MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路抑制剂在诱导恶性黑色素瘤细胞凋亡中的协同作用

目的 通过联合抑制MEK和 AKT 信号通路关键靶点分子,探讨克服细胞耐药性的靶向治疗方法。 方法 体外培养和新鲜分离恶性黑色素瘤细胞株,分别在0.5%和5%血清浓度下单独或同时抑制靶点MEK（U0126, 20 μmol/L）和AKT（LY294002, 20 μmol/L）,MTT法检测细胞增殖,PI染色流式细胞术检测细胞凋亡情况。 结果 当培养液血清浓度从0.5%提高到5%时,U0126和LY294002对肿瘤细胞增殖的抑制效应明显降低。LY294002以抑制细胞增殖为主,U0126主要诱导细胞凋亡,二者作用效果与细胞是否具备该通路关键靶点活化变异无关。联合用药时诱导细胞凋亡普遍增强,LY294002和U0126具有协同效应。 结论 联合抑制MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路可较好地克服恶性黑色素瘤细胞的耐药性。     

苦参碱联合LY294002对人髓系白血病K562细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的 探究苦参碱（Mat）联合LY294002对人髓系白血病K562细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及可能机制。方法 采用CCK-8法检测不同浓度Mat单药和联合LY294002对K562细胞增殖的影响;将K562细胞分为对照组、Mat组、LY294002组和Mat+LY294002组,分别采用0.4 g/L Mat及10μmol/L LY294002单独或联合干预48 h后,应用光学显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术annexinⅤ-FITC/PI双标记检测细胞凋亡,PI单标记检测细胞周期变化,Western blot法检测Mat联合LY294002对K562细胞p-mTOR、p-PI3K、Akt、p-Akt、CyclinD1、Bcl-2、Caspase-9蛋白表达的影响。结果 CCK-8结果显示,不同浓度Mat单药和联合LY294002均可抑制K562细胞的增殖,具有时间和浓度依赖性,且联合组增殖抑制率比单药组明显升高（P<0.01）。形态学检查显示,联合用药组比单药组凋亡表现更明显。流式细胞结果显示,与对照组及单药组相比,联合组显著促进细胞凋亡[（42.50±2.63）%,P...     

芹菜素通过AMPK/mTOR通路调控肺癌A549细胞自噬

目的 探讨芹菜素（APG）对肺癌A549细胞增殖及自噬的影响及其与AMPK/mTOR通路的关系。方法 体外培养肺癌A549细胞,采用CCK-8法检测不同浓度芹菜素处理A549细胞不同时间后对细胞增殖的影响。后续实验分为空白对照组(0 μmol/L APG),低、中、高浓度实验组和抑制剂组5组,采用MDC染色法检测各组对细胞自噬的影响,免疫印迹法检测自噬相关蛋白以及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达情况。结果 芹菜素可显著抑制A549细胞增殖,且呈浓度依赖性（P<0.05）;20、40、80 μmol/L芹菜素组随作用时间延长,对A549细胞的增殖抑制率逐渐增加,呈时间依赖关系（P<0.05）。与空白对照组比较,实验组A549细胞中含高亮点状荧光的自噬小泡数量及IOD值逐渐增加（P<0.05）,芹菜素可浓度依赖性上调LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-AMPKα蛋白表达水平及p-AMPKα/AMPKα比值（P<0.05）,下调p-mTOR、p62蛋白表达水平及p-mTOR/mTOR比值（P<0.05）。与高浓度实验组比较,抑制剂组细胞中含高亮点状荧光的自噬小泡减少,IOD值下降,LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-AMPKα蛋白表达水平及p-AMPKα/AMPKα比值降低,而P62、p-mTOR蛋白表达水平及p-mTOR/mTOR比值升高（P<0.05）。结论 芹菜素能抑制肺癌A549细胞增殖,诱导其自噬,作用机制可能与AMPK/mTOR通路有关     

PI3K特异性抑制剂LY294002增强rsTRAIL蛋白对A549细胞的杀伤作用

目的：探讨磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）参与非小细胞肺癌A549细胞株抵抗重组可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rsTRAIL)蛋白诱导凋亡的机制,寻找增强rsTRAIL蛋白杀伤非小细胞肺癌细胞的新方法。方法：选取对数生长期A549细胞,随机分为rsTRAIL蛋白组和PI3K特异性抑制剂LY294002联合rsTRAIL蛋白（LY294002+rsTRAIL蛋白）组。MTT法检测2组A549细胞生长抑制率,流式细胞技术检测2组A549细胞周期和细胞凋亡的变化,蛋白质印迹法检测2组A549细胞中p-Akt(Ser473)、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表达水平。结果：与rsTRAIL蛋白组(5.16%±0.32%)比较,LY294002+rsTRAIL蛋白组A549细胞生长抑制率(74.6%±2.63%)明显升高(P<0.05)。与rsTRAIL蛋白组比较,LY294002+rsTRAIL蛋白组处理2 h后G0/G1期A549细胞百分比增加(P<0.05),S期细胞百分比降低（P<0.05）。LY294002+rsTRAIL蛋白组A549细胞凋亡率为(61.50±3.02)%,显著高于rsTRAIL蛋白组(3.21％±0.96％)（P<0.05）。蛋白质印迹检测,与rsTRAIL蛋白组比较,LY294002+rsTRAIL蛋白组A549细胞中p-Akt、c-FLIPL和Bcl-2蛋白表达水平降低（P<0.05）,Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05）。结论：LY294002能够抑制PI3K活性,增强rsTRAIL蛋白对A549细胞的杀伤作用。     

大鼠神经干细胞中PI3-K/AKT信号转导通路的研究

目的 应用PI3-K特异性阻滞剂LY294002孵育大鼠神经干细胞（NSCs）,探讨PI3-K/AKT信号转导通路在NSCs中的作用。方法 体外分离、培养E15～16 胎鼠NSCs,应用不同浓度（0~40 μmol/L）的LY294002孵育NSCs后进行细胞存活(WST-8检测)、增殖(BrdU免疫组织化学鉴定)、分化(β Tubulin-Ⅲ免疫组织化学鉴定)和AKT磷酸化蛋白水平(Western Blotting)的检测。结果 LY294002对NSCs的存活、增殖和分化的影响呈剂量依赖性。在LY294002较高浓度（25、30、35、40 μmol/L）时,NSCs的存活率明显下降（P<0.05）;LY294002为30、35、40 μmol/L时,BrdU阳性细胞数明显少于正常对照组（LY294002 0 μmol/L）（P<0.05）;LY294002为35、40 μmol/L时,β Tubulin-Ⅲ的阳性细胞数明显少于正常对照组（P<0.05）。LY294002 阻断AKT表达的作用呈剂量依赖性。结论 PI3-K/AKT信号转导通路对大鼠NSCs的存活、增殖、分化起重要作用。     

吉非替尼抑制糖酵解诱导非小细胞肺癌的程序性死亡

目的 探究吉非替尼对非小细胞肺癌A549和H1975细胞死亡形式的影响,并从糖酵解方面探讨其可能机制。方法 A549细胞加入浓度分别为0、20、30、40 µmol/L的吉非替尼,H1975细胞加入浓度分别为0、20、40、80 µmol/L的吉非替尼。采用MTT法检测吉非替尼对非小细胞肺癌细胞的增殖抑制作用。用乳酸试剂盒检测细胞内乳酸的变化,Western blot法检测细胞内糖酵解相关蛋白（PKM2、HK2）和PI3K-Akt-mTOR信号通路中蛋白的表达水平;2-NBDG检测细胞葡萄糖摄取能力,ATP试剂盒检测胞内ATP水平;JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,Western blot法检测凋亡蛋白（Bax、Bcl-2）以及自噬标志蛋白LC3B的相对表达水平。结果 MTT结果显示吉非替尼可呈时间剂量依赖性的抑制A549和H1975细胞增殖（P<0.05）,A549细胞24、48、72 h的IC50值分别为48.6、28.6和19.7 µmol/L,H1975细胞24、48、72 h的IC50值分别为321.6、49.1和14.6 µmol/L。乳酸检测结果显示,吉非替尼抑制胞内乳酸水平（P<0.05）。Western blot结果显示,糖酵解相关蛋白PKM2、HK2表达下调（P<0.05）,PI3K-Akt-mTOR信号通路中相关蛋白表达下调（P<0.05）。吉非替尼也可以抑制A549和H1975细胞葡萄糖摄取、ATP水平（P<0.05）。JC-1试剂盒和Annexin V-FITC/PI双染法检测出吉非替尼能够诱导A549和H1975细胞发生凋亡,A549细胞中0、20、30、40 µmol/L的凋亡率分别为（10.77±1.0）%、（14.5±0.4）%、（17.4±0.2）%、（32.1±0.6）%,差异有统计学意义（P<0.05）;而H1975细胞0、20、40、80 µmol/L的凋亡率分别为（10.5±0.6）%、（13.2±0.92）%、（18.9±0.98）%、（35.1±1.4）%,差异有统计学意义（P<0.05）。促凋亡蛋白Bax表达增加和抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调（P<0.05）。同时LC3B表达增加证明吉非替尼能够诱导A549和H1975细胞自噬增加（P<0.05）。结论 吉非替尼对A549和H1975细胞具有增殖抑制、诱导凋亡和增加自噬作用,凋亡机制可能为吉非替尼影响A549和H1975细胞糖酵解功能和PI3K-Akt-mTOR信号通路。     

PI3K/AKT信号途径在大鼠脑源性神经干细胞中的作用

目的 探讨磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K）/AKT信号途径在体外培养神经干细胞存活、分化中的作用.方法 分为对照组、PI3K特异性抑制剂LY294002组（LY294002浓度分别为2 μmol/L,5 μmol/L,10 μmol/L）;采用间接免疫荧光法检测Nestin、NF-200和GFAP的表达;TUNEL评价细胞凋亡率;Western Blot法检测磷酸化的AKT的表达.结果 随着LY294002浓度增大,神经干细胞的形态变化逐渐明显,而且细胞凋亡率也逐渐增加.低浓度时（2 μmol/L）神经干细胞凋亡率与对照组无显著性差异（P〉0.05）;高浓度时（5 μmol/L、10 μmol/L）神经干细胞凋亡率与对照组、低浓度组有极显著性差异（P〈0.01）.Western Blot结果提示,随着LY294002浓度增大,磷酸化AKT的表达逐渐减弱.结论 本研究提示神经干细胞存活依赖于PI3K/AKT途径的活化,其机制可能是PI3K/AKT活化后,抑制了细胞凋亡事件的发生,但PI3K/AKT途径可能在神经干细胞分化中的作用甚微.     

CA916798基因通过PI3K/AKT/mTOR通路参与顺铂耐药的机制分析

摘要：目的观察阻断PI3K/AKT/mTOR通路对人肺腺癌细胞A549 及多药耐药人肺腺癌细胞A549/CDDP内CA916798 基因
mRNA表达的影响。方法以雷帕霉素、LY294002分别作用于人肺腺癌细胞A549和多药耐药人肺腺癌细胞A549/CDDP,检测
顺铂作用后细胞生长及增殖情况,RT-PCR 检测CA916798 基因mRNA表达水平。结果以雷帕霉素和LY294002 分别阻断
A549、A549/CDDP细胞的PI3K/AKT/mTOR通路后,细胞对于顺铂的耐药性均显著下降（P<0.05）,CA916798基因的表达均显
著下调（P<0.05）。结论CA916798基因位于PI3K/AKT/mTOR通路下游,可能是CA916798诱导肺癌顺铂耐药的机制之一。
     

盐酸埃克替尼对肺癌A549细胞PI3K/AKT、HIF-1α信号通路的影响

目的 探讨盐酸埃克替尼对肺腺癌A549细胞PI3K/AKT、HIF1α信号通路的影响。 方法 采用细胞计数法分析在不同浓度盐酸埃克替尼下肺腺癌A549细胞生长情况,MTT法测定不同浓度盐酸埃克替尼对肺腺癌A549细胞抑制率。采用显微镜下直接观察不同浓度盐酸埃克替尼下肺腺癌A549细胞的细胞形态变化情况,采用TUNEL法检测在不同浓度盐酸埃克替尼下肺腺癌A549细胞凋亡率;免疫组化法检测肺腺癌A549细胞PI3K/AKT、HIF1α蛋白表达。 结果 随盐酸埃克替尼浓度增加,肿瘤细胞增加明显减少,细胞形态不规则,50 mg/L剂量组可见大量坏死肿瘤细胞。盐酸埃克替尼抑制肺腺癌A549细胞增殖,在一定时间范围内呈现剂量和时间依赖性,各组与空白对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.01);12.5 mg/L组、25 mg/L组、50 mg/L组、DPP(25 mg/L)组肿瘤细胞凋亡率明显高于空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05);12.5 mg/L组、25 mg/L组、50 mg/L组、DPP(25 mg/L)组肺腺癌A549细胞PI3K、AKT、HIF1α蛋白表达明显低于于空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。 结论 盐酸埃克替尼对肺腺癌A549细胞增殖具有抑制作用,其作用可能是通过诱导细胞凋亡及抑制PI3K/AKT、HIF-1α信号通路来实现的。      

养正消积胶囊通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导肺腺癌细胞凋亡和自噬的作用研究

目的:探讨养正消积胶囊通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导肺腺癌细胞凋亡和自噬的作用机制。方法:通过中药系统药理学数据库与分析平台对养正消积胶囊重要的4个组分进行分析，筛选有效化合物及与肺腺癌相关基因，并对作用通路进行预测；使用DMSO法对养正消积胶囊成分进行提取后标记为DME25,取对数生长期肺腺癌A549细胞，依据不同DME25浓度分为空白对照组、DME25高(1∶200)、中(1∶1 000)、低浓度组(1∶5 000)。经药物干预48 h后，Western blot法检测细胞凋亡、自噬及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达水平变化。结果:与正常对照组相比，DME25低、中、高浓度组中A549细胞增殖能力、迁移、侵袭能力减弱，凋亡率均增高，且呈剂量依赖性。Western blot结果显示，A549细胞经DME25干预24 h后，自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表达水平升高，同时促进LC3I向ILC3II转化(P<0.01)。与对照组对比，经DME25干预的各组A549细胞中的p-PI3K、p-AKT及p-mTOR蛋白含量均降低，加入PI3K激活...     

PI3K和MAPK信号通路通过FOXO1转录因子诱导A549细胞周期的阻滞和凋亡的研究

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信号通路通过FOXO1转录因子对细胞周期及凋亡的调节及其分子机制.方法 体外培养NSCLC细胞系A549,分别选用PI3K/AKT信号通路特异性抑制剂LY294002和MAPK/ERK信号通路特异性抑制剂UO126及2种抑制剂联合处理细胞之后,采用Western blot检测蛋白FOXO1、p-FOXO1及其下游蛋白Bim、p27kip表达的变化;流式细胞术分析对细胞周期的影响;Annexin-FITC双染方法检测细胞凋亡.结果 Western blot结果显示:与对照组相比,FOXO1的蛋白水平未见明显变化,而FOXO1的磷酸化水平明显下降,Bim、p27kip的表达相应增加.与对照组相比,LY294002和UO126均可促进A549细胞周期阻滞于G1期,并诱导细胞凋亡.LY294002和UO126联合作用较2种药物单独作用时,A549细胞凋亡明显增加.结论 抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路可共同激活FOXO1转录因子的活性,协同促进细胞周期的阻滞,诱导细胞的凋亡.     

苦参碱及氧化苦参碱抑制A549细胞增殖及诱导细胞凋亡的比较研究

目的观察比较苦参碱及氧化苦参碱对A549细胞系增殖能力的影响及其对A549细胞凋亡的诱导效应.方法以不同剂量的苦参碱及氧化苦参碱分别作用A549细胞,观察细胞形态,MTT法检测细胞的增殖能力,TNUEL法原位检测DNA断裂,流式细胞仪检测凋亡.结果苦参碱在浓度为0.5g/L时即表现出明显的抑制A549增殖的作用,浓度在1.0g/L时TUNEL原位检测DNA断裂为强阳性,流式细胞仪检测出凋亡峰;相同浓度的氧化苦参碱没有明显的抑制A549增殖的作用,当其浓度增加到10倍出现对A549抑制增殖的作用,但是TUNEL原位检测DNA断裂为弱阳性,流式细胞仪不能检测出凋亡峰.结论苦参碱可抑制A549细胞系增殖并诱导其凋亡;相同浓度下氧化苦参碱不能抑制A549细胞系增殖,10倍剂量也未出现细胞凋亡.     

PI3K/Akt抑制剂联合西妥昔单抗对人肺癌细胞的体外抑制作用

目的探讨PI3K/Akt抑制剂LY294002单独或联合西妥昔单抗对人肺癌细胞株A549的作用,以期为肺癌临床治疗方案的选择、用药顺序提供新的理论依据。方法选用西妥昔单抗和LY294002,分析单药及不同浓度和联合作用方式对A549细胞增殖的影响;计算IC50值和CI值,分析药物联合作用的效应是协同、相加抑或拮抗。结果单独作用时,西妥昔单抗与LY294002最大抑制率分别为(57.3±6.2)%、(56.2±6.0)%;联合作用时,LY294002→西妥昔单抗序贯给药(CI=0.41)比同步应用(CI=0.73)可增强疗效,其最大抑制率分别为(84.9±7.5)%和(79.0±7.3)%。结论两药对A549细胞增殖均具有抑制作用,LY294002→西妥昔单抗序贯联合应用对A549细胞的增殖抑制率最高。     

Effects of paclitaxel on cell proliferation and apoptosis and its mechanism in human lung adenocarcinoma A549 cells

INTRODUCTION Primary bronchogenic carcinoma is one of thecommonest malignancy tumors in the world.The incidence and mortality rate are rising in recent30 years. Adenocarcinoma accounts for about 25%of all primary bronchogenic carcinomas, the curativerate is not ideal by traditional chemotherapy and ra-diotherapy[1-4]. Paclitaxel is a extensive anti-cancerdrug whose mechanism is anti-microtubules and sta-bilizes cell microtubules specially, and has also beenused widely in ovarian cancer, b…     

PI3K/Akt抑制剂对肺癌细胞化疗药物敏感性的影响

目的 探讨PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002与化疗药物联合使用对肺癌细胞A549、SPC-A1化疗效果的影响.方法 将LY294002联合化疗药物作用于肺癌细胞A549、SPC-A1,用MTT法检测单独使用顺铂、紫杉醇及联合PI3K抑制剂LY294002对体外培养的肺癌细胞A549、SPC-A1对化疗药物的敏感性,用流式细胞术检测肺癌细胞A549、SPC-A1凋亡率和细胞周期变化.结果 联合LY294002作用后肺癌细胞A549、SPC-A1对化疗药物顺铂、紫杉醇敏感性显著增强(P<0.01),且细胞凋亡率显著提高(P<0.01),G0/G1期细胞比例增加,S+G2/M期细胞比例减少(P<0.05).结论 LY294002能有效提高化疗药物顺铂、紫杉醇体外对A549、SPC-A1细胞抑制作用的敏感性,抑制PI3K介导的信号转导通路,显著提高肺癌化疗效果.     

氯化两面针碱对前列腺癌细胞PC-3增殖与凋亡的影响

目的 探讨氯化两面针碱对前列腺癌细胞PC-3增殖及凋亡的影响作用。方法 采用MTT、细胞划痕和Transwell侵袭实验评估氯化两面针碱对人前列腺癌细胞PC-3增殖与侵袭的影响;流式细胞术检测氯化两面针碱对PC-3细胞凋亡的影响;免疫印迹检测AKT/mTOR及细胞凋亡蛋白B细胞淋巴瘤基因-2相关X蛋白(Bax)和B细胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)的表达,应用PI3K通路抑制剂LY294002探讨抑制AKT通路对前列腺癌细胞PC-3的影响。结果 氯化两面针碱能抑制PC-3细胞的增殖与侵袭,且具有剂量依赖性(P<0.01)。氯化两面针碱可下调Bcl-2、而上调Bax的蛋白表达,Bax/Bcl-2比例明显上升(P<0.01),抑制AKT和mTOR通路的磷酸化,诱导前列腺癌细胞PC-3凋亡。联合应用LY294002发现,抑制AKT通路可增强氯化两面针碱对前列腺癌细胞PC-3增殖和侵袭的抑制作用。结论 氯化两面针碱能够抑制前列腺癌细胞PC-3的增殖与侵袭,诱导其凋亡,并通过抑制AKT/mTOR磷酸化发挥其抗前列腺癌作用,可作为一种潜在治疗前列腺癌的药物。