RNA干扰FGFR3基因表达诱导骨肉瘤细胞凋亡及下调Wnt信号通路的 研究

目的:探讨RNA干扰人成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）基因表达对骨肉瘤细胞凋亡及Wnt信号通路的影响。方法:以LipofectamineTM 2000为载体，参照其转染说明将设计合成的2个针对FGFR3的特异性siRNA及阴性对照siRNA转染人骨肉瘤MG63细胞，同时设置空白对照组，转染48 h，Western blotting检测FGFR3、β-catenin、Survivin和Bax蛋白的表达；流式细胞术检测细胞凋亡率；二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFHDA）探针检测活性氧（ROS）含量。结果:2个FGFR3 siRNA转染MG63细胞后FGFR3蛋白表达均明显受到抑制，与空白对照组及NC组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。MG63细胞转染FGFR3 siRNA后细胞凋亡率明显升高，ROS含量明显升高，β-catenin和Survivin蛋白的表达明显降低，Bax蛋白的表达明显升高，与NC组比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:RNA干扰FGFR3基因表达可诱导骨肉瘤细胞凋亡，机制可能与细胞内ROS含量升高及Wnt信号通路下调有关。     

抑制TPD52基因表达对结直肠癌细胞凋亡及ROS含量的影响

目的:探讨抑制肿瘤蛋白D52（TPD52）基因表达对结直肠癌细胞活力、凋亡率及活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量的影响及机制。方法:正常结肠NCM460细胞作为对照细胞,分别用RT-PCR及Western blotting检测人结直肠癌Caco2、SW480、HCT116、HT29细胞TPD52的mRNA及蛋白表达。以LipofectamineTM 2000为载体,将抑制TPD52表达的siRNA（TPD52-siRNA）及阴性对照siRNA（NC）转染HCT116细胞,转染48 h,MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率及ROS含量;Western blotting检测各组细胞增殖相关蛋白Ki67和PCNA及凋亡相关蛋白Bax和Survivin的蛋白表达。结果:与正常结肠NCM460细胞比较,Caco2、SW480、HCT116、HT29细胞中TPD52的mRNA及蛋白表达均明显升高,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。转染TPD52-siRNA的HCT116细胞TPD52的mRNA及蛋白表达均明显降低,与空白对照组和NC组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。与NC组比较,TPD52-siRNA组细胞活力明显降低,凋亡率升高,ROS含量升高,Ki67、PCNA和Survivin的蛋白表达明显降低,Bax的蛋白表达明显升高,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论:TPD52基因表达抑制可降低结直肠癌细胞活力和诱导凋亡,机制可能与细胞内ROS水平提高及Ki67、PCNA、Survivin表达下调和Bax表达上调有关。     

siRNA敲减NEK2表达可提高结直肠癌细胞对5-FU的化疗敏感性

目的：探讨敲减中心体相关激酶2（never in mitosis A-related kinase 2,NEK2）对结直肠癌细胞5-FU化疗敏感性的影响及其可能的机制。方法：采用 qPCR 和 Western blotting 检测结直肠癌细胞中 NEK2 mRNA 及蛋白的表达水平。构建针对NEK2基因的小干扰RNA（siRNA）并转染至结直肠癌细胞HCT116及SW620,实验分为阳性干扰组1（转染NEK2 siRNA1）、阳性干扰组2（转染NEK2 siRNA2）和阴性对照组（转染si-NC）,均用5-FU处理。采用CCK-8实验、V-FICT/PI Annexin双染色流式细胞术实验观察敲减NEK2基因对5-FU作用下结肠癌细胞的增殖、周期分布及凋亡的影响,采用Western blotting检测敲减NEK2基因对5-FU作用下结直肠癌细胞内Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响。结果：NEK2蛋白及mRNA在结直肠癌细胞HCT116、SW620中均呈高表达（P<0.05或P<0.01）,转染NEK2 siRNA可高效抑制HCT116、SW620细胞中NEK2蛋白及mRNA表达（均P<0.01）。经不同浓度5-FU作用后,阳性干扰组1和阳性干扰组2的细胞存活率和IC50均显著低于阴性对照组（均P<0.01）,细胞发生G0/G1期阻滞且凋亡率显著升高（均 P<0.01）,胞核 β-catenin、c-myc 和 cyclin D1 表达水平显著下降而胞质β-catenin表达水平升高（均P<0.01）。结论：敲减NEK2基因可有效提高人结直肠癌细胞对5-FU的化疗敏感性,该作用可能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达来实现的。     

毛萼乙素通过Wnt/β-catenin通路抑制结直肠癌细胞增殖的机制探讨

目的:探讨毛萼乙素（Eriocalyxin B,EriB）通过Wnt/β-catenin通路抑制结直肠癌（colorectal cancer,CRC）细胞增殖的机制。方法:CCK-8、软琼脂克隆形成实验检测EriB对结直肠癌细胞增殖活力的影响,流式细胞术检测EriB对结直肠癌细胞周期和凋亡的影响,无血清悬浮培养实验检测EriB对结直肠癌细胞干性的影响,Western blot 检测周期、凋亡以及分子机制相关蛋白的表达变化,裸鼠皮下瘤实验体内检测EriB对结肠癌细胞生长增殖的影响,免疫组织化学染色检测小鼠皮下瘤组织Ki67的表达,SynergyFinder用于分析EriB对5-FU抗结直肠癌的协同作用。结果:与对照组相比,EriB处理显著抑制了结直肠癌细胞的存活（P＜0.05或P＜0.001）,抑制干细胞球体数量（P＜0.001）。流式细胞术检测结果表明,与对照组相比,EriB处理组S期和G2期细胞百分比增加（P＜0.001）,细胞凋亡增加（P＜0.001）。Western blot结果显示,EriB处理细胞后,干性相关分子CD44、Sox2、Klf4表达下调,细胞周期相关蛋白CyclinA、Cdk2表达下调,凋亡相关蛋白Cl-PARP、Cl-caspase-3表达上调,Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、TCF4、CyclinD1、c-myc表达下调。EriB与5-FU联合应用,经SynergyFinder分析,ZIP synergy得分大于＋10,有协同作用。裸鼠异种移植瘤模型结果表明,与对照组相比,EriB处理显著抑制肿瘤生长,并减小裸鼠皮下异种移植瘤的体积（P＜0.05）。免疫组织化学分析显示,EriB处理组显著降低了肿瘤组织中Ki67的表达。结论:EriB可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制结直肠癌细胞增殖。     

RNA干扰RhoBTB1表达促进结肠癌HT29细胞增殖、抑制其凋亡的相关研究

目的:探究RNA干扰RhoBTB1基因表达对结肠癌HT29细胞增殖、凋亡的影响。方法:采用Lipofectamine 2000将siRNA RhoBTB1或siRNA NC转入HT29细胞中，实验分为Control组、转染对照组和siRNA Rho组，噻唑蓝（MTT）和流式细胞术分别检测细胞的的活力和凋亡率，蛋白质印迹法（Western Blot）检测细胞中RhoBTB1、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达量。结果:与对照组相比，HT29细胞转染siRNA RhoBTB1后，细胞中RhoBTB1蛋白的表达量显著低于对照组（P<0.05），细胞活力显著升高（P<0.05），凋亡率显著降低（P<0.05），Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平明显降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平显著增加（P<0.05）。结论:RNA干扰RhoBTB1表达促进结肠癌HT29细胞增殖，抑制其凋亡，可能通过调节线粒体凋亡通路相关蛋白的表达量发挥作用。     

沉默ACY-1基因表达对结直肠癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

目的:初步探索氨基酰化酶1（ACY-1）与结直肠癌SW480细胞增殖、凋亡、侵袭的关系以及作用机制。方法:小干扰RNA（siRNA）技术沉默结直肠癌细胞中ACY-1基因的表达,转染至SW480细胞中,分为对照组、si-NC组、si-ACY-1组,荧光实时定量PCR（qRT-PCR）和免疫印迹试验（Western Blot）检测转染效果;用四甲基偶氮唑盐微量（MTT）实验检测干扰ACY-1基因表达对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞的凋亡率,Transwell法检测细胞的侵袭,Western Blot检测Ki-67、Caspase-3、β-连环蛋白（β-catenin）、c-Myc、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的蛋白水平。结果:Western Blot检测结果显示si-ACY-1组细胞中ACY-1蛋白的表达量显著低于对照组（P<0.05）。干扰ACY-1表达显著抑制细胞的增殖（P<0.05）和Ki-67蛋白水平,促进其凋亡（P<0.05）,增加Caspase-3蛋白水平,降低细胞的侵袭能力（P<0.05）。si-ACY-1组细胞中β-catenin、c-Myc、Cyclin D1的蛋白水平显著降低（P<0.05）。结论:沉默ACY-1抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭,诱导其凋亡,其作用与Wnt/β-catenin信号通路及其下游靶基因的激活有关,为结直肠癌的治疗提供新的治疗靶点。     

Circ_0001946靶向miR-671-5p调控Wnt/β-catenin通路对结直肠癌细胞恶性进展的影响

摘 要：［目的］ 探讨circ_0001946对结直肠癌细胞恶性进展的影响。［方法］培养结直肠癌HCT116、SW480、Colo320、HT29细胞和正常结直肠CCC-HIE-2细胞,实时定量PCR检测circ_0001946、miR-671-5p表达量。miRcode和双荧光素酶报告实验分析circ_0001946和miR-671-5p的关系。circ_0001946、miR-671-5p在HCT116细胞中的表达量被上调或下调后,分别检测HCT116细胞生长活性、细胞凋亡率及细胞迁移能力。免疫蛋白印迹法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达。［结果］ HCT116（4.76±0.47）、HT29（2.85±0.57）、SW480（2.75±0.62）、Colo320（3.12±0.68）细胞中circ_0001946表达水平高于CCC-HIE-2细胞（1.24±0.09）（t=7.238、8.129、6.893、6.875,P均<0.05）。下调circ_0001946表达显著降低了HCT116细胞增殖（P<0.05）和迁移能力（P<0.05）,促进了细胞凋亡（P<0.01）; circ_0001946靶向miR-671-5p; circ_0001946表达被上调或miR-671-5p表达被下调后,HCT116细胞增殖和迁移能力显著上升,细胞凋亡率明显降低,Wnt/β-catenin信号通路被激活。［结论］ circ_0001946靶向miR-671-5p激活了Wnt/β-catenin信号通路,促进了结直肠癌细胞恶性进展。     

敲低PRMT5基因表达对胃癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其机制

目的 观察蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）在胃癌细胞中的表达,探讨敲低PRMT5表达水平后对胃癌细胞生物学行为的影响。方法 Western blot检测胃癌细胞系MGC803、SGC7901、MKN45和人胃黏膜上皮细胞GES-1中PRMT5蛋白表达水平,转染siRNA1和siRNA2质粒敲低PRMT5的表达水平,细胞增殖和凋亡实验、Transwell实验分别检测细胞增殖能力、凋亡率和细胞的侵袭能力,Western blot检测β-catenin、Cyclin D1和Bax蛋白表达水平。结果 与GES-1细胞比较,MGC803、SGC7901和MKN45细胞中PRMT5蛋白表达水平增加（P<0.001）。敲低PRMT5表达后细胞的增殖和侵袭能力减弱,凋亡率增加（P<0.05）,β-catenin和Cyclin D1蛋白的表达降低,Bax蛋白的表达增加（P<0.001）。结论 PRMT5在胃癌细胞中表达水平升高,敲低其表达水平后可通过减弱Wnt/β-catenin信号通路转导抑制细胞的增殖和侵袭并促进细胞凋亡。     

上调miRNA-506抑制直肠癌Colo320细胞的增殖和侵袭

目的:探讨微小核糖核酸(miRNA)-506对人直肠癌Colo320细胞增殖和侵袭的影响.方法:构建miRNA-506 模拟物,应用脂质体法转染直肠癌细胞株Colo320.采用逆转录酶链聚合反应(qRT-PCR)法检测各组细胞中miRNA-506的表达水平,CCK-8法检测细胞的增殖情况.Transwell小室检测细胞的侵袭能力.Western blot检测MMP-9的表达.结果:qRT-PCR结果显示,miRNA-506转染组miRNA-506的表达量明显高于空白细胞对照组和阴性对照组(P均<0.05).CCK-8结果显示,上调miRNA-506 抑制Colo320细胞增殖.Transwell结果显示,转染miRNA-506后Colo320细胞的侵袭数目明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05).miRNA-506可以抑制Colo320细胞MMP-9蛋白的表达.结论:上调miRNA-506能抑制人直肠癌Colo320细胞的增殖和侵袭能力.     

下调OTX1的表达抑制直肠癌Colo320细胞的增殖和侵袭

目的:下调直肠癌细胞系Colo320的 Orthodenticle 人同源盒基因1(orthodenticle homeobox 1,OTX1)的表达,观察其对Colo320细胞增殖和侵袭能力的影响.方法:构建OTX1 siRNA重组质粒载体pGPU6-OTX1,并转染Colo320细胞.应用qRT-PCR法检测OTX1的基因表达水平,Western blot法检测OTX1的蛋白表达,CCK-8法检测pGPU6-OTX1对Colo320细胞增殖能力的影响,Transwell小室法检测Colo320细胞侵袭能力的变化.结果:成功将构建的pGPU6-OTX1转染Colo320细胞.qRT-PCR和Western blot结果显示pGPU6-OTX1下调Colo320细胞OTX1的表达,CCK-8结果显示pGPU6-OTX1明显抑制SGC-7901细胞的增殖能力,Transwell结果显示下调OTX1的表达抑制Colo320细胞的侵袭能力.结论:下调OTX1的表达能够抑制直肠癌细胞Colo320的增殖和侵袭能力.     

靶向siRNA对人直肠癌Colo320细胞的抑制作用

目的:利用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制人直肠癌Colo320细胞c-my基因的表达,探讨c-myc基因在人直肠癌Colo320细胞中的作用.方法 :设计人直肠癌Colo320细胞基因特异性小分子干扰RNA,用体外转录方法合成人直肠癌Colo320细胞的小分子干扰RNA并转染该细胞,培养48～96 h后,收集细胞RNA,应用实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中c-myc基因mRNA水平变化,Western blotting检测c-myc表达的蛋白,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和集落形成试验检测细胞增殖活性.结果:转染siRNA后,与对照组相比,实验组pGensil-c-myc-1、2、3、4的c-myc基因mRNA水平明显降低,c-myc的蛋白表达也明显降低.MTT法和集落形成试验检测表明,实验组的细胞增殖速率明显低于对照组.结论:在人直肠癌Colo320 细胞中存在RNA干扰的机制,特异性siRNA能够有效地抑制c-myc基因的表达,从而抑制Colo320 细胞的增殖.     

miR-21通过靶基因ZNF326调控乳腺癌细胞侵袭、迁移的分子机制研究

目的:探讨微小RNA-21（miR-21）靶向锌指蛋白326(ZNF326)对乳腺癌细胞侵袭、迁移的影响及其分子机制。方法:采用qRT-PCR与Western blot法检测乳腺癌细胞株HCC70、MDA-MB-231、BT549、MDA-MB-468与正常细胞株HBL-100中miR-21与ZNF326的表达。以miR-21表达量最高的乳腺癌HCC70细胞为研究对象,分为NC组、anti-miR-con组、anti-miR-21组、pcDNA-control组、pcDNA-ZNF326组;共转染分组为anti-miR-21+si-con组、anti-miR-21+si-ZNF326组。MTT法检测细胞增殖能力,Transwell迁移及侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力。双荧光素酶报告基因系统验证miR-21与ZNF326的靶向调控关系。Western blot法检测CDK1、MMP-2蛋白的表达。结果:与正常细胞株HBL-100相比,乳腺癌细胞株HCC70、MDA-MB-231、BT549、MDA-MB-468中miR-21高表达,ZNF326 mRNA及蛋白表达水平均显著下降;分别与anti-miR-con组、pcDNA-control组比较,anti-miR-21组与pcDNA-ZNF326组HCC70细胞增殖能力显著下降,细胞迁移及侵袭能力明显降低,CDK1、MMP-2的表达水平明显降低;双荧光素酶实验结果表明miR-21能靶向结合ZNF326的3' UTR并调控其表达;与anti-miR-21+si-con组相比,anti-miR-21+si-ZNF326组HCC70细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显增强,促进CDK1、MMP-2表达。结论:miR-21可靶向抑制ZNF326基因的表达,进而促进乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭。     

抑制β-catenin诱导的多发性骨髓瘤细胞自噬与凋亡关系的研究

目的:通过慢病毒介导的siRNA转染沉默β-catenin的表达以证实抑制β-catenin所诱发的细胞自噬与凋亡之间的可能相互关系。方法:培养多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226细胞,应用慢病毒转染的方法沉默β-catenin表达,分别联合自噬抑制剂3-MA及凋亡抑制剂Z-VAD,Western blot检测细胞加药前后β-catenin、自噬相关蛋白LC3及凋亡相关蛋白Caspase-3（active)的表达变化;CCK-8法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:沉默β-catenin后,联合自噬抑制剂3-MA,细胞加药前后β-catenin表达无明显变化,LC3Ⅱ表达降低,Caspase-3（active）表达增高,细胞增殖能力下降,细胞死亡增加;联合凋亡抑制剂Z-VAD,细胞加药前后β-catenin无明显变化,LC3Ⅱ表达增高,Caspase-3（active）表达降低,细胞增殖能力下降,细胞死亡增加。结论:沉默β-catenin所诱发的自噬与凋亡共同促进细胞死亡,自噬和凋亡任一途径受抑,均可使细胞转向另一死亡途径。     

PHA-767491对结直肠癌Colo320细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨PHA-767491对结直肠癌细胞系Colo320细胞增殖和凋亡的影响。方法:配置不同浓度的PHA-767491作用于Colo320细胞，利用CCK-8法检测细胞的增殖能力；流式细胞术Annexin V/PI双染色法检测细胞的凋亡情况。结果:CCK-8结果显示PHA-767491能显著抑制Colo320细胞的增殖能力。流式细胞术检测结果显示PHA-767491能诱导Colo320细胞的凋亡。结论:PHA-767491能够抑制Colo320细胞的增殖并且诱导凋亡。     

miR-21沉默下调β-catenin表达对食管癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨miR-21沉默对食管癌细胞增殖和凋亡的影响及其与β-catenin表达的关系。方法:通过脂质体转染法沉默食管癌Eca9706细胞株中的miR-21,采用荧光定量（RT-PCR）检测miR-21、β-catenin mRNA的相对表达水平;蛋白质印迹法（Western blot）检测β-catenin蛋白的相对表达水平。MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果:转染48 h后,与对照组和NC组相比,miR-21组Eca9706细胞中miR-21、β-catenin mRNA和β-catenin蛋白的相对表达水平均明显降低。MTT检测miR-21组细胞的光密度值（OD值）较对照组和NC组明显下降。与NC组和对照组相比,流式细胞仪检测miR-21组中细胞的凋亡率明显上升,G0/G1期细胞所占比例明显升高,S期细胞所占比例明显下降。结论:沉默miR-21能够通过下调β-catenin的表达来抑制食管癌Eca9706细胞增殖及诱导其凋亡。