SYBR GreenⅠ实时PCR检测甲型H1N1与季节性流感病毒方法的建立

目的：建立一种检测甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2与乙型流感病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法。方法：设计针对甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2与乙型流感病毒HA基因的引物,分别进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应,同时进行熔解曲线和Tm值分析,并作灵敏度和重复性试验。 结果：结果表明该方法与H5、H7、H9亚型流感病毒及副流感病毒1、2、3型均无交叉反应。构建的荧光定量标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为：95.588%,检测灵敏度为101copies/反应体系,结果重现性好。成功地验证性检验了32份盲样标本。结论：本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法敏感、不需荧光标记探针、成本低及高通量,能用于人类流感病毒的分型检测。     

SARS病毒核酸检测中不同引物对灵敏度的影响

目的筛选灵敏、特异的SARS病毒核酸检测方法。方法采用世界卫生组织(WHO)和中国疾病预防控制中心(中国CDC)推荐的9对SARS病毒核酸检测引物，同时又选择市售的2种SARS荧光定量PCR试剂，分别对不同稀释度的SARS病毒核酸进行RT—PCR、巢式PCR和荧光定量PCR扩增，比较其检测灵敏度和特异性。结果两种荧光定量PCR试剂可检测SARS病毒核酸灵敏度均为0．1TCID50，与普通RT—PCR方法检测灵敏度(0.1TCID50)相同，而较巢式PCR法(0．01TCID50)略低；采用RT—PCR方法扩增SARS核酸时，以WHO推荐的SAR1s／SAR1as、BNIinS／BNIAs、BNIoutS/BnoutAs与中国CDC推荐的CDC-P1 ／P1-灵敏度最高。结论RT—PCR扩增时各引物对之间存在明显差异；荧光定量PCR可作为SARS疑似样本检测的首选方法，必要时再采用RT—PCR和巢式PCR法加以确认。     

交叉引物恒温扩增法检测甲型H1N1流感病毒及临床应用

目的建立交叉引物恒温扩增(Cross Priming Amplification,CPA)技术对甲型H1N1流感病毒进行检测的方法,并对该方法通过临床标本进行评价。方法根据甲型H1N1流感病毒的保守序列设计特异性引物,并在同一温度下实现RNA的逆转录和DNA扩增,该扩增产物可通过全封闭式核酸检测装置进行检测。14份健康人咽拭子标本、7个其他呼吸道病毒和6个虫媒病毒株被用来检测CPA反应的特异性;已知病毒滴度的甲型H1N1毒株进行对照梯度稀释,以测试CPA的敏感性;102份甲型H1N1临床咽拭子标本为检测对象,评估其临床的检测的可行性。结果 CPA反应未出现对健康样本以及其他病毒产生交叉反应;对已知滴度的病毒进行梯度稀释检测,证明CPA的敏感性为10拷贝/μL。对甲型H1N1流感临床病例发病1~3d临床标本新建检测方法的检出率为100%,4~6d临床标本检出率为79.31%,≥7d临床标本检出率为9.09%。讨论CPA具有较高的敏感性、特异性,对设备要求低,适合基层医疗单位对甲型H1N1流感发病早期诊断使用。     

2009年广东省甲型流行性感冒暴发流行期间首株甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素基因分析

目的 检测和分析2009年广东省甲型流行性感冒(流感)暴发流行期间首株甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因.方法 对2009年广东省首例确诊的甲型H1N1流感患者的咽拭子进行病毒分离,取细胞培养上清液提取病毒核酸,采用HA基因的特异性引物进行RT-PCR,PCR产物进行克隆、测序和同源性分析.结果 获得2009年广东省首株甲型H1N1流感病毒的HA基因,大小为1710 bp,命名为A/GuangzhouSB/01/2009(H1N1)HA,GenBank登录号为GQ268003.与疫情发源地近期报告的277株甲型H1N1流感病毒的HA基因比对,同源性为99.0%～99.8%;其中与美国报告的病毒株的同源性高达99.8%,与患者发病前曾到美国旅游的流行病学史一致.与25株中国季节性甲型H1N1流感病毒的HA基因比对,同源性为72.3%～85.6%.结论 2009年广东省甲型流感暴发流行期间首株甲型H1N1流感病毒与目前流行的甲型H1N1流感病毒同源性高,与中国季节性甲型H1N1流感病毒同源性较低.     

福建省首例人感染H7N9禽流感病例实验室诊断和病毒序列分析

摘要 目的 应用real-time RT-PCR和病毒序列测定等方法对福建省首例人感染H7N9禽流感病例开展实验室诊断。方法 采集人感染H7N9禽流感病例呼吸道标本并提取RNA,分别采用甲乙型流感通用引物和探针、季节性流感（包括H3N2、H1N1、H1N1pdm）特异性引物和探针以及H7N9特异性引物和探针进行荧光PCR检测。利用自行设计的引物扩增病毒基因组节段,测定并分析病毒基因组序列。结果 real-time RT-PCR结果表明,应用甲型通用引物扩增结果阳性,乙型及季节性流感（包括H3N2、H1N1以及H1N1pdm）扩增结果均为阴性,特异性H7N9亚型流感病毒扩增结果阳性。序列测定获得的病毒4个节段的序列与已公布的人感染H7N9禽流感病毒序列高度一致。结论 病例呼吸道标本中存在人感染H7N9禽流感病毒,病毒的基因与近期国内流行的人感染H7N9禽流感病毒高度类似。     

甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素基因变异状况及序列分析

目的 了解2009年度甲型H1N1流行性感冒(流感)病毒的检测情况和血凝素(HA)基因变异情况.方法 选择国家级流感监测哨点医院以及暴发疫情的疫点,采集流感样病例的鼻咽拭子标本,通过实时(RT)-PCR进行病毒分型及甲型H1N1流感病毒检测,对阳性标本采用狗肾细胞(MDCK)进行病原分离,采用红细胞凝集试验测定病毒效价,用血凝抑制实验进行型别鉴定,通过RT-PCR扩增毒株HA1片段的基因并进行序列测定,利用生物信息学技术进行序列分析.结果 共检测咽拭子样本996份,其中核酸检测阳性病例包括甲型H1N1 337份,季节性H1N1亚型1份,季节性H3N2亚型67份,B型12份,流感核酸检测阳性率为41.87％,其中甲型流感核酸检测阳性率为33.84％.分离出甲型H1N1病毒36株,选择18株.测序成功的10株甲型H1N1流感病毒在多个氨基酸位点发生变异,与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)比较,有6个位点发生突变,其中1个位点位于抗原决定簇的B区.结论 2009年度分离到的流感病毒株中以甲型H1N1为绝对的优势毒株,毒株的血凝素基因与世界卫生组织(WHO)提供的疫苗株相比有变异,与疫苗株相比,抗原决定簇B区有改变,但关键位点第222位没有变化.     

甲型流感病毒快速基因分型POCT方法的建立

目的建立一种无需核酸提取,直接检测鼻咽拭子中甲型流感病毒H1HA pdm09、H3HA亚型和季节性流感病毒H1HA non-pdm09的POCT快速分型方法。方法针对3种流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因序列保守区设计高度特异性的引物和HyBeacon探针,同时以人类RNaseP基因作为内参。优化多重PCR反应条件,建立用熔解曲线分析甲型流感病毒基因分型的方法,并将其应用到ParaDNA核酸POCT检测仪,对50例甲型流感病毒抗原初筛阳性且经过实时荧光定量PCR检测的临床鼻咽拭子标本进行检测。结果该方法可在1.5 h内完成对3种甲型流感病毒亚型HA基因的特异性扩增和分型,与其他7种呼吸道病原微生物无交叉反应,其核酸检测下限为50 copies/μl。对临床50例甲型流感病毒抗原阳性的鼻咽拭子标本进行直接检测,检出H1HA pdm09阳性标本48例,H3HA阳性标本2例,未检出季节性流感H1HA nonpdm09阳性标本。结论基于HyBeacon探针和ParaDNA核酸POCT检测仪所建立的甲型流感病毒快速分型方法能同时检测H1HA pdm09、H3HA和季节性流感病毒H1HA non-pdm09。该方法无需核酸提取,操作简便,检测时间短,适于对甲型流感病毒抗原初筛阳性的鼻咽拭子开展现场基因分型检测,可为流感的诊治和防控提供及时快速的实验室依据。     

Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测甲3型流感病毒

目的建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RTPCR方法用于检测甲3型流感病毒核酸。方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在甲3型流感病毒血凝素(HA)基因的保守区设计引物和TaqMan探针、并进行筛选。对荧光RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度。并对疑似流感含漱液标本进行检测。结果该方法对甲3型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、乙型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论本研究建立的TaqMan荧光定量RTPCR是一种快速检测甲3型流感病毒特异、敏感的新方法。     

荧光定量RT-PCR方法检测感染小鼠不同组织中的H5N1禽流感病毒

目的测定H5N1禽流感病毒感染小鼠各脏器组织中的病毒核酸含量,了解病毒复制与疾病进程的关系,为H5N1禽流感病毒致病机理与防治研究提供技术支持。方法利用建立的荧光定量RT-PCR法对H5N1禽流感病毒感染BALB/c小鼠的不同脏器组织中病毒核酸进行定量检测,观察H5N1禽流感病毒在不同组织中的复制情况。结果利用荧光定量RT-PCR法可从H5N1禽流感病毒感染小鼠后第3d的肺脏、脑、脾脏、肾脏和肝脏组织中检测到不同含量的病毒核酸;而在感染后4d的肺脏、脑和脾脏等组织中的病毒核酸含量开始下降;在感染后第6d,H5N1禽流感病毒核酸在肺脏和脑组织中大量存在外,其余组织中均有少量病毒核酸。结论H5N1流感病毒感染小鼠肺脏和脑组织中病毒核酸含量较高,说明病毒主要在小鼠的肺脏和脑组织中复制。由于荧光定量RT-PCR法可对感染小鼠不同脏器组织中的病毒核酸进行准确定量,可为H5N1禽流感病毒所致疾病的早期诊断、流行病学和致病机理研究提供技术支持。     

荧光定量RT—PCR方法检测感染小鼠不同组织中的HSN1禽流感病毒

目的测定H5N1禽流感病毒感染小鼠各脏器组织中的病毒核酸含量，了解病毒复制与疾病进程的关系，为H5N1禽流感病毒致病机理与防治研究提供技术支持。方法利用建立的荧光定量RT-PCR法对H5N1禽流感病毒感染BALB／c小鼠的不同脏器组织中病毒核酸进行定量检测，观察H5N1禽流感病毒在不同组织中的复制情况。结果利用荧光定量RT-PCR法可从H5N1禽流感病毒感染小鼠后第3d的肺脏、脑、脾脏、肾脏和肝脏组织中检测到不同含量的病毒核酸；而在感染后4d的肺脏、脑和脾脏等组织中的病毒核酸含量开始下降；在感染后第6d，H5N1禽流感病毒核酸在肺脏和脑组织中大量存在外．其余组织中均有少量病毒核酸。结论H5N1流感病毒感染小鼠肺脏和脑组织中病毒核酸含量较高，说明病毒主要在小鼠的肺脏和脑组织中复制。由于荧光定量RT-PCR法可对感染小鼠不同脏器组织中的病毒核酸进行准确定量，可为H5N1禽流感病毒所致疾病的早期诊断、流行病学和致病机理研究提供技术支持。     

分子信标探针技术用于PCR检测诺卡氏菌SecA1基因

目的将诺卡氏菌属细菌的一段特异性DNA设计成分子信标探针,用于该细菌的PCR检测。方法将诺卡氏菌属细菌、戈登氏菌属细菌及红球菌属细菌菌株分别接种于脑心浸液琼脂培养基分离培养,观察其生长情况,提取菌株DNA作为扩增模板;设计诺卡氏菌属细菌基于secA1基因的特异性分子信标探针,在实时荧光定量PCR反应译体系中加入分子信标探针,PCR产物进行荧光信号检测。结果诺卡氏菌secA1基因经实时荧光定量PCR扩增后可产生阳性荧光信号,红球菌属细菌及戈登氏菌属细菌的secA1基因、阴性对照实验组及空白对照组经实时荧光定量PCR扩增后不产生荧光信号,为阴性。结论 secA1作为看家基因,是用来进行种水平的鉴定及系统进化研究非常理想的靶分子,而分子信标探针技术可以准确、快速、灵敏的进行诺卡氏菌secA1基因检测。     

基于TaqMan探针的猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立一种能检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（PRRSV）的TaqMan探针荧光定量PCR方法。方法 根据PRRSV的ORF7基因保守区的核苷酸序列设计引物和TaqMan探针,通过探针浓度的优化,建立检测PRRSV的TaqMan探针荧光定量PCR方法。用该方法对30份临床疑似病料进行检测, 并与常规RT-PCR方法和病毒分离方法进行比较。结果 TaqMan荧光PCR检测PRRSV的最佳探针浓度为0.4μmol,检测灵敏度可达3.51拷贝/μl。检测的30份样品与病毒分离结果的符合率为100%,与普通PCR的检测结果（25/30）比较,本方法对临床样品的检出率（28/30）更高。结论 建立的方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样品的检测。     

肝癌组织HNF4α mRNA定量检测方法的建立与初步应用

目的 建立一种定量检测肝细胞癌（HCC）组织肝细胞核因子4α（HNF4α）mRNA的方法。方法 取手术获得的HCC组织16例,提取总RNA,逆转录PCR扩增获得全长HNF4α mRNA对应cDNA产物,经TA克隆后,测序确认。根据获得序列,设计检测HNF4α mRNA 引物及MGB荧光探针。以体外转录HNF4α mRNA为标准品,建立一步法 逆转录荧光定量PCR检测方法,同时设定β-actin mRNA为内参对照,最终计算得到组织HNF4α mRNA水平。采用免疫组化染色检测HNF4α蛋白表达,比较HNF4α mRNA水平与HNF4α蛋白表达的对应结果。结果 HCC组织HNF4α mRNA定量标准曲线斜率为-3.237,相关系数r值达0.994,β-actin mRNA定量标准曲线斜率为-3.037,相关系数r值为0.996,表明建立的方法可用于检测HNF4α mRNA定量（V-4α值）,16例HCC组织HNF4α mRNA与HNF4α 蛋白表达结果呈一致性对应关系。结论 我们初步成功建立了定量检测HCC组织HNF4α mRNA水平方法,其意义还需要进一步研究。     

A Novel Duplex Real-Time Reverse-Transcription PCR Assay for the Detection of Influenza A and the Novel Influenza A(H1N1) Strain

Timely implementation of antiviral treatment and other public health based responses are dependent on accurate and rapid diagnosis of the novel pandemic influenza A(H1N1) strain. In this study we developed a duplex real-time PCR (RT-PCR) (dFLU-TM) assay for the simultaneous detection of a broad range of influenza A subtypes and specific detection of the novel H1N1 2009 pandemic strain. The assay was compared to the combined results of two previously described monoplex RT-PCR assays using 183 clinical samples and 10 seasonal influenza A isolates. Overall, the results showed that the dFLU-TM RT-PCR method is suitable for detection of influenza A, including the novel H1N1 pandemic strain, in clinical samples.     

甲型H1N1与季节性H1N1流感病毒血凝素基因比较分析

目的分析泰安市2008～2009年度季节性流感与2009年度甲型H1N1流感病原学检测结果 ,比较季节性H1N1与甲型H1N1血凝素基因变异情况。方法选择国家级流感监测哨点医院以及暴发疫情的疫点,采集流感样病例的鼻咽拭子标本,通过RealtimePCR进行病毒检测,用MDCK细胞进行病毒分离,通过RT-PCR扩增血凝素HA1片段的基因并测序,利用生物信息学进行序列分析。结果 2008～2009年共检测鼻咽拭子标本283份,分离出流感病毒33株,分离阳性率为11.67%,其中季节性H1N1亚型31株。2009年5月1日～12月31日,检测鼻咽拭子标本996份,流感核酸检测阳性417份,阳性率为41.86%,其中甲型H1N1337份,季节性H1N1亚型1份。6株季节性H1N1病毒均在多个氨基酸位点上发生变异,与疫苗株A/Brisbane/59/2007(H1N1)比较,有11个位点发生了突变,其中5个位点位于抗原决定簇上;测序成功的6株甲型H1N1病毒在多个氨基酸位点发生变异,与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)比较,有6个位点发生突变,其中1个位点位于抗原决定簇的B区。结论 2008～2009年度季节性H1N1为优势株,甲流暴发后,甲型H1N1成为绝对优势毒株。季节性H1N1分离株有多处氨基酸替换,抗原决定簇B区变异频繁;甲型H1N1病毒分离株的基因有变异,但关键位点第222位仍为D(天冬氨酸),与疫苗株相比抗原决定簇的关键位点变化不大。     

2011年龙岩市流行株柯萨奇病毒A组16型VPl基因特征分析

目的分析2011年龙岩市流行的柯萨奇病毒A组16（CVA16）分离株的分子生物学特征。方法对从龙岩市2011年散发的手足口病（HFMD）患者标本中分离CVA16病毒,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增VPl基因片段全长,并对扩增产物测序。根据VPl基因核苷酸序列与国内外其他CVA16毒株序列构建进化树,并进行核苷酸和氨基酸同源性分析。结果 4株龙岩分离株CVA16核苷酸同源性为99%~100%。比较推导的氨基酸序列,VP1不存在位点差异,氨基酸序列完全相同。对分离株病毒进行VP1核苷酸序列两两差异分析,与国内其他分离株VP1基因序列的一致性为87%~100%。确定4株CVA16病毒均属于B1b基因型。结论引起2011年龙岩市HFMD流行的CVA16病毒均为B1b基因型,与目前国内其他地区流行毒株高度同源。