上海地区H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析

目的对分离自上海活禽批发市场的7株H9AIV(2002年1株、2006-2008年每年各2株)进行了HA序列的测定,以阐明这7株毒株HA基因的遗传变异及分子特征。方法采集鸡气管和泄殖腔样品,将H9亚型荧光RT-PCR试剂盒检测的阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,HI进一步确定HA亚型,通过RT-PCR方法分别扩增了这7个毒株的HA基因,并将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定与同源性分析。结果HI试验表明这7株毒株均属于H9亚型禽流感病毒。核苷酸和其推导的氨基酸序列同源性比较结果表明,这7株毒株HA基因的核苷酸序列同源性为88.6%～99.6%,氨基酸序列同源性为89.1%～99.1%;7株分离株HA基因的裂解位点氨基酸顺序则均为RSSR↓GLF,为低致病性毒株;所有毒株的潜在糖基化位点均有7个;2002年的分离株与2006年早期的分离株在aa226和aa228位分别为Q和G,其余5株分离株在这两个位点分别为L和G。遗传发生关系分析,这7株分离株均属于Ck/Bei/1/94系。结论上海地区7株H9亚型分离株具有相同的起源,且分子特性相似,受疫苗免疫选择压力的影响不大。     

甲型流感病毒H1N1亚型HA基因的克隆及序列分析

目的克隆甲型流感病毒H1N1亚型血凝素HA基因,并对其进行序列分析。方法利用TRIzol Rea-gent法提取甲型流感病毒H1N1亚型的总RNA,RT-PCR后以其cDNA为模板PCR扩增HA基因,经酶切、连接后,构建pET 28a(+)-HA重组质粒。利用生物信息学工具对HA的核酸序列和蛋白功能结构进行分析。结果成功构建了pET 28a(+)-HA重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的HA基因序列同源性达到99%。结论对HA基因进行克隆及生物信息学的分析,为深入研究HA在病毒侵入细胞及抗原变异中的作用机制及后续HA抑制剂的体外筛选奠定基础。     

2016-2018年广州市H6亚型禽流感病毒外环境分离株HA基因遗传特征分析

目的 对广州禽类市场外环境H6亚型禽流感病毒进行分离和测序,分析HA基因遗传进化特点。方法 通过接种鸡胚分离H6亚型禽流感病毒,采用RT-PCR方法扩增HA基因全长序列并测序,通过DNA Star7.1和MEGA 4.0软件,分析HA基因遗传特征。结果 2016-2018年广州禽类市场外环境分离到6株H6亚型禽流感病毒,HA基因核苷酸同源性在81.0%~99.1%之间。基因序列特征分析显示,所有分离株裂解位点序列相对保守,只有1个碱性氨基酸插入,呈现低致病性禽流感病毒分子特点。受体结合位点均为226Q和228G,为禽类呼吸道上皮受体结合位点。2016年分离株发现183-NNT糖基化位点的缺失。进化分析显示,广州早期分离株属于广东常见的ST2853-like分支,但2018年监测发现了ST339-like新流行分支病毒。结论 广州地区H6亚型禽流感病毒尚为禽类低致病性病毒,本研究毒株HA基因变异较大, 2018年毒株出现多遗传分支进化趋势,因此需要继续监测H6亚型禽流感病毒的流行和变异。     

H9N2亚型禽流感病毒纤突蛋白基因的分析

目的　克隆禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KMⅢ / 99(H9N2 )纤突蛋白血凝素基因和神经氨酸酶基因 ,并与同一亚型不同毒株的病毒进行比较。方法　本研究以自行设计的引物 ,一次性成功地扩增出KMⅢ毒株HA和NA全长基因cD NA ,并将它们克隆和测序。以获得的核苷酸序列和氨基酸序列与其它毒株的HA蛋白和NA蛋白比较。结果　HA基因由16 83bp组成 ,编码 5 6 0个氨基酸 ;NA全基因为 14 0 7bp、编码 4 6 9个氨基酸残基 ;HA1羧基端的氨基酸组成是 :R -S -S -R ,符合低致病力毒株的分子特征。它们的氨基酸组成虽有差异 ,但与血凝素和神经氨酸酶功能关系密切的氨基酸残基却高度保守。联机检索表明 ,KMⅢ的HA基因cDNA与其它H9N2亚型HA基因最大同源性在 82 %～ 96 %之间。NA基因cDNA与其它H9N2亚型NA基因的最大同源性在 88%～ 97%之间。结论　我们首次克隆和测序了KMⅢ毒株的HA基因和NA基因 ,并对它们进行了分析     

H5N1亚型和H3N2亚型禽流感病毒广西株NS基因的克隆和序列分析

目的对3株分离自广西的禽流感病毒的NS基因进行序列分析,试图从分子水平分析和了解广西地区禽流感病毒NS基因的变异特点和进化规律。方法根据GenBank上登录的已知禽流感病毒的NS基因全序列设计引物,对3株2004-2005年分离自广西的禽流感病毒株A/DK/GX/1566/04(H3N2)、A/Goose/GX/737/05(H5N1)、A/Goose/GX/2775/05(H5N1)的cDNA进行PCR扩增NS基因,并将其克隆到pMD-18T载体上,分别获得全长为855bp、834bp、837bp的NS基因全序列。结果2株H5N1亚型禽流感病毒广西株间NS基因序列的同源性为95.3%,而2株H5N1亚型禽流感病毒株与H3N2亚型禽流感病毒株之间NS基因序列的同源性为94.0%～94.1%。H5N1亚型禽流感病毒广西株的NS基因在第238-253位核苷酸处均发生了15个核苷酸缺失,与我国广东、香港、云南、湖南、湖北及东南亚等不同地区的毒株比较,NS基因的核苷酸同源性为70.2%～97.6%。在NS基因系统进化树中,3株禽流感病毒广西株都属于A亚群,但处在不同的分支上,其中A/DK/GX/1566/04(H3N2)与广东、香港2001-2003年分离株处于同一分支;A/Goose/GX/737/05(H5N1)、A/Goose/GX/2775/05(H5N1)与我国华南地区以及韩国、越南、泰国等亚洲东南部国家的2003年以后的分离株有共同起源。结论3株2004-2005年分离自广西的禽流感病毒株NS基因之间的同源性均高于94%,都属于A亚群。     

3株H9N2亚型禽流感病毒广西分离株全基因组序列的测定与分析

目的对3株H9N2亚型禽流感病毒进行全基因序列的测定与分析。方法根据GenBank公布的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的全基因序列,设计了8对引物,运用RT-PCR方法获取了3株H9N2亚型AIV广西地方分离株A/Chick-en/Guangxi/1/00、A/Chicken/Guangxi/14/00和A/Chicken/Guangxi/17/00的全基因序列,并对所得序列进行了比较分析。结果同源性分析及遗传进化分析发现,所分离的3个毒株的各基因与A/Chicken/Guangdong/4/00和A/Chicken/Jiangsu/1/00的相应基因的核苷酸序列有着较高的同源性和较近的亲缘关系,可能起源于同一种系。所分离毒株中每个毒株的8个基因,在遗传进化树上的分支不具有统一性,说明此3个毒株可能为不同基因亚系间发生自然重排的产物。氨基酸序列比较发现,A/Chicken/Guangxi/1/00、A/Chicken/Guangxi/14/00和A/Chicken/Guangxi/17/003株AIV的na基因核苷酸序列在开放性阅读框架的187～195位均缺失了ACAGAGATA共9个核苷酸,它们所编码的氨基酸为T、E、I。3个分离株的HA蛋白第226位氨基酸均为Gln,证明它们为人类非易感性的H9N2亚型AIV。结论此3株H9N2亚型流感病毒为基因自然重排的产物,其na基因均存在缺失,且从分子水平上证明它们对人类不具有易感性。     

我国鸡源H9N2亚型禽流感病毒NS基因的分子进化分析

目的为了明确国内鸡群中H9N2亚型AIV中非结构蛋白(NS)基因系统进化情况,对1998-2008年间分离自发病鸡群中的14株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)进行了非结构蛋白(NS)基因的克隆和序列测定,得到了NS1和NS2蛋白的完整编码序列。将NS核甘酸序列及推定的氨基酸序列与GenBank中已有的参考序列作比对,结果14株AIV的NS基因同源性在92.9%～99.9%,在系统进化上均属于NS基因A等位基因群中的A/Chicken/Beijing/1/1994分支。综合已有的研究结果,表明尽管A/Quail/Hongkong/G1/1997分支和A/Duck/Hongkong/Y439/1997分支的NS基因曾偶尔传入鸡群,但并未在我国鸡群中建立稳定的亚系。国内的H9亚型AIV的NS基因仅稳定存在着A/Chicken/Beijing/1/1994分支。     

石蜡切片研究H9N2亚型禽流感病毒的免疫原性

目的 用石蜡切片评估龠流感病毒A／Chicken／Guangdong／SS／94(H9N2)株的免疫原性，以获得免疫原性良好的疫苗候选株。方法 以A／CKcken／Guangdong／SS／94(H9N2)株为抗原制备油乳剂灭活疫苗免疫1Od龄SPF鸡，免疫21d后，以该毒株静脉注射免疫组与非免疫对照组，定期剖杀试验鸡并取脑、心肌、肺、胰腺、肝、肾、脾、气管和法氏囊等组织用石蜡切片进行病理组织学检查。结果 两组试验鸡的的病理组织学变化有明显差异，免疫组试验鸡获得保护，而对照组病变明显。结论 A／CKcken／Guangdong／SS／94(H9N2)株的免疫原性良好，可作为制备油乳剂灭活疫苗的候选株。     

DG01株H5N1亚型禽流感病毒全基因组序列分析

根据国内外已公布的AIV H5N1亚型全基因组序列设计了8对引物,对H5N1亚型高致病力禽流感病毒毒株A/Duck/Guangdong/DG01/05(简称DG01)毒株进行了全基因组RT-PCR、测序及序列分析。DG01株基因组由PB22 341bp,PB1 2 341bp,PA2 233bp,HA1 779bp,NP 1 565bp,NA1 398 bp,M1 027bp,NS 875 bp 8个节段组成,与往年及同年一些流行株比较分析结果显示,DG01株具有高致病性禽流感病毒基因特征,NA基因及NS1基因均有部分缺失,从基因特点分析属于2005年流行代表株。     

DG01株HSN1亚型禽流感病毒全基因组序列分析

根据国内外已公布的AIVH5N1亚型全基因组序列设计了8对引物，对H5N1亚型高致病力禽流感病毒毒株A／Duck／Guangdong／DG01／05（简称DG01）毒株进行了全基因组RT-PCR、测序及序列分析。DG01株基因组由PB22341bp，PB1 2341bp，PA2 233bp，HA1 779bp。NP1 565bp，NA1 398bp，M1 027bp。NS 875bp8个节段组成，与往年及同年一些流行株比较分析结果显示。DG01株具有高致病性禽流感病毒基因特征，NA基因及NS1基因均有部分缺失，从基因特点分析属于2005年流行代表株。     

广西犬源H9N2亚型流感病毒分离株的全基因组测序分析及其对小鼠的致病性实验

目的 对广西犬只尤其是宠物犬中携带H9N2亚型流感病毒进行全基因组序列特征分析以及小鼠的致病性研究,为流感病毒疫情的防控提供科学依据。方法 采用RT-PCR的方法扩增、测序全基因组,DNAStar和MEGA6.0软件分析氨基酸同源性和进化树,通过小鼠感染实验探究其致病性。结果 13株H9N2毒株8个基因节段来源于5个不同谱系的毒株,属于新基因型,氨基酸同源性与广西分离株A/equine/Guangxi/3/2011≥99.0%,6个内部基因与2013年自人流感病毒分离株H7N9亲缘关系密切。毒株HA的裂解位点均为RSSR↓GLF,表明低致病力。氨基酸位点HA226、 NA119、NP375和PB2的701位等有变化,其中HA226位为亮氨酸L,具有与人SAα2,6-Gal结合的特性。BALB/c小鼠感染健康犬只中分离的H9N2病毒未在体内复制,而源自感冒犬只的毒株Ca/GX/8和Ca/GX/10能够在体内复制,临床症状明显但不致死。病毒经小鼠体内传代后致病力增强,推测是PB2的611位和PA623位氨基酸改变导致。结论 从广西各地犬只中获得的13株H9N2亚型流感病毒株经分析发现虽源于禽源,但具备和人源受体特异性结合的能力,且内部基因遗传进化关系复杂,对哺乳动物及人类存在较大威胁,亟需加强防控。     

2007--2008年上海市H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化

目的对分离自上海活禽批发市场的11株H9N2亚型AIV（2007年5株、2008年6株）进行了PB2,PBl,HA,NP和NA的测序,以阐明2007年至2008年上海地区H9N2亚型禽流感病毒分离株的遗传变异及分子特征。方法采集鸡气管和泄殖腔样品,将H9亚型荧光RT—PCR试剂盒检测的阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,HI进一步确定HA亚型,通过RT-PCR方法分别扩增了这11个毒株的PB2,PBl,HA,NP和NA并进行了序列测定。结果对HA基因进行遗传发生关系分析,这11株分离株均属于Ck／Bei／1／94系。这11个毒株的5个片段的组成有两种方式。结论上海活禽批发市场的1l株H9N2亚型AIV毒株中已包含了H5的片段,所以在今后的工作中加强H9N2亚型禽流感流行病学监测是非常必要的。     

鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡转录组学分析

目的 为了分析鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡后宿主基因表达水平的变化。方法 以鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡,收集肺脏进行高通量测序。结果 与对照组相比,感染组得到差异表达基因740个,其中上调基因有602个,下调基因有138个。GO条目分析发现,差异基因主要涉及免疫应答反应和炎症反应等。经KEGG 数据库比对注释及富集分析显示有7个通路富集显著,其中Toll-like信号通路有11个基因表达上调,分别为IL-6、TLR4、PIK3、IRF7、MD-2、IRF5、MYD88、CD86、STAT1、TLR2和CCL4,NOD-like受体信号通路有7个基因表达上调,分别为IRF7、CTSB、P2RX7、CYBB、PSTPIP1、HSP90AA1和NAMPT。结论 鸭源H7N9亚型病毒感染SPF鸡后,免疫相关基因表达明显增强。在Toll-like信号通路中, TLR4在MD-2的协助下被激活,随后依赖MYD88途径激活下游的IRF5,继而引起CCL4、IL-6显著表达。同时NLRP3炎症体在H7N9亚型病毒感染过程中也发挥着重要作用。     

H9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

目的根据环介导等温扩增技术（LAMP）,建立了一种适用于H9亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）快速检测方法。方法根据GenBank中的H9亚型AIV血凝素（HA）基因序列,在保守区设计了一套针对HA基因8个区域的6条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果结果表明该方法对H3、H5、H7亚型AIV及其它禽呼吸道病原体均无扩增反应,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化观察;扩增反应只需要在常规水浴锅中进行,50min之内可完成反应;该方法对H9亚型AIV RNA的最小检测限为0.01pg,灵敏度是一步法RT-PCR方法的1 000倍。结论本研究建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行H9亚型AIV的快速检测。     

甲型H1N1流感病毒HA基因的原核表达及免疫反应性分析

目的构建甲型H1N1流感病毒HA基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白,并对表达蛋白的免疫反应性进行分析。方法人工合成A/California/05/2009 H1N1流感病毒的HA基因,以合成基因为模板,通过PCR方法扩增出去除信号肽的HA部分基因片段,然后将去除信号肽的HA基因克隆至pET30a(+)原核表达载体中,构建出原核表达质粒,再将重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达菌株;重组菌经IPTG诱导后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析,Western blot分析表达产物的免疫反应性。结果获得了HA基因的原核表达重组菌,细菌经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见约67.4 ku大小的目的蛋白表达条带,Western blot结果显示,表达产物与人甲型H1N1流感患者阳性血清具有反应性。结论成功表达出甲型H1N1流感病毒的HA蛋白,该蛋白具有良好的免疫反应性,为甲型H1N1流感的快速诊断方法的建立提供了生物材料。     

甲型H1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的真核表达与纯化

目的构建甲型SWH1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的杆状病毒真核表达载体,转染sf9细胞表达并纯化其编码蛋白。方法从江苏甲型H1N1流感病毒毒株[A/Jiangsu/1/2009（H1N1）]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA1基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/HA1质粒,双酶切pMD18-T/HA1与p-fast后,连接构建真核表达载体p-fast-HA1,转化DH10Bac细胞,转座构建杆状病毒HA1-Bacmid,经酶切及测序鉴定后将HA1-Bacmid转染到sf9细胞中,通过免疫印迹法鉴定HA1蛋白的表达,采用亲和层析法纯化HA1蛋白。结果经双酶切、测序鉴定证实HA1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实HA1基因的表达;纯化获得了高纯度的HA1蛋白。结论成功克隆了HA1基因,并构建了其杆状病毒真核表达载体,该表达载体的构建为后期的流感快速检测以及基因工程疫苗制备奠定了良好的基础。