A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量测定方法的建立

目的  建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌（meningococcus,Men）多糖疫苗（groups A,C,Y,W135 menignococcal polysaccharide vaccine,MPV4）多糖含量的火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis,RIE)法。方法  分别用A、C、Y、W135群Men菌液、A、C、Y、W135群Men菌液加佐剂、A、C、Y、W135群Men多糖-牛白蛋白结合物免疫家兔,制备特异性抗血清。将制备的抗血清以一定的比例加入琼脂糖凝胶制成平板,并将纯化的多糖作为定量参考品加入抗原孔进行RIE。以多糖含量和对应的RIE峰高作标准曲线并建立直线回归方程。采用优化的RIE法测定MPV4多糖含量和分子大小。结果  菌液加佐剂制备的抗血清效价较理想。在确定的电泳条件下,建立的RIE法制备的标准曲线呈现良好的线性关系,相关系数值均大于0.98。该法特异性较好,未检出各多糖间的交叉反应。采用该法测定3批MPV4多糖含量、分子大小及回收率的结果均与先前的检定结果相符,均符合质控标准。结论  建立的RIE法可作为MPV4多糖抗原含量的测定方法。     

测定脑膜炎球菌疫苗C群多糖的双抗体夹心ELISA法的建立

目的 建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗(groups A,C,Y,W135 meningococcal polysaccharide vaccine,MPV4)C群多糖含量的双抗体夹心ELISA法.  方法 制备抗C群多糖多克隆抗体,所得的多克隆抗体经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后,用过碘酸钠法对其标记辣根过氧化物酶.分别将抗C群多糖多克隆抗体作为包被抗体和酶标二抗,建立双抗体夹心ELISA法,优化反应条件,对C群多糖进行特异性定量测定.  结果 建立的双抗体夹心ELISA法特异性较好,未检出与A、Y、W135群多糖的交叉反应.C群多糖在2.5～20.0 ng/ml质量浓度范围的剂量反应曲线线性最佳,相关系数大于0.99.该法的准确度和精密度均较好,试验内和试验间变异系数和多糖回收率分别为0.6％ ～9.1％和87.5％ ～ 100.0％,定量限度为4.0 ng/ml.采用该法测定3批MPV4显示,C群多糖含量及多糖分子大小KD值和回收率的测定结果均与先前的测定结果一致,均符合暂行质量标准.  结论 建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4 C群多糖的关键质量指标测定.     

单克隆抗体在肺炎球菌多糖疫苗多糖含量检测中的应用

 目的  考察能否用单克隆抗体（单抗）替代多克隆抗体（多抗）血清检测23价肺炎球菌多糖疫苗中各型多糖的含量。方法   使用8个血清型（2、3、4、6B、9N、17F、18C、23F）的小鼠抗肺炎球菌荚膜多糖单抗和丹麦国家血清研究所（Statens Serum Institut, SSI）的兔血清多抗,以速率散射免疫浊度法测定23价肺炎球菌多糖疫苗中相应血清型的多糖含量。通过重复性和专属性试验确定单抗的可用性。采用t 检验对单抗和多抗测定结果进行比较。结果   各型单抗与多糖标准品反应标准曲线的相关系数均>0.985 0。用单抗重复检测疫苗多糖3次,质量浓度为40.8～62.1 μg/ml,3次检测结果变异系数均<8.00%。各型多糖回收率为81.6%～124.2%。分别用8个血清型单抗检测其余各型多糖含量,结果均低于或接近于检测下限。单抗与SSI多抗血清的检测结果差异均无统计学意义,t 值为0.210 3～1.926 0,P 值均>0.05。结论   单抗检测重复性好、特异性高,与多抗血清检测结果相仿,因此,单抗可以替代SSI多抗血清用于测定23价肺炎球菌多糖疫苗中的多糖含量。     

14型肺炎球菌多糖双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的  建立并验证测定14型肺炎球菌多糖（pneumococcal capsular polysaccharide serotype 14，PS14）浓度的双抗体夹心ELISA。方法  采用Protein G亲和层析纯化兔血清，得到兔抗PS14多克隆抗体（多抗）。以鼠抗PS14单克隆抗体（单抗）为捕获抗体，兔抗PS14多抗为检测抗体，碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG为二抗，PS14为参考品建立双抗体夹心ELISA法。确定鼠抗PS14单抗和兔抗PS14多抗的工作浓度，建立标准曲线，并验证该方法的准确性、精密度和特异性，考察佐剂对该方法的影响。结果  鼠抗PS14单抗的最适工作浓度为5 μg/ml，兔抗PS14多抗的最适工作浓度为1 μg/ml，标准曲线的范围为9.375 ~ 600.000 ng/ml，线性良好，相关系数为0.999。测定多糖样品的PS14回收率为110% ~ 140%，多糖蛋白结合物样品的PS14回收率为90% ~110%。平均批内和批间精密度分别是5.64%和7.14%。13价结合物混合样品的PS14回收率为85% ~100%；含有佐剂的疫苗样品的PS14回收率为85% ~110%。结论  成功建立了双抗体夹心ELISA法，该方法准确性、精密度、特异性良好，且检测结果不受佐剂的影响，具有一定耐用性。     

检测脑膜炎球菌多糖疫苗Y群多糖含量和分子大小的双抗体夹心ELISA法的建立和初步应用

目的建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗（groupsA，C，Y，W135meningococ—calpolysaccharidevaccine，MPV4）Y群多糖含量的双抗体夹心ELISA法。方法采用杂交瘤技术制备抗Y群多糖单克隆抗体，并通过过碘酸钠法用辣根过氧化物酶标记单克隆抗体。分别以抗Y群多糖不同位点的单克隆抗体作为包被抗体和酶标二抗，通过优化反应条件来建立双抗体夹心ELISA法，同时进行方法学验证。结果建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好，未检出与A、C、W135群多糖的交叉反应。Y群多糖在2．5～20．0ng／ml范围的剂量反应曲线呈现最佳线性关系，相关系数〉0．99。该法的试验内和试验间准确度较好，精密度较佳，定量限度为4ng／ml。采用该法测定3批MPV4Y群多糖显示，Y群多糖的含量、多糖分子大小‰值和回收率的结果均与先前的检定结果一致，符合暂行质量标准。结论建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4Y群多糖的关键质量指标测定。     

ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的研制

目的 通过研究冷酚与粗糖的混合比例、粗糖提纯时的质量浓度和乳糖保护剂的用量来制备符合规定的ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗.方法 发酵细菌,提取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖粗制品,以不同的纯化工艺纯化A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖.将4种纯化的多糖原液按一定比例混合,加入乳糖作为保护剂,冷冻干燥制成ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗.结果 通过比较不同纯化工艺制备的多糖,确定最佳提纯条件为多糖与冷酚的体积比为1∶1,粗糖提纯时的质量浓度为6 g/L.检测按此纯化条件制备的ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗显示,3批疫苗的水分含量分别为1.7％、2.0％和2.1％,疫苗的A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖含量和回收率分别都≥50 μg/剂和80％,符合相关规定的要求.结论 按确定的工艺成功制备ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗.     

层析法提纯A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖工艺的建立

目的 建立A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖层析纯化工艺。方法 采用陶瓷羟基磷灰石和DEAE Sepharose FF层析柱，在PBS体系中纯化A群多糖。以0.5%脱氧胆酸钠预处理C群多糖，用陶瓷羟基磷灰石层析柱在PBS体系中纯化C群多糖。以含有脱氧胆酸钠的平衡缓冲液溶解Y和W135群多糖，再用Capto Adhere和Capto DEAE层析柱串联纯化。纯化的多糖经Sephadex G-25 Medium层析柱脱盐后冻干，按中国药典2015年版三部的要求进行检定。结果  经过层析纯化，A、C、Y、W135群多糖的蛋白质含量分别降至3.7、4.2、5.4和5.3 mg/g，核酸含量分别降至1.2、3.0、1.1和0.8 mg/g，均符合药典要求。此外，磷、唾液酸和O-乙酰基含量等指标亦均符合药典标准。结论 建立了A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖的层析纯化工艺。     

三磷酸胞苷二钠的简易快速测定法

目的建立一种利用琼脂糖凝胶检测三磷酸胞苷二钠（CTP）的方法。方法用琼脂糖凝胶电泳法及紫外分光光度法测定CTP含量。结果CTP质量浓度在6—16mg／mL范围内与吸收度线性关系良好，r=0．9990，平均回收率为98．34％，RSD=0．9％（n=9）。结论琼脂糖凝胶电泳法操作简单、电泳速度快、检测成本低，可用于CTP生产过程中发酵、离子交换树脂洗杂及洗脱的终点控制。     

竞争ELISA法测定19A型肺炎链球菌发酵物中的多糖含量

 目的  建立检测19A型肺炎链球菌荚膜多糖的竞争ELISA方法,检测细菌发酵过程中多糖的表达量。方法   以19A型肺炎链球菌多糖为包被物,待测多糖为竞争物,建立间接竞争ELISA方法,并验证该方法的准确性和精密度。用建立的方法检测不同培养条件下发酵物中的多糖表达量。 结果   最佳多糖包被质量浓度为10 mg/L,多糖抗血清稀释度为1：4×104。当检测范围为39.06~5 000.00 μg/L时,决定系数为0.995。批内和批间相对标准差分别为5.08%~9.58%和5.28%~12.93%。培养物样品加标回收率为95.84%~110.07%。两种不同培养条件下培养物中的多糖表达量分别为312.17 mg/L和1 056.42 mg/L。 结论  新建的方法能用于19A型肺炎链球菌发酵物中多糖表达量的检测,对于优化培养条件及掌握培养物收获时间具有指导意义。     

火箭免疫电泳法定量检测4价脑膜炎球菌多糖疫苗中C群脑膜炎球菌多糖含量的方法学验证

目的 验证用火箭免疫电泳法(rocket immunoelectrophoresis,R1E)检测4价脑膜炎球菌多糖疫苗(tetravalent serogroup A／C／W135／Y meningDcoccal polysaccharide vaccine,MPV4)中C群多糖含量的可靠性。方法 以系列浓度的C群多糖溶液为标准,采用RlE对MPV4中C群多糖含量迸行重复测定。结果 最佳线性范围为30～86 mg／L,相关系数(r)均大于0.985;MPV4与C群多糖参比品的剂量反应曲线之间具有良好的平行性;在精密度试验中,试验内CV为6.08％～8.07％,试验间Cy为7.24％～9.19％;A、W135和Y群多糖及乳糖不引起非特异性免疫反应。结论 本法的线性、精密度和专属性均符合验证要求,可作为定量检测MPV4中C群多糖含量的方法。     

酶标仪法测定微孔板发酵液中林可霉素

目的 建立酶标仪法测定微孔板发酵液中林可霉素的含量。方法 对酶标仪法的主要影响因素进行优化,并验证此 方法的精密度;在此基础上,分别利用酶标仪法与分光光度计法测定 25 株突变株经 48 孔板发酵后林可霉素的含量并进行曲线 拟合,以验证两种方法的相关性。结果 确定了在测定林可霉素含量的适宜反应体系中 0.02mol/L 氯化钯溶液为 150μL,盐酸添 加浓度为 1mol/L,且该方法精密度良好;拟合曲线相关系数 R2 =0.9551,显示两种方法具有很好的相关性。结论 该实验结果表 明酶标仪法能准确、快速地测定微孔板发酵液中林可霉素的含量,为后续高通量选育林可霉素高产菌株奠定了基础。     

紫外分光光度法快速测定庆大霉素 C1a 含量在高通量筛选中的应用

目的 探索庆大霉素 C1a 含量的快速检测方法,实现诱变菌株的高通量筛选。方法 以紫外分光光度法作为检测庆 大霉素 C1a 含量的手段,对庆大霉素 C1a 单组分生产菌株进行 ARTP、LiCl、微波和 ARTP+LiCl 诱变,通过高通量筛选获得高产 菌株,并在 5L 发酵罐中对高产稳定性菌株进行验证。结果 紫外分光光度法和高效液相色谱法对发酵液中庆大霉素 C1a 含量进 行测定,最大相对误差为 3.98%;筛选获得了 10 株高产菌株,其中 AL324 菌株与出发菌株相比,摇瓶效价提高了 52%;通过稳 定性传代实验,获得了 4 株高产稳定性菌株。5L 发酵罐验证实验表明 AL324 与出发菌株相比效价提高了 81.3%。结论 紫外分 光光度法可以快速检测发酵液中庆大霉素 C1a 含量,该方法应用于高通量筛选中,获得了高产菌株,筛选结果表明 ARTP+LiCl 复合诱变方法的正突变率较高,是一种有效的庆大霉素 C1a 高产菌株诱变方式。     

红曲霉粗多糖的提取及含量测定

目的:从红曲霉发酵液和菌丝体中提取粗多糖并测定多糖含量。方法:将红曲霉发酵液和菌丝体用水提醇沉法提取粗多糖,用苯酚-硫酸法测定红曲霉多糖的含量。结果:红曲霉粗多糖中多糖含量为62.87%,平均回收率为99.35%,RSD=1.44%。结论:本实验方法可以提取出红曲霉多糖,多糖含量测定准确,苯酚-硫酸法可作为红曲霉多糖含量的测定方法。     

苯酚提取法对A群脑膜炎球菌多糖中细菌内毒素含量的影响

目的  研究苯酚提取法对A 群脑膜炎球菌多糖料液中细菌内毒素含量的影响。方法  用苯酚对A 群脑膜炎球菌多糖料液进行提取，比较粗制多糖不同溶解倍数、苯酚提取过程中采用不同搅拌转数、提取次数、提取温度等因素对多糖细菌内毒素含量的影响。  结果  粗制多糖采用4.5%醋酸钠溶液1∶100（质量体积比）溶解后进行苯酚提取的多糖细菌内毒素含量最低。同时，综合考虑多糖料液中蛋白含量、多糖回收率的检定结果，确定用苯酚进行提取的最佳条件为搅拌转数为400 转/min，提取次数为3次，温度为13～15 ℃，可有效降低多糖料液中细菌内毒素的含量。  结论  苯酚提取法可明显降低A 群脑膜炎球菌粗制多糖料液中的细菌内毒素含量。     

5型肺炎球菌荚膜多糖纯化工艺的建立与优化

目的 建立一种应用脱氧胆酸钠沉淀和离子交换色谱技术纯化5型肺炎球菌荚膜多糖的方法。方法  5型肺炎球菌发酵液经离心、超滤、脱氧胆酸钠沉淀处理后,再经过Capto Q离子交换层析,得到精制多糖原液。依据中国药典2020年版三部的相关制检规程对精制多糖原液进行检定分析。结果  发酵液中蛋白质和核酸杂质去除率分别达到97.0%和99.9%以上,糖醛酸含量不低于18.4%,氨基己糖含量不低于22.7%,各项指标均符合中国药典标准;且多糖收率达到60.0%以上。结论  建立的5型肺炎球菌荚膜多糖纯化工艺可替代使用乙醇或苯酚的工艺,且操作步骤简便,具有很好的规模化应用前景。     

达托霉素高产菌株选育及发酵条件优化

目的 通过对达托霉素产生菌进行诱变选育,并对其发酵条件优化,以提高其达托霉素发酵水平,降低生产成本。方法 以玫瑰孢链霉菌(DT-9#F2)为出发菌株,分别采用紫外诱变、微波诱变、LiCl诱变及复合诱变并结合链霉素抗性筛选进行菌株选育,同时,对其发酵培养基中氮源、碳源及生长因子进行优化,以进一步提高其发酵产量。结果 得到一株达托霉素高产突变株DT-37,其摇瓶发酵产量达到12.2mg/L,较出发菌株提高20.79%;优化后的发酵培养基为：酵母粉(YP300)1.65%、FeSO4 0.043%、葡萄糖1.50%、玉米淀粉7.20%、糖蜜0.72%,VB12 1.50μg/mL、硫辛酸5.00μg/mL。其摇瓶发酵产量达到30.56mg/L,较初始培养基提高了297.92%。经100L发酵罐上放大验证,达托霉素的产量达到了2872mg/L,较优化前提高了14.88%。结论 紫外、微波及LiCl复合诱变后经抗生素抗性筛选,结合发酵培养基优化,可有效提高菌株的达托霉素发酵产量。     

达托霉素高产菌株选育及发酵条件优化

目的 通过对达托霉素产生菌进行诱变选育,并对其发酵条件优化,以提高其达托霉素发酵水平,降低生产成本。方法 以玫瑰孢链霉菌(DT-9#F2)为出发菌株,分别采用紫外诱变、微波诱变、LiCl诱变及复合诱变并结合链霉素抗性筛选进行菌株选育,同时,对其发酵培养基中氮源、碳源及生长因子进行优化,以进一步提高其发酵产量。结果 得到一株达托霉素高产突变株DT-37,其摇瓶发酵产量达到12.2mg/L,较出发菌株提高20.79%;优化后的发酵培养基为：酵母粉(YP300)1.65%、FeSO4 0.043%、葡萄糖1.50%、玉米淀粉7.20%、糖蜜0.72%,VB12 1.50μg/mL、硫辛酸5.00μg/mL。其摇瓶发酵产量达到30.56mg/L,较初始培养基提高了297.92%。经100L发酵罐上放大验证,达托霉素的产量达到了2872mg/L,较优化前提高了14.88%。结论     

Statistical optimization of a multivariate fermentation process for enhancing antibiotic activity of Streptomyces sp. CS392

Antibiotic activity against various gram positive bacteria including Staphylococcus aureus and Enterococcus was ascertained from a soil-isolated microbial strain Streptomyces sp. CS392. The antibiotic activity of the strain was maximized by using a dual-stage, multivariate statistical optimization framework based on the response surface methodology considering a lab-scale fermentation process. Multiple nutrient constituents of the fermentation broth were jointly optimized in the first stage, while the fermentation culture conditions were optimized in the subsequent stage. Based on the empirical models derived from the dual-stage statistical optimization framework, 39.79 % of cumulative enhancement in the antibiotic activity was obtained (analytically) at the concurrent optimal settings (Optimal nutrient composition for the first stage of optimization: 29.82 glucose, 7.6 peptone, 4.678 MgCl₂ and 0.5005 g/l casamino acid; and optimal fermentation condition for the second stage of optimization: incubation period 47.55 h; incubation temperature 29.15 °C; and pH 8.36). The analytically depicted enhancement in the antibiotic activity was validated experimentally.