人剪切修复基因XPD对肝癌细胞生长及ERG基因的影响

目的探讨人剪切修复基因XPD转染人肝癌细胞SMMC-7721后对细胞自身生长及癌基因ERG表达的影响。方法将XPD基因通过LipofectamineTM2000转染入人肝癌细胞SMMC-7721。实验分为4组,分别为重组质粒转染细胞SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD组(XPD组)、空载质粒转染细胞SMMC-7721-pEGFP-N2组(N2组)、脂质体转染细胞SMMC-7721组(脂质体组)、肝癌细胞SMMC-7721无转染空白对照组(空白对照组)。分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot法检测各组细胞中XPD、ERG的mRNA和蛋白质的表达量,用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测各组细胞的增殖活力及流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。结果与其他3组比较,XPD组中的ERGmRNA及蛋白表达量显著降低,而XPDmRNA及蛋白表达量明显升高(P<0.01)。转染了XPD的肝癌细胞SMMC-7721,其细胞增殖活性(0.455±0.009)显著降低,细胞凋亡率(42.06±0.01)%明显升高(P<0.001)。结论 XPD基因可以抑制癌基因ERG的表达,明显降低肝癌细胞的增殖活力并提高肝癌细胞的凋亡率。     

人剪切修复基因XPD对人肝癌SMMC-7721细胞中Ets-1和Cdk6基因的调控作用

目的:观察野生型人剪切修复基因XPD转染入人肝癌细胞SMMC-7721后,细胞内Ets-1和Cdk6基因的表达变化及对SMMC-7721肝癌细胞增殖的影响。方法:将人工合成的pEGFP-N2-XPD重组质粒通过Lipofectamine 2000TM转染SMMC-7721细胞。设重组质粒转染细胞SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD(XPD)组、空载质粒转染细胞SMMC-7721-pEGFP-N2(N2)组、脂质体组、无转染空白对照组。分别用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测细胞中XPD、Ets-1、Cdk6基因mRNA和蛋白质的表达量,并用流式细胞仪检测细胞周期变化,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测各组细胞的增殖活力。结果:XPD组中的XPD的mRNA和蛋白质表达较其他3组明显增高(P<0.001),而Ets-1、Cdk6 mRNA和蛋白质表达较其他3组明显减少(P<0.001)。转染pEGFP-N2-XPD重组质粒后细胞停滞在G1期,难于进入S期。转染了野生型XPD的SMMC-7721细胞增殖能力减弱。结论:XPD基因可能通过抑制Ets-1、Cdk6基因的表达影响肝癌细胞的生长。     

shRNA沉默elF4E基因表达对人喉癌细胞Hep-2生物学行为的影响

目的 构建靶向真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)的shRNA表达载体,观察eIF4E表达抑制对喉癌细胞生物学行为的影响.方法 根据人eIF4E mRNA序列设计并构建2个靶向人eIF4E基因的shRNA真核表达载体(pSilencer4.1-sl和psilencer4.1-s2);然后以脂质体转染的方法将shRNA表达质粒转染至人喉癌细胞系Hep-2,经G418筛选出稳定转染的阳性细胞.分别通过反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blotting技术对构建成功的2个shRNA干扰质粒进行有效性筛选,分析其eIF4E mRNA及蛋白表达水平,并筛选出表达抑制最强的稳定转染喉癌细胞系(Hep-2-s2).通过噻唑蓝(MTT)试验检测Hep-2-s2细胞的体外增殖活性,流式细胞仪技术(FCM)检测其细胞周期和凋亡变化情况.结果 经双酶切证实转录shRNA的目的 基因片段已成功克隆入pSilencer4.1-CMVneo真核表达载体中,经测序证明插入序列完全正确;eIF4E-shRNA2可以显著下调eIF4E mRNA及蛋白表达水平;eIF4E基因的表达下调明显抑制Hep-2细胞的体外增殖(P＜0.05);Hep-2-s2细胞的Go/G1期细胞比例显著增加了(14.7±1.1)%,而S期细胞比例减少了(13.2±1.6)%(P＜0.05);Hep-2-s2的细胞凋亡率显著增加到(18.3±1.7)%(P＜0.05).结论 shRNA介导的eIF4E基因表达下调可显著降低喉癌细胞的增殖活性,同时诱导其细胞周期阻滞和凋亡率增加,为喉癌基因治疗筛选出了新的靶点.     

POLD1基因反义RNA对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用北大核心CSCD

目的研究DNA聚合酶δ催化亚基基因1(POLD1)反义RNA对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用及相应机制。方法将SMMC-7721细胞分为3组:实验组、阴性对照组、空白组。实验组及阴性对照组分别将POLD1基因反义RNA表达质粒及空质粒分别转染至SMMC-7721细胞,未经处理的SMMC-7721细胞为空白组。用聚合酶链反应法检测各组细胞POLD1基因表达情况;用细胞计数-8(CCK-8)法检测细胞增殖情况;用流式细胞术分析细胞凋亡率;用蛋白质印迹(Western blot)法检测p53、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)等凋亡相关蛋白表达量。结果实验组、阴性对照组和空白组肝癌细胞POLD1基因相对表达量分别为0.18±0.03,1.03±0.18和1.00±0.00;转染72 h增殖情况(OD_(450)值)分别为0.57±0.06,0.73±0.09和0.77±0.12;凋亡率分别为(23.43±4.12)%,(9.12±1.03)%,(1.24±0.14)%,实验组的上述指标与阴性对照组和空白组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论POLD1基因反义RNA可显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖,且能诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡。     

新型金属铜络合物对SMMC-7721细胞增殖与凋亡的影响

目的研究新型金属铜络合物(N-Cu)在体外对人肝癌SMMC-7721细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法将不同浓度的N-Cu(0.3～24μmol.L-1)作用于体外培养的SMMC-7721细胞,应用MTT法检测细胞生长抑制率,FCM法检测细胞周期及凋亡率,RT-PCR和Western blot法检测细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达的变化。结果 N-Cu可明显抑制SMMC-7721细胞的增殖,呈明显的量效与时效关系。随着药物浓度的增加,G0/G1期的细胞比率上升,G2/M和S期细胞比率下降,并促进凋亡率增加。N-Cu可上调细胞中Bax、Caspase-3基因及蛋白的表达,抑制Bcl-2基因及蛋白的表达,且均呈剂量依赖性。结论一定浓度的N-Cu可抑制SMMC-7721细胞的增殖并诱导其凋亡,阻滞细胞周期于G0/G1期。上调Bax、Caspase-3基因及蛋白的表达,降低Bcl-2/Bax比值,可能是其诱导细胞凋亡的重要机制。     

转染CD147干扰质粒肝癌细胞7721的鉴定

目的构建CD147干扰质粒,对肝癌细胞7721内源性CD147表达的抑制效果进行检测。方法设计及构建3对pGenesil-1-CD147/shRNA及1对阴性对照干扰质粒,通过测序鉴定。将干扰质粒用Lipofec-tamineTM2000转染肝癌细胞,通过瞬时转染获得细胞系,实时PCR和蛋白印迹法检测3对干扰质粒、阴性对照质粒的mRNA及蛋白表达水平。结果实时PCR和蛋白印迹法结果显示干扰质粒pGenesil-1-CD147/shRNA3对肝癌细胞7721内CD147mRNA及蛋白的抑制效果最显著。结论成功构建了CD147干扰真核表达载体,筛选出有效干扰质粒,为进一步研究低表达CD147的肝癌细胞7721在肝癌发生发展中的机制提供基础。     

p 16 基因对人肝癌细胞的生长抑制作用的初步研究

目的探讨抑癌基因p16对肝癌细胞生长的抑制作用。方法将p16 cDNA亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体上,并经脂质体介导转染至人肝癌细胞株SMMC-7721。用MTT法和Western blot分析转染细胞的生长情况。结果成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-p16,转染pcDNA3.1-p16的SMMC-7721细胞生长速度受到明显抑制;经Western blot证实,转染后有外源p16蛋白的表达,且伴随Bax上调,Bcl-2和cIAP2的下调。结论重组pcDNA3.1-p16质粒能在人肝癌细胞SMMC-7721内表达,且能抑制SMMC-7721的生长,其机理与诱导肿瘤细胞凋亡相关。     

shRNA沉默eIF4E基因表达对人喉癌细胞Hep-2生物学行为的影响

目的构建靶向真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）的shRNA表达载体，观察eIF4E表达抑制对喉癌细胞生物学行为的影响。方法根据人eIF4EmRNA序列设计并构建2个靶向人eIF4E基因的shRNA真核表达载体（pSilencer 4．1-sl和pSileneer4．1-s2）；然后以脂质体转染的方法将shRNA表达质粒转染至人喉癌细胞系Hep-2，经G418筛选出稳定转染的阳性细胞；分别通过反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blotting技术对构建成功的2个shRNA干扰质粒进行有效性筛选，分析其eIF4E mRNA及蛋白表达水平，并筛选出表达抑制最强的稳定转染喉癌细胞系（Hep-2-s2）。通过噻唑蓝（MTT）试验检测Hep-2-s2细胞的体外增殖活性，流式细胞仪技术（FCM）检测其细胞周期和凋亡变化情况。结果经双酶切证实转录shRNA的目的基因片段已成功克隆入pSileneer4.1-CMVneo真核表达载体中，经测序证明插入序列完全正确；eIF4E—shRNA2可以显著下调eIF4EmRNA及蛋白表达水平；eIF4E基因的表达下调明显抑制Hep-2细胞的体外增殖（P〈0．05）；Hep-2-s2细胞的G0／G1期细胞比例显著增加了（14．7±1、1）％，而S期细胞比例减少了（13.2±1．6）％（P〈0．05）；Hep-2-s2的细胞凋亡率显著增加到（18．3±1．7）％（P〈0．051。结论shRNA介导的eIF4E基因表达下调可显著降低喉癌细胞的增殖活性，同时诱导其细胞周期阻滞和凋亡率增加．为喉癌基因治疗筛选出了新的靶点。     

siRNA-DAD1联合人参皂苷Rh 2对肝癌SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨基因沉默DAD1 联合人参皂苷Rh2 对肝癌细胞增殖和凋亡的作用机制。方法　化学合成siRNADAD1,然后转染肝癌SMMC-7721 细胞,分别采用Q-PCR 和Western blot 检测DAD1 的mRNA 及蛋白表达水平变化,CCK-8 法检测肝癌SMMC-7721 细胞增殖能力的改变,DNA Ladder 法和流式细胞术检测肝癌SMMC-7721 细胞凋亡的变化。结果　siRNA-DAD1 可下调肝癌SMMC-7721 细胞中DAD1 的mRNA 及蛋白表达水平;siRNA-DAD1 与人参皂苷Rh2 均具有抑制SMMC-7721 细胞增殖的能力,并促使其发生凋亡,二者联合作用效果更好（P<0.05）。结论　siRNADAD1可下调肝癌SMMC-7721 细胞中DAD1 的mRNA 和蛋白表达水平,与人参皂苷Rh2 协同抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖并促进其凋亡。     

千层纸素A通过调控P4HB蛋白介导的hedgehog信号抑制肝癌血管生成

目的:探讨脯氨酸4-羟化酶β亚基(P4HB)蛋白在千层纸素A抗肝癌血管生成中的作用及其可能的机制。方法:Western blot检测6株人肝癌细胞系HCCLM3、Huh7、HepG2、MHCC97-L、Bel-7402及SMMC-7721中P4HB的蛋白表达。MTS试剂盒检测受试化合物对SMMC-7721细胞体外增殖的影响;LDH检测受试化合物对SMMC-7721细胞毒性影响;Western blot法检测受试化合物对SMMC-7721细胞中P4HB蛋白表达的影响;构建P4HB干扰质粒并转染SMMC-7721细胞,Western blot检测干扰转染效率;采用小管形成实验研究干扰P4HB对SMMC-7721细胞血管生成的影响;采用Western blot检测干扰P4HB对SMMC-7721细胞中hedgehog (Hh)信号相关蛋白Patched、Smo及Hhip蛋白表达影响;采用ELISA试剂盒检测激动Hh信号对P4HB蛋白调控SMMC-7721细胞血管内皮生长因子(VEGF)及血小板衍生生长因子(PDGF)分泌影响。结果:6株细胞中,SMMC-7721细胞表达P4HB蛋白最高。与对...     

三氧化二砷对人肝癌细胞生长及其尿型纤溶酶受体表达的体外研究

目的:体外研究三氧化二砷(As2O3)对人肝癌细胞株SMMC-7721生长及其表达尿型纤溶酶受体(uPAR)的影响。方法:SMMC-7721在不同浓度的As2O3作用不同时间后,采用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析As2O3对uPARmRNA表达的影响,并设立不加As2O3的对照组。结果:As2O3对SMMC-7721细胞的生长呈明显的抑制作用,且呈时间、浓度依赖性;与对照组比较,As2O3实验组G0/G1期细胞比例明显降低,G2/M期细胞比例提高(P<0.05),uPARmRNA表达量明显减少(P<0.01)。结论:As2O3能有效抑制肝癌细胞株SMMC-7721的生长,下调uPARmRNA的表达可能是其作用机制之一。     

维A酸注射液对人肝癌细胞SMMC-7721及其裸小鼠移植瘤的抑制作用

目的:研究维A酸注射液对人肝癌细胞SMMC-7721增殖的抑制作用及其对裸鼠移植瘤生长的影响。方法:采用细胞计数试剂盒检测不同浓度维A酸注射液对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用,计算半数抑菌浓度(IC50)。建立裸鼠SMMC-7721移植瘤模型,分为阴性对照组(n=12)、阳性对照(顺铂1mg.kg-1)组和维A酸低、中、高剂量(7.5、15、30mg.kg-1)组,后4组各6只。腹腔给予相应药物,每周连续给药5d后停药2d,共给药4周,每周检测各组裸小鼠体重、肿瘤体积(TV)、相对肿瘤体积(RTV)、相对肿瘤增殖率(T/C),及末次给药2d后移植瘤组织中凋亡细胞阳性率和半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达。结果:维A酸注射液对SMMC-7721细胞的IC50为(15.14±0.46)μg.mL-1。小鼠给药19d(治疗疗效最佳时间)时,与阴性对照组比较,其余各组TV、RTV均明显下降(P<0.05或P<0.01),体重无明显变化,T/C均小于60%;末次给药2d后,与阴性对照组比较,维A酸3个剂量组凋亡细胞阳性率和Caspase-3表达明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论:维A酸注射液能抑制SMMC-7721细胞的增殖及其裸小鼠移植瘤的生长,其机制可能与促进细胞凋亡和Caspase-3表达有关。     

阿司匹林对卵巢癌细胞凋亡及Bcl-2／bax基因mRNA表达的影响

目的探讨阿司匹林对卵巢癌细胞凋亡的影响及对凋亡相关基因的作用。方法培养卵巢癌细胞株SK-OV-3,用不同浓度阿司匹林进行干预,用Giemsa染色观察细胞形态学改变,流式细胞仪方法定量检测细胞的凋亡及细胞周期的变化,用RT-PCR法检测凋亡相关基因Bcl-2／bax表达。结果阿司匹林对SK-OV-3增殖的抑制率随作用时间的延长和药物浓度的增加而增加;阿司匹林作用后SK-OV-3细胞出现了典型的凋亡形态学变化,可见凋亡小体;不同浓度的阿司匹林处理细胞48h后,流式细胞术（FCM）显示细胞的凋亡呈剂量依赖性。1、5、10mmol／L阿司匹林诱导SK-OV-3细胞的凋亡率分别为（11．1±0．5）％、（17．9±0．4）％、（30．8±0．4）％均高于对照组（P〈0．01）;同时,随着阿司匹林浓度的增加,Co／G期细胞比例下降,G／M期细胞比例升高,细胞被阻断在G2／M期,细胞周期发生明显改变;阿司匹林作用后的卵巢癌细胞的凋亡相关基因Bcl-2表达降低,bax基因表达升高。结论阿司匹林能抑制卵巢癌细胞增殖,诱导其凋亡．且阿司匹林诱导SK-OV-3细胞凋亡是通过下调Bcl-2表达和上调bax表达,而达到抗肿瘤的作用。     

Anticancer effect of two diterpenoid compounds isolated from Annona glabra Linn

INTRODUCTION Traditional Chinese medicine afforded a valuableapproach in the searching for new anticancer drugs.Studies on the pharmacological mechanism and search-ing for new chemical structures from herbal extractfor new anticancer drugs caught great interest[1]. Taxol,isolated from the stem bark of Taxus brevifolia, pro-vided a typical example in this respect. Taxol was rankedas “the most important new drug we have had in can-cer for 15 years”[2]. Annonaceous acetogenius were …     

丙戊酸钠逆转组蛋白低乙酰化水平对肝癌细胞侵袭转移的体外实验研究

目的探讨丙戊酸钠(VPA)逆转组蛋白低乙酰化水平对体外培养的人肝癌细胞系SMMC-7721细胞体外侵袭、转移能力的影响及其可能的作用机制。方法流式细胞仪(FCM)分析不同浓度VPA对SMMC-7721细胞凋亡及细胞周期的影响;分别采用划痕试验,Transwell侵袭小室和细胞-基质黏附试验测定细胞体外迁移、侵袭和黏附能力;Western blot观察不同浓度VPA处理后HPA和PCNA蛋白的表达变化。结果 VPA诱导SMMC-7721细胞凋亡,阻滞细胞于G2/M期,抑制细胞增殖。VPA试验组细胞的侵袭、迁移能力以及黏附能力均显著低于对照组(P<0.05)。随浓度和时间增加,VPA能明显降低HPA和PCNA蛋白表达。结论 VPA可通过逆转染色体组蛋白低乙酰化水平,显著抑制肝癌细胞增殖,降低肝癌细胞侵袭、迁移和黏附能力。下调HPA和PCNA表达可能是其发挥作用的主要机制之一。     

HIF-1α反义寡核苷酸对肝癌细胞增殖凋亡的影响及机制

目的：本研究通过应用 HIF-1α反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）处理 SMMC-7721肝癌细胞,观察其对 SMMC-7721肝癌细胞增殖的作用和对细胞周期及凋亡率的影响及其机制。方法肝癌细胞系SMMC-7721分对照组和试验组。对照组细胞常规培养,试验组细胞施加 HIF-1α的 ASODN 干预,设浓度梯度和时间梯度。检测不同药物浓度、不同时间对 SMMC-7721细胞的增殖的作用及对细胞周期和凋亡率的影响。对 bcl-2、bax、surviving mRNA 表达产物相对定量,并对 SMMC-7721细胞胞浆 bcl-2、bax、survivin 蛋白进行相对定量分析。结果与对照组相比,各处理组 OD 值均有显著下降,细胞数量降低,且各实验组相比呈明显的时间-剂量依赖效应,差异有统计学意义（ P <0.05）。不同浓度 HIF-1α的 ASODN 处理细胞后,均可使各处理组 G0/ G1期细胞增多,S 期细胞减少,且呈时间-剂量依赖效应,差异有统计学意义（ P <0.05）。不同浓度 HIF-1α的 ASODN 处理细胞不同时间后,与对照组相比,各实验组 bcl-2 mRNA 和 survivin mRNA 表达均有显著下降,差异有统计学意义（ P <0.05）。而 bax 的 mRNA无明显变化趋势（ P >0.05）。不同浓度 HIF-1α的 ASODN 处理细胞不同时间后,与对照组相比,各实验组 bcl-2和survivin 的蛋白表达显著下降,bax 的蛋白表达显著增加,差异有统计学意义（ P <0.05）。结论 HIF-1α的 ASODN可以将 SMMC-7721肝癌细胞株阻滞于 G0/ G1期,影响细胞周期进程,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。HIF-1α促进增殖抑制凋亡的可能机制是上调肝癌细胞 Survivin 和 bcl-2的表达,下调 bax 的表达。针对 HIF-1α抑制剂的应用为肝癌的治疗提供了新思路。     

地塞米松对卵巢癌SKOV-3细胞的影响

目的研究地塞米松对体外培养条件下的卵巢癌细胞SKOV-3细胞增殖的影响及诱导其凋亡的情况。方法取对数生长期的SKOV-3细胞（细胞数为5×10^4／mL）分别接种于不同细胞培养板上,试验组每孔加入200μL不同浓度的地塞米松,空白对照组加入等体积PRMI-1640培养液孵育,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测吸光度（A490值）并计算SKOV-3细胞增殖抑制率;PI染色细胞后上流式细胞仪检测各个时间点的细胞凋亡率。结果MTT法检测结果显示,SKOV-3细胞增殖抑制率随着地塞米松浓度和作用时间的增加均明显增大,以40μmol／L浓度的试验组培养48h的抑制率最高,达（45．25±3．12）％。流式细胞仪检测显示。地塞米松处理后可引起G0／G1期细胞明显增加（P〈0．05）,且SKOV-3细胞凋亡率随着地塞米松浓度增加有升高趋势。结论地塞米松能诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡。