兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻兔角膜缘干细胞体外培养方法。方法 分别用20％小牛血清营养液和20％胎牛血清营养液兔角膜缘干细胞行体外培养，观察细胞贴壁生长情况；同时对生长良好的原代细胞进行消化传代，进一步观察传代细胞的形态和生长情况。结果 20％胎牛血清营养液组，角膜缘干细胞在培养48－72h有80％贴壁生长，7－10天形成良好单层，细胞呈圆形、卵圆形或多边形，类似角膜上皮细胞；传代培养细胞形态仍正常，生长良好，但混有成纤维细胞。20％小牛血清营养液培养72h，仅有20％细胞贴壁生长，且细胞形态极不规则，有细胞“拉网”现象，培养14天仍未形成单层。结论 角膜缘干细胞的培养较常规细胞培养难，需要特殊培养基。20％胎牛血清营养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。     

人角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨人自体角膜缘干细胞（LSCs）体外培养及鉴定的方法。方法将供体新鲜人角膜缘组织在制备的含20％胎牛血清DMEM／F12培养基的羊膜载体上应用组织块培养法进行体外培养,对培养获得的LSCs用苏木精-伊红染色在倒置显微镜下进行形态学观察,用免疫荧光技术鉴定培养的LSCs细胞。结果组织块静置2h后贴壁良好,3～4d细胞从组织块边缘荫出,7～10d细胞出现生长高峰,12～14d形成良好的细胞单层。细胞形态呈多边彤、圆形、卵圆形和梭形。第14天时行间接免疫荧光染色,可见大量细胞表达p63,呈细胞质的绿色荧光;少量细胞表达AE5,呈细胞质的绿色荧光和细胞核的红色荧光。结论组织块培养法体外培养的人LSCs具有与正常人LSCs相一致的生物学特性。     

角膜缘干细胞培养后移植的研究进展

眼表的许多疾病都是由于角膜缘干细胞功能障碍引起，角膜缘干细胞培养后移植是治疗角膜缘干细胞功能障碍的有效手段。本文将对培养的角膜缘干细胞移植的材料，角膜缘干细胞培养后自体和异体移植以及移植术后的处理等方面的研究作一简要综述。     

不同诱导剂对体外角膜缘干细胞培养的影响

眼表重建常用的羊膜移植或自体角膜缘干细胞移植的方法,对眼表组织损伤过大,且对眼表自身干细胞缺乏者临床效果较差。我们常采用体外培养自体角膜缘干细胞后联合生物载体进行眼表移植重建。本实验对兔角膜缘干细胞进行体外培养,观察不同的诱导环境对于细胞最终的繁殖分化的影响。     

角膜缘干细胞培养及研究进展

角膜缘干细胞是一种特殊类型的细胞,位于角膜缘基底上皮层,在角膜上皮更新和创伤愈合中起重要作用。对于角膜缘干细胞缺乏或功能障碍的疾病,培养角膜缘干细胞进行移植将是一种重要且有效的治疗方法。对角膜缘干细胞的生物学特性和解剖定位、影响培养的干细胞增殖的调控因素、培养的角膜缘于细胞移植、移植所需载体的选择等方面的研究进展作一综述。     

培养角膜干细胞羊膜片移植治疗角膜缘功能障碍

目的：临床观察培养的角膜干细胞羊膜移植片治疗角膜缘功能障碍的效果。方法：人角膜缘干细胞原代培养后接种生长于羊膜上,临床选择角膜缘烧伤后（碱烧伤、酸烧伤、其他化学烧伤等）,角膜新生血管的患者进行干细胞羊膜片移植,术后观察角膜上皮、组织浸润和新生血管情况。结果：术后患者自觉症状轻,视力有一定提高,角膜缘移植片紧密贴附,角膜上皮完整,轻度基质炎性浸润,浅层新生血管减少,深层新生血管充盈减轻,睑球粘连得到     

羊膜移植对碱烧伤大鼠角膜缘干细胞的影响

目的观察羊膜移植对碱烧伤大鼠角膜缘干细胞的影响。方法SD大鼠40只制作眼碱烧伤模型,单眼行眼碱烧伤;随机选取20只大鼠（20眼）为实验组,20只大鼠（20眼）为对照组;实验组行新鲜羊膜移植,对照组不处理,观察大鼠眼表情况。并于术后1周、2周、3周、4周取角膜缘组织,采用免疫组化技术观察p63蛋白在角膜缘干细胞的表达情况。结果p63在实验组和对照组的角膜缘干细胞中均有表达,位于角膜缘上皮细胞基底层的细胞核内。但实验组明显高于对照组,两者比较有统计学意义（P〈0．05）。且随着烧伤时间的延长,p63的表达呈线性下降趋势。结论眼碱烧伤后行羊膜移植,能促进角膜缘干细胞的增生、分化,利于角膜上皮的修复。     

培养角膜缘干细胞羊膜移植治疗碱烧伤动物的实验研究

目的 观察培养生长于羊膜的角膜缘干细胞移植的治疗角膜缘碱烧伤伤的效果。方法 将兔角膜缘干细胞在的代培养后接种于羊膜,对新西兰大白兔角膜缘碱烧伤动物模型行角膜缘干细胞羊膜移植术,并对治疗后的角膜进行临床及病理学检查。结果 体外培养的兔角膜缘士细胞可在羊膜上继续增殖、分化为密集的角膜上皮细胞层;角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮完整基质细胞浸润减轻、新生血管减少。组织病理学染色证实,角膜缘     

羊膜培养兔角膜缘上皮细胞及自体移植--角膜缘干细胞缺损的治疗

目的　探讨以人羊膜为载体培养兔角膜缘上皮细胞及其自体移植治疗全角膜缘干细胞缺损。方法　在8只兔右眼用正庚醇脱上皮和角膜缘环切的方法构建全角膜缘干细胞缺损模型2月。其中6只兔为实验组,活体取左眼角膜缘浅层小块,置羊膜上常规和气_液培养42天后进行自体移植治疗右眼角膜缘干细胞缺损;2只兔为对照组,直接用解冻无细胞人羊膜移植治疗右眼角膜缘干细胞缺损。进行细胞和术眼活体观察、组织学观察和电镜观察。结果　角膜缘上皮细胞在羊膜上生长良好,形成复层,细胞间的联结结构存在,细胞与羊膜组织粘附牢固。实验组移植手术后角膜迅速上皮化,恢复角膜表面光滑和透明,组织学观察和电镜观察呈现生理角膜上皮层的结构特点。但眼睑闭合不全可导致手术失败。对照组术后出现角膜缘干细胞缺损导致的角膜病变。结论　以羊膜为载体培养角膜缘上皮细胞后自体移植可有效地治疗角膜缘干细胞缺损导致的角膜病变。     

角膜缘干细胞体外培养的研究进展

角膜缘干细胞是位于角膜缘Vogt栅栏区的一种成体单能干细胞,其可通过自我更新以补充角膜上皮的损伤修复,在维持正常角膜上皮完整性、角膜透明度以及维持正常视力中发挥着重要作用。各种原因造成的角膜缘干细胞缺失将导致患者角膜混浊、眼表血管化,最终失明,目前治疗相关疾病的主要方法为体外培养角膜缘干细胞后再行移植治疗,其中如何高效地体外扩增角膜缘干细胞成为治疗成功与否的关键,本文就角膜缘干细胞定位、获取方法以及体外扩增方式等进行综述。     

角膜缘niche细胞与基质细胞维持角膜缘干细胞功能的对比研究

目的比较角膜缘niche细胞(limbal niche cells,LNCs)与角膜缘基质细胞(limbal stromal cells,LSCs)在维持角膜缘干细胞功能上的不同特性。方法将LNCs和LSCs分别从6个角膜缘组织分离,并在相同的条件下培养、传代。LNCs与LSCs经丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)处理后分为LNCs组与LSCs组作为饲养细胞分别与角膜缘干细胞共培养,比较两组角膜缘干细胞克隆形成率(colony-forming efficiency,CFE)、上皮细胞复层化以及细胞标志物和部分基因的表达。结果 LNCs组角膜缘干细胞CFE(6.57±1.54)%高于LSCs组(1.43±0.47)%。LNCs组细胞复层上皮数(4～5层)多于LSCs组(2～3层)。角膜缘干细胞克隆与免疫荧光染色及mRNA半定量分析结果显示,LNCs组比LSCs组表达了更多干细胞标志物ΔNp63,能更有效地维持角膜缘干细胞的细胞特性。逆转录PCR分析结果显示,LNCs组与LSCs组都分泌了一些维持角膜缘干细胞生长的生长因子,但LNCs组比LSCs组高表达上皮型钙黏蛋白(E-cad...     

体外兔胚胎成纤维细胞为饲养层克隆兔角膜缘干细胞

目的研究兔胚胎成纤维细胞体外克隆兔角膜缘干细胞。方法兔胚胎成纤维细胞经丝裂霉素C(MMC)处理成饲细胞,用消化法培养兔角膜缘基底层细胞并接种于含有经MMC处理饲细胞的12孔培养板,进行原代培养。观察其光镜特征、电镜结构,用间接免疫细胞化学染色等对克隆的细胞进行综合鉴别。结果克隆的细胞呈典型的上皮细胞形态,电镜下可见微绒毛、桥粒、张力丝等典型上皮细胞结构,单克隆抗体AE1、PCNA染色后细胞大多数阳性,单克隆抗体AE5染色后细胞染色偶见阳性。结论体外兔胚胎成纤维细胞为饲养层成功地克隆出兔角膜缘干细胞。     

兔角膜缘干细胞体外壳聚糖共混膜上培养的形态学观察

目的 探讨壳聚糖作为兔角膜缘干细胞体外培养载体的可行性。方法 应用消化培养法在壳聚糖材料上对兔角膜缘细胞进行原代培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，并在电子显微镜下观察壳聚糖的结构以及第7d时细胞的形态。结果 壳聚糖呈现三维多孔结构相互连接成网状，孔径直径大小约90μm，其上有细胞生长，7d左右形成单层次，9d后细胞培养开始出现老化现象。结论 壳聚糖上可成功地对兔角膜缘组织进行原代培养，可用作组织工程角膜的载体材料。     

角膜缘干细胞克隆化培养影响因素的研究

目的探讨丝裂霉素C处理Swiss3T3成纤维细胞作为饲细胞的条件,了解兔角膜缘干细胞克隆化培养的增殖状况。设计对照实验研究。研究对象兔角膜缘干细胞单纯培养组,兔角膜缘干细胞与Swiss3T3成纤维细胞作为饲细胞的混合培养组。方法采用DMEM/F12培养基进行细胞培养,观察4.0μg/ml丝裂霉素C作用不同时间后3T3细胞数量的变化。DispaseⅡ酶消化兔角膜缘上皮细胞,与饲细胞混合接种,观察干细胞克隆形成情况,比较各代、各组的细胞克隆形成率(CFE)。用EDTA去除饲细胞,间接免疫荧光染色检测角膜缘干细胞克隆团表达增殖细胞核抗原(PCNA)情况。主要指标细胞数/毫升,细胞克隆形成率。结果4.0μg/ml丝裂霉素C处理2.5小时的Swiss3T3细胞,培养期间(约12日)细胞数量无明显变化,可作为饲细胞。与饲细胞共同培养的兔角膜缘干细胞形成细胞克隆团,细胞的平均CFE比较:有饲细胞组角膜缘干细胞明显高于无饲细胞组(t=2.982,P<0.01)。兔角膜缘干细胞冻存复苏后平均CFE比较,有饲细胞组明显高于无饲细胞组(t=3.007,P<0.01)。兔角膜缘干细胞克隆团中细胞PCNA染色为阳性。结论角膜缘干细胞与作为饲细胞的Swiss3T3成纤维细胞共同培养形成细胞克隆,其中含有干细胞,且具有高增殖力。     

供体因素对人角膜缘干细胞培养影响的研究

目的观察供体年龄及角膜新鲜程度对人角膜缘干细胞体外培养的影响。方法168例人角膜，按年龄分为A、B、C三组：按供体死亡至被培养的时间分为新鲜组和陈旧组。采用组织块培养法进行细胞培养，观察各组细胞开始生长时间及培养生长率。结果细胞开始生长时间及培养生长率在不同年龄组之间差异无显著性意义；但在较新鲜组与陈旧组之间差异有显著性意义；组织越新鲜，细胞生长越快，生长率越高。结论选取较新鲜的供体(≤8天)进行培养可获得好的培养效果，而不需过多考虑年龄因素。     

Transplantation of tissue-engineered human corneal epithelium in limbal stem cell deficiency rabbit models

AIM: To evaluate the biological functions of tissue-engineered human corneal epithelium (TE-HCEP) by corneal transplantation in limbal stem cell deficiency (LSCD) rabbit models. METHODS: TE-HCEPs were reconstructed with DiI-labeled untransfected HCEP cells and denuded amniotic membrane (dAM) in air-liquid interface culture, and their morphology and structure were characterized by hematoxylin-eosin (HE) staining of paraffin-sections, immunohistochemistry and electron microscopy. LSCD models were established by mechanical and alcohol treatment of the left eyes of New Zealand white rabbits, and their eyes were transplanted with TE-HCEPs with dAM surface outside by lamellar keratoplasty (LKP). Corneal transparency, neovascularization, thickness, and epithelial integrality of both traumatic and post transplantation eyes were checked once a week by slit-lamp corneal microscopy, a corneal pachymeter, and periodic acid-Schiff (PAS) staining. At day 120 post surgery, the rabbits in each group were sacrificed and their corneas were examined by DiI label observation, HE staining, immunohistochemistry and electron microscopy. RESULTS: After cultured for 5 days on dAM, HCEP cells, maintaining keratin 3 expression, reconstructed a 6-7 layer TE-HCEP with normal morphology and structure. The traumatic rabbit corneas, entirely opaque, conjunctivalized and with invaded blood vessels, were used as LSCD models for TE-HCEP transplantation. After transplantation, obvious edema was not found in TE-HCEP-transplanted corneas which became more and more transparent, the invaded blood vessels reduced gradually throughout the monitoring period. The corneas decreased to normal thickness on day 25, while those of dAM eyes were over 575μm in thickness during the monitoring period. A 4-5 layer of epithelium consisting of TE-HCEP originated cells attached tightly to the anterior surface of stroma was reconstructed 120 days after TE-HCEP transplantation, which was similar to the normal control eye in morphology and structure. In contrast, intense corneal edema, turbid, invaded blood vessels were found in dAM eyes, and no multilayer epithelium was found but only a few scattered conjunctiva-like cells appeared. CONCLUSION: The TE-HCEP, with similar morphology and structure to those of innate HCEP, could reconstruct a multilayer corneal epithelium with normal functions in restoring corneal transparency and thickness of LSCD rabbits after transplantation. It may be a promising HCEP equivalent for clinical therapy of corneal epithelial disorders.     

体外培养不同代角膜缘干细胞特性分析

目的比较不同代角膜缘干细胞的生物学特性,为角膜缘细胞移植在临床中的氉应用提供依据。方法组织块培养法体外培养角膜缘干细胞,光镜观察、HE染色和免疫荧光染色分析原代、第1代和第2代角膜缘细胞形态学特性;流式细胞技术定量检测原代、第1代和第2代角膜缘细胞ABCG2表达;MTT比色法测定体外培养原代、第1代和第2代角膜缘干细胞的增殖活性变化。结果倒置相差显微镜下可见原代细胞培养24h有单个细胞从组织块边缘迁出,48h细胞局部可见拉网样生长趋势,72h出现大片细胞,细胞呈现多边形或多角形,96h细胞几乎铺满整个培养板。随着传代次数的增加,细胞形态变得不规则,CK3单克隆抗体表达阳性率逐渐增强;p63单克隆抗体原代和第1代细胞间表达阳性率无明显差别,第2代细胞表达量明显减弱。流式细胞检测显示原代、第1代和第2代细胞ABCG2表达阳性率分别为13.41%、22.96%和4.43%。MTT结果显示随传代次数增加细胞增殖活性逐渐下降。结论原代和第1代角膜缘干细胞可以作为制备组织工程角膜上皮细胞膜片的较理想种子细胞。     

以羊膜为底物培养鸡角膜缘上皮细胞的实验研究

目的为眼表面重建术提供良好的移植材料。方法用胰酶及EDTA消化法去除羊膜上皮将消化、离心获得的鸡角膜缘上皮细胞调成1×107/mlDMEM悬液,接种在6孔培养板底的羊膜基底膜面,放人37℃,5％CO2孵箱培养。结果48h羊膜上培养细胞形成单层,较培养板上培养的同种细胞小,细胞表面的微绒毛及侧面足状突丰富,立体感明显。结论以羊膜基底膜为底物培养的鸡角膜缘上皮细胞可以着床生长并形成完整的单层上皮,为眼表重建使用羊膜及基底膜面培养的角膜上皮细胞提供了实验材料。同时表明羊膜在体外也可以促进鸡角膜缘上皮细胞生长。     

翼状胬肉手术中羊膜移植与自体角膜缘干细胞移植的效果对比

目的观察翼状胬肉手术中羊膜移植术与自体角膜缘干细胞移植的临床疗效。方法翼状胬肉70例（76眼）,均在手术显微镜下切除。其中羊膜移植组40例（42眼）,自体角膜缘十细胞移植组30例（34眼）。术后随访观察12～18月。结果羊膜移植组有4眼复发,复发率为9．52％,自体角膜缘干细胞移植组有3眼复发,复发率8．82％。结论羊膜移植与角膜千细胞移植在治疗翼状胬肉中的疗效相近。