD25+、CD4+CD25hig调节性T细胞(Treg)和叉头/翼状螺旋转录因子(Foxp3)mRNA的表达及意义。方法采用流式细胞术检测51例首次喘息婴幼儿外周血CD4+CD25+Treg和CD4+CD25hig Treg的比例,RT-PCR检测Foxp3mRNA的表达量,酶联免疫吸附法(ELASA)检测总IgE水平,并与正常婴幼儿对照。结果喘息婴幼儿外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25higTreg占CD4+T细胞的百分比分别为(6.31+2.96)%和(3.52+1.46)%,均明显低于健康对照组(P<0.01);特应征喘息组CD4+CD25+Treg、CD4+CD25higTreg及Foxp3mRNA表达均低于非特应征喘息组(P<0.05)。喘息患儿CD4+CD25higTreg百分率及Foxp3mRNA表达与血清总IgE之间呈显著负相关(r=-0.75,r=-0.61,P<0.01),而CD4+CD25+Treg百分比与血清总IgE存在正相关(r=0.36,P<0.05)。结论 CD4+CD25+Treg、CD4+CD25hig Treg及Foxp3mRNA在婴幼儿喘息的发病中起重要作用。     

成人微小病变肾病患者外周血CD4~＋Foxp3~＋调节性T细胞的研究

目的研究CD4＋Foxp3＋调节性T细胞（CD4＋Foxp3＋Treg）及亚群在成人微小病变肾病（MCD）患者外周血CD4＋T细胞中的分布,探讨CD4＋Foxp3＋Treg参与MCD发病的可能机制。方法以27例经肾穿刺活检确诊为MCD的初发成人患者作为研究对象,采用Foxp3-FITC/CD45RA-PE/CD3-ECD/CD4-PC7抗体组合经流式细胞仪检测外周血单个核细胞（PBMCs）中CD4＋Foxp3＋Treg及亚群占CD4＋T细胞的百分比。Real-Time PCR检测PBMCs中Foxp3、Th17转录因子RORc以及细胞因子TGF-β1、IL-6、IL-17A、IL-23mRNA表达。设立正常对照。结果流式细胞检测显示CD4＋Foxp3＋Treg分成3个细胞群体,分别为CD45RA＋Foxp3low（Ⅰ区,静息期Treg）、CD45RA-Foxp3high（Ⅱ区,活化Treg）和CD45RA-Foxp3low（Ⅲ区）。MCD组Ⅰ区＋Ⅱ区细胞和Ⅱ区细胞占CD4＋T细胞的百分比显著低于对照组（P〈0.01）。MCD组PBMCs中Foxp3mRNA表达较对照组下调（P〈0.05）,RORcmRNA表达较对照组上调（P〈0.05）,IL-6、IL-17A、IL-23mRNA表达均显著高于对照组（P〈0.05和P〈0.01）。相关性分析显示,MCD组IL-17A mRNA表达与Ⅱ区细胞占CD4＋T细胞的百分比呈显著负相关（r=-0.81,P〈0.05）。结论成人MCD患者外周血Treg及其活化功能亚群减少,同时伴有Th17转录基因及其相关细胞因子表达的异常升高。提示Treg Foxp3 mRNA表达下调及Treg/Th17细胞比例失衡可能与MCD的发病有关。     

低剂量环磷酰胺对Lewis肺癌小鼠CD4+CD25+Treg细胞功能的影响

目的：研究低剂量环磷酰胺（CTX）单次注射对Lewis肺癌小鼠CD4⁺CD25⁺Treg细胞功能的影响,探讨CD4⁺CD25⁺Treg 细胞与肿瘤发生、发展的关系。方法：将传代培养的Lewis肺癌细胞接种于C57BL/6小鼠右腋皮下,建立Lewis肺癌模型,随机分成3组：CTX组、肿瘤组、单纯对照组。采用CTX单次注射,观测各组肿瘤体积动态变化;采用流式细胞术检测各组小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg细胞数量变化;采用半定量RT-PCR方法检测各组小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达水平;采用MTT法检测脾脏T淋巴细胞增殖功能;采用LDH释放法检测脾脏特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)细胞的杀伤活性。结果：与未治疗肿瘤组相比,CTX治疗可延缓荷19 d Lewis肺癌小鼠的肿瘤生长;CTX组小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg细胞数量低于肿瘤组（P< 0.05）;CTX组小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达水平明显低于肿瘤组（P< 0.05）;CTX组小鼠脾脏T淋巴细胞功能明显高于肿瘤组（P<0. 05）;CTX组小鼠脾脏T淋巴细胞杀伤活性比肿瘤组略高,但变化不显著（P>0.05）。结论：CTX单次注射可降低Lewis肺癌小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg细胞的数量及Foxp3 mRNA表达,使T淋巴细胞增殖功能及脾细胞中CTLs杀伤功能增强。     

卵巢癌患者CD8+ T细胞中调节性T细胞相关分子标志物的表达率及临床意义

目的 :检测卵巢癌患者组织及外周血CD8~+T细胞中调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)相关分子标志物的表达率,探讨其在卵巢癌发生发展中的临床意义。方法:用流式细胞术检测31例卵巢癌患者、31例卵巢良性肿瘤患者和31例健康对照者的外周血,以及14例卵巢癌组织和12例卵巢良性肿瘤组织CD8~+T细胞中Foxp3、CD25、CD28、CTLA-4及GITR的表达率。结果:Foxp3和CTLA-4在卵巢癌组织CD8~+T细胞中的表达率显著高于卵巢良性肿瘤组织(P<0.05);CD28在卵巢癌组织CD8~+T细胞中的表达率显著低于卵巢良性肿瘤组织(P<0.05)。卵巢癌患者外周血CD8+T细胞中Foxp3、CD25、CTLA-4的表达率显著高于卵巢良性肿瘤患者和健康对照者(P<0.05),CD28的表达率显著低于卵巢良性肿瘤患者和健康对照者(P<0.05)。结论:卵巢癌组织及外周血CD8~+Treg所占的比例显著高于卵巢良性肿瘤组及健康对照组,且CD8~+T细胞中Foxp3的表达率可能对了解卵巢癌进展状况有一定帮助。     

下调Foxp3基因表达对人调节性T细胞功能的影响

目的 利用RNA干扰技术下调Foxp3表达,观察其对人CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)表型及功能的影响.方法 利用Foxp3 siRNA转染人CD4+CD25+Treg,荧光显微镜和流式细胞仪(FACS)检测转染效率,实时定量PCR和Western印迹分别鉴定Foxp3基因及Treg功能相关基因表达、Foxp3蛋白表达,细胞增殖实验检测Treg抑制功能,FACS测Treg表型标记,ELISA检测细胞因子表达.结果 Foxp3 siRNA转染人CD4+CD25+Treg效率为68%,与对照组相比,转染后的细胞Foxp3基因下调了61.4%(P<0.01),Foxp3蛋白表达较低,Treg功能相关基因和主要表型标记也较对照组有改变,差异有统计学意义.功能试验提示无论是在异种还是同种抗原刺激的淋巴细胞反应中,Foxp3 siRNA转染的Treg与对照组相比,对效应性T细胞的抑制作用较弱(异种抗原组83%比48%,P<0.05;同种抗原组65%比28%,P<0.01),且主要抑制性和效应性细胞因子的表达下降,差异有统计学意义.结论 Foxp3是人天然Treg 维持其抑制性功能的核心细胞内标志.

Abstract：

Objective To employ the technology of interfering RNA (RNAi) to identify the role of Foxp3 in the in vitro suppressive effect of human regulatory T cell (Treg) on effector T cells. MethodsExpanded human Treg were transfected with siRNA targeting Foxp3 genes. The transfection efficiency, the level of corresponding gene and its protein expression were measured by fluorescent microscopy, fluorescence-activated cell sorting (FACS), real-time PCR and Western blot respectively. The phenotypes of Treg were analyzed by FACS. The siRNA transfected Treg was then co-cultured with porcine PBMC or human PBMC-stimulated autologous CD4+CD25- T cells. Their proliferations were examined by WST-1. Treg and autologous CD4+CD25- T cell-related suppressive cytokines were assessed by ELISA. ResultsA 68% transfection efficiency in expanded Treg was achieved for Foxp3 siRNA. Real-time PCR revealed a 61.4% mRNA knockdown induced by siRNA targeting Foxp3 genes in Treg versus the control (P<0.01). Some Treg-associated surface markers were significantly altered versus the control. And the production of suppressive cytokines was lowered. These changes were correlated with the diminished Treg activity in suppressing the proliferation of effector CD4+CD25-T cells. There was 83% suppression by non-transfected Treg vs 48% suppression by Foxp3 siRNA transfected Treg in xeno-immune response (P<0.05);and 65% suppression by non-transfected Treg vs 48% suppression by Foxp3 siRNA transfected Treg in allo-immune response (P<0.01). Conclusion Foxp3 is a key intracellular marker for maintaining the phenotypes and functions of Treg.     

消癌解毒方对结肠癌的抑制作用及对Treg细胞的影响

目的?探讨消癌解毒方对结肠癌的抗肿瘤作用及作用机制。方法?皮下注射结肠癌细胞CT26于BALB/c小鼠右腋下,建立荷瘤小鼠模型,连续灌胃给药14?d后,处死小鼠,分离外周血单核细胞,流式细胞仪检测消癌解毒方对Treg细胞分布的影响,免疫组化检测消癌解毒方对肿瘤组织内Foxp3蛋白表达的影响。结果?消癌解毒方可以显著抑制结肠癌荷瘤的增长,降低CD4+Foxp3+Treg细胞在外周血及脾脏的分布,减少Foxp3蛋白在肿瘤组织内的表达。结论?消癌解毒方具有显著抑制结肠癌增殖的作用,其机制可能与减少外周血内Treg细胞的分布及肿瘤组织中Foxp3的表达进而影响其下游信号通路传导相关。      

毛细支气管炎CD4+ CD25+调节性T细胞和Foxp3 mRNA表达与激素调控

目的 探讨毛细支气管炎(简称毛支)的发病机制与激素治疗.方法 对呼吸道合胞病毒(RSV)阳性的毛支患儿,根据血清总IgE是否增高以及有无湿疹、皮炎等过敏病史,分为特应体质和非特应体质2组,各50例,另选健康对照组25名.毛支患儿按临床评分分为轻、中、重度(18、62、20例);再随机分成激素组(49例)和非激素组(51例).流式细胞仪检测外周血CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)的比例;反转录(RT)-PCR检测Foxp3 mRNA的表达量.结果 CD4+ CD25+ Treg的数量和Foxp3 mRNA表达量:健康对照组、非特应体质组、特应体质组分别为(10.5±1.6)%和0.34±0.11、(8.8±2.2)%和0.26±0.08、(7.6±1.8)%和0.21±0.09,差异均有统计学意义(均P<0.05);轻、中、重组分别为(9.7±1.6)%和0.28±0.08、(7.8±2.1)%和0.24±0.06、(6.7±1.3)%和0.20±0.07(均P<0.05).CD4+ CD25+ Treg数量、Foxp3 mRNA的表达量与临床评分均呈显著负相关(r=-0.62、-0.71,均P<0.01);激素治疗后两者均升高[(9.5±2.1)%和0.33±0.10分别比(8.5±1.8)%和0.27±0.12,P<0.05和<0.01].结论 CD4+ CD25+ Treg和Foxp3 mRNA与RSV毛支气道炎症关系密切,可反映毛支的病情严重程度.激素可促进CD4+ CD25+ Treg的发育和功能.     

妊娠期高血压疾病妇女外周血调节性T细胞和辅助性T细胞表达分析

目的 分析妊娠期高血压疾病(PIH)妇女外周血调节性T细胞和辅助性T细胞表达变化。方法 连续选择近期住院确诊的PIH 妇女27例(PIH组),入选对象均接受了外周血调节性T细胞(CD+4CD+25 Treg 和CD+4CD+25 Foxp3+Treg)和辅助性T细胞(CD+3、CD+4、CD+8、CD+4/CD+8)检测,并与同期住院正常怀孕产妇 (对照组,20例)相同测试结果进行比较。结果 调节性T细胞数据中,PIH组血清CD+4CD+25 Treg和CD+4CD+25 Foxp3+ Treg水平明显低于对照组(P均<0.05～0.01)。辅助性T细胞中,PIH组血清CD+4/CD+8表达水平明显高于对照组,而CD+8表达水平则显著低于对照组(P均<0.05～0.01)。结论 PIH患者存在明确的外周血调节性T细胞和辅助性T细胞异常表达。     

吡格列酮通过调控TGF-β信号通路和T细胞调节性免疫机制缓解ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化

目的 研究ApoE-/-小鼠体内吡格列酮(PIO)是否通过TGF-β信号通路和T细胞调节性免疫机制来发挥抗动脉粥样硬化的作用.方法 动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型连续8周每日灌胃给予PIO(日剂量20 mg/kg).免疫组化对动脉病变组织中TGF-β信号通路相关因子、IFN-γ+细胞及Foxp3+细胞的表达水平进行检测.体外研究中,用特异性抗原氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激原代培养的ApoE-/-小鼠脾脏细胞,并与PIO或PIO+PPARγ阻断剂GW9662共同孵育.流式细胞术检测CD4+IFN-γ+细胞和CD4+CD25+Foxp3+细胞的水平.结果 PIO可通过提高TGFβ1(P<0.01),TGFβRII(P<0.05)和p-Smad3(P<0.05)的表达量、抑制Smad7(P<0.05)的表达量来缓解ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的病变程度.体外实验表明,PIO处理后原代小鼠脾细胞中IFN-γ的mRNA水平显著下调(P<0.05),而Foxp3的mRNA水平显著上调(P<0.05).流式细胞术表明PIO处理后CD4+IFN-γ+细胞(P<0.05)和CD4+CD25+Foxp3+细胞(P<0.05)的表达量明显上升,而PPARγ阻断剂GW9662可阻断PIO对两种细胞的调控作用.结论 PIO可能通过调控TGF-β/Smad信号通路及PPARγ介导的Th1/Treg细胞水平抑制ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化病变.