人前列腺干细胞抗原在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

目的:克隆并在大肠杆菌中表达人前列腺干细胞抗原(PSCA)基因,制备其抗血清.方法:通过PCR方法扩增包含蛋白融合点的PSCA基因片段,经DNA测序证实后克隆至带有Trx.6His标签的原核表达载体pET32a,重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达结果,经Ni-NTA树脂亲和纯化的蛋白皮下注射免疫小鼠,ELISA检测抗血清的滴度,免疫组化鉴定其特异性.结果:PCR扩增得到241 bp的目的片段,序列测定证实与GenBank上登录的序列一致;成功构建了PSCA基因片段的原核表达载体pET32a-PSCA;在大肠杆菌中表达,于相对分子质量为20.4×103处有一蛋白新生带;PSCA融合蛋白免疫小鼠后,ELISA确认抗血清的滴度>1∶4 000.抗血清检测到前列腺癌组织中PSCA的表达. 结论:成功克隆、表达了人PSCA融合基因片段,并制备了相应的抗血清.     

人PINK1抗血清的制备及其免疫活性物质在大鼠脑组织中的表达

目的制备帕金森病相关蛋白PINK1抗血清并检测其在大鼠脑组织中的表达特征。方法制备人PINK1基因重组蛋白,免疫新西兰大耳白兔获得抗PINK1抗血清;通过盐析法初步纯化、Western blotting法鉴定抗血清的敏感性和特异性、免疫组化法检测PINK1在大鼠脑中的分布。结果人PINK1基因重组蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达;纯化蛋白制备兔抗血清经盐析纯化后,兔抗人PINK1抗血清特异性识别人PINK1基因重组蛋白及大鼠脑匀浆中40000和66000的蛋白质,与预期结果一致;免疫组化染色显示PINK1广泛分布在嗅球、皮质、海马、纹状体、小脑、黑质和红核。结论制备了一种兔抗人PINK1多克隆抗血清;PINK1广泛分布于大鼠中枢神经系统;为以后深入研究PINK1表达的组织分布、细胞内定位及其生物学功能提供了有效地实验工具。     

多疣壁虎SPARCL1多克隆抗血清的制备及鉴定

目的：制备针对多疣壁虎SPARCL1的多克隆抗体,为深入研究SPARCL1基因功能奠定基础。方法：构建pGEX-4T1-SPARCL1质粒,在大肠杆菌BL21表达GST-SPARCL1蛋白,经亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔,获得SPARCL1抗血清,经酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测SPARCL1抗血清的效价,Western blot和免疫组化法检测多克隆抗体特异性。结果：成功构建多疣壁虎SPARCL1基因的原核表达质粒pGEX-4T1-SPARCL1,诱导得到较高纯度的GST-SPARCL1融合蛋白,免疫兔获得SPARCL1抗血清,经Western-blot及免疫组织化学实验显示所得抗体具有较高的效价及特异性。结论：成功获得较高效价特异性强的SPARCL1抗血清,为进一步深入研究多疣壁虎SPARCL1功能提供抗体工具。     

UROC28基因的原核表达及抗UROC28多抗制备和初步应用

目的: 在原核细胞大肠杆菌中融合表达UROC28基因产物,分离、纯化后制备其特异性多克隆抗体,并初步应用于肿瘤标本的检测,为进一步研究该分子的功能和组织分布等提供条件. 方法: 利用DNA重组技术将UROC28基因克隆入融合表达载体pRSET-c质粒,并在大肠杆菌BL-21中融合表达目的蛋白,回收后制备兔抗血清,Western blot鉴定抗体后,应用该抗体对前列腺癌石蜡切片进行免疫组化染色. 结果: His-UROC28融合蛋白的Mr约为22 000,与预期相符;融合蛋白占菌体总蛋白的20%. 目的蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,Western blot结果显示制备的抗UROC28多克隆抗体具有较高的特异性,无明显交叉反应,并成功在前列腺癌组织标本中检测UROC28的表达. 结论: 本研究成功构建了UROC28融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达. 制备了该分子的多克隆抗体,经初步验证其效价高、特异性好,为深入研究UROC28的功能及其与疾病的关系创造了条件.     

巢蛋白的克隆、表达、抗体制备及免疫组化分析

目的 在原核系统中克隆、表达并纯化巢蛋白（nestin）．制备特异性nestin抗体,用于研究nestin在中枢神经系统发育中的生物学特性．探索神经发育及再生规律。方法 采用RT—PCR方法由人神经干细胞中获取nestin cDNA,与原核表达载体pQE30连接,构建重组载体pQE30-nestin。测序后．将重组质粒转入大肠杆菌M15,IPTG诱导表达His融合蛋白。Ni-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE电泳和Westem blotting鉴定。用此蛋白免疫BALB／c小鼠,获得抗血清。Westemblotting、ELISA和免疫组织化学分析鉴定获取的抗血清。结果 成功由人神经干细胞中克隆nestin cDNA片段。胛G诱导重组质粒pQE30-nestin表达出一相对分子质量约25000的His融合蛋白并被Ni．NTA成功纯化．Westem blotting证明其确为nestin蛋白。动物免疫后．经Westem blotting、ELISA和免疫组化鉴定,获得的抗血清可特异性结合重组nestin蛋白、发育期人及大鼠脑内的nestin蛋白。结论 获得了重组人nestin蛋白．制备的抗血清不仅可识别重组nestin蛋白,亦可识别人及大鼠脑组织内的nestin蛋白。     

犬博卡病毒非结构基因NP1多克隆抗体的制备与鉴定

目的: 制备犬博卡病毒(MVC)的非结构基因NP1的兔多克隆抗体,并进行特异性鉴定。方法: 以MVC的感染性克隆pI-MVC为模板,构建NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,转化大肠杆菌BL21 后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG) 诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NP1蛋白。用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备NP1抗血清并用ELISA法测定抗血清效价。采用Western blotting和免疫荧光法检测NP1抗血清的特性。结果: 成功构建MVC NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的NP1融合蛋白,以其免疫大白兔获得NP1多抗血清,ELISA法检测效价达到1:400 000。Western blotting法及免疫荧光检测,所得抗血清具有较高的效价及特异性。 结论: 本研究利用原核表达的MVC GST-NP1 融合蛋白制备的NP1抗血清效价高、特异性高,为进一步深入研究NP1在MVC感染及致病分子机制中的作用奠定了基础。     

生精相关基因mTSARG3的原核表达和抗体制备

目的 构建小鼠生精相关基因pGEX-KG/mTSARG3重组载体,进行原核表达和多克隆抗体制备.方法 应用RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mTSARG3的开放阅读框,T-A克隆后将mTSARG3插入到原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入宿主菌E.coliBL21,IPTG诱导表达GST/mTSARG3融合蛋白,采用SDS-PAGE和Westernblotting对融合蛋白进行分析和鉴定.以融合蛋白为免疫原免疫家兔,制备抗mTSARG3多克隆抗体并进行Westernblotting鉴定.结果 成功构建了pGEX-KG/mTSARG3重组质粒,测序结果与预期一致;转化重组质粒的E-coliBL21经IPTG37℃诱导4h后高效表达GST/mTSARG3融合蛋白:Westernblotting实验结果显示制备抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了mTSARG3基因的原核表达和多克隆抗体制备,为下一步的功能研究奠定基础.     

抗BACP1抗体的制备及鉴定

目的: 制备抗BACP1多克隆抗体并鉴定其特异性,用于BACP1蛋白定位及功能研究. 方法: 大肠杆菌表达GST-BACP1融合蛋白,采用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清. 采用Western Blot和间接免疫荧光染色等方法鉴定抗体的特异性. 结果: 抗BACP1抗体用于Western Blot和间接免疫荧光染色均可特异性识别BACP1蛋白,具有较高的特异性. 结论: 所制备的多克隆抗体具有较高特异性,为进一步分析BRACP1的定位和功能提供了重要工具.     

杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶重组蛋白的纯化及其多克隆抗体制备

目的：纯化杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）重组蛋白,制备多克隆抗体。方法：PCR扩增得到两端分别添加NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点的GPI基因,双酶切后插入原核表达载体pET28a（＋）,得到重组载体pET28a-GPI,经鉴定正确后,用该重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达后用镍离子柱纯化目的蛋白并免疫新西兰白兔,间接ELISA和Westernblot法检测抗体的效价和特异性。结果：杜氏盐藻GPI基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达,占总蛋白的41.6%。以高纯度的目标蛋白作为抗原免疫新西兰白兔,得到抗GPI的抗血清。间接ELISA检测抗血清效价达到1：512000,Westernblot检测证实抗血清能与目的蛋白特异性结合。结论：成功纯化了杜氏盐藻GPI重组蛋白并制备了特异性的GPI多克隆抗体。     

人类疱疹病毒6型U94基因克隆?表达?纯化及抗体制备

目的:制备人类疱疹病毒6型U94蛋白及其抗体.方法:PCR扩增U94基因,经测序后克隆到原核表达载体PGEX-6p-1中.重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,诱导蛋白表达.应用酶切鉴定、SDS-PAGE及Western blot等方法确保基因片段的正确性及表达蛋白的特异性.表达的蛋白经亲和层析纯化.纯化的蛋白免疫动物制备抗血清.结果:成功地获得了高纯度的U94融合蛋白,纯度可达90%以上.用其制备多克隆抗体滴度可达1:100 000.结论:获得高纯度的U94融合蛋白及其高效价的抗体.     

p11融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备

目的：表达GST－p11和6xHis-p11融合蛋白并制备GST－p11特异性抗体。方法：将人p11基因克隆人两种原核表达载体pGEX-4T-2和pQE30,分别在大肠杆菌BL21和M15中表达，用Glutathione Sepharose 4B和Ni-NTA agarose亲和柱分别纯化目的蛋白。利用纯化的GST－p11蛋白制备多克隆抗体。结果：得到高表达量的融合蛋白，经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST－p11和6xHis-p11蛋白。以GST－p11蛋白免疫新西兰兔得到p11多克隆抗体，Westernblotting证实该杭体能够识别6xHis-p11蛋白，具有较高特异性。结论：利用原核表达人p11融合蛋白制备的p11多克隆抗体具有较好的特异性，为研究p11蛋白在蛋白转运和定位过程中的作用提供重要的技术和材料保障。     

人L-选择素的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建人L-选择素原核表达载体,表达并纯化人L-选择素重组蛋白,制备兔抗人L-选择素多克隆抗体。方法：利用人L-选择素cDNA的N末端胞外结构区153个氨基酸的开放阅读框架(ORF),通过PCR方法扩增出人L-选择素目的片段。将扩增的基因插入表达载体pQE40的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点之间,再经转化使其在大肠杆菌M15中表达,产生含6-His-tag的融合蛋白。融合蛋白经Ni亲合层析柱纯化和SDS-PAGE分析后,用以免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。最后经Western blotting检测和斑点杂交（DIBA）进行抗体效价测定。结果：酶切鉴定和DNA测序显示,pQE40-L-选择素重组表达载体含有人L-选择素N末端结构区153个氨基酸的cDNA序列;通过在大肠杆菌M15中的表达和纯化分析,获得了蛋白含量为600 mg·L^-1的人L-选择素蛋白;通过免疫新西兰白兔和抗体效价测定,得到抗血清效价达1∶1 000的多克隆抗体。结论：人L-选择素蛋白可在M15大肠杆菌中高效表达,其多克隆抗体效价较高。     

BLCAP蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达BLCAP融合蛋白并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a(+)-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,诱导表达带有His标签的目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收后免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性和亲和性。结果:成功获得分子质量约为28 kU纯化的融合蛋白,免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP的多克隆抗体。ELISA测定显示抗体效价可达到1∶10 000。通过Western blot检测证明该抗体有较好的针对BLCAP蛋白的专一性。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性。制备的特异性和效价良好的抗BLCAP的多克隆抗体,能够满足针对BLCAP免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为今后深入研究BLCAP蛋白性质与功能提供了有用的实验工具。     

p11融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备

目的 :表达GST p11和 6xHis p11融合蛋白并制备GST p11特异性抗体。方法 :将人p11基因克隆入两种原核表达载体pGEX 4T 2和pQE30 ,分别在大肠杆菌BL2 1和M15中表达 ,用GlutathioneSepharose 4B和Ni NTAagar ose亲和柱分别纯化目的蛋白。利用纯化的GST p11蛋白制备多克隆抗体。结果 :得到高表达量的融合蛋白 ,经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST p11和 6xHis p11蛋白。以GST p11蛋白免疫新西兰兔得到p11多克隆抗体 ,Westernblotting证实该抗体能够识别 6xHis p11蛋白 ,具有较高特异性。结论 :利用原核表达人p11融合蛋白制备的p11多克隆抗体具有较好的特异性 ,为研究p11蛋白在蛋白转运和定位过程中的作用提供重要的技术和材料保障     

肺炎链球菌丝氨酸-苏氨酸激酶基因的原核表达及免疫血清的制备

目的制备抗肺炎链球菌(S.pn)丝氨酸-苏氨酸激酶(STKP)基因的特定区域的免疫血清,为疫苗研究奠定基础。方法 PCR扩增S.pn STKP蛋白C末端314个氨基酸区域的基因,将其克隆入pMD19-T载体,将鉴定正确的STKP基因从pMD19-T载体亚克隆至PET-32a(+)原核表达载体进行诱导表达;获得的可溶性蛋白经Ni2+柱纯化及Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗STKP血清,间接ELISA鉴定抗体效价,Western blot鉴定免疫血清特异性。结果成功将STKP基因特定序列克隆入PET-32a(+)原核表达载体并诱导表达,形式以可溶性表达为主,经Ni2+柱层析法纯化STKP,纯度达92%,免疫家兔制备出STKP免疫血清,间接ELISA检测抗体效价为1∶100 000,Western blot证实免疫血清能与目的蛋白特异结合。结论获得STKP重组蛋白及免疫血清,重组表达产物具有免疫原性,为S.pn多价联合蛋白疫苗研制奠定了基础。     

抗P37多克隆抗体的制备 纯化与鉴定

目的：用P37融合蛋白免疫动物制备抗血清,为猪鼻支原体感染作用的分子机制提供依据。方法：诱导表达GST-P37蛋白并以其免疫兔制备免疫血清,ELISA法检测抗血清的效价;Western blot-ting检测抗血清特异性。结果：免疫家兔并纯化抗血清得到特异的抗P37抗体,该抗体能检测到P37蛋白的表达。结论：成功制备了抗P37的多克隆抗体,对进一步研究P37的功能提供了一个有用的工具。     

HZF1在大肠杆菌中的表达及多克隆抗体的制备

目的在大肠杆菌中表达HZF1融合蛋白,制备抗HZF1抗体。方法构建包含编码HZF1非锌指区DNA的重组表达质粒pET30a-HZF1,转化大肠杆菌并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达相应的融合蛋白,采用镍柱纯化。以纯化蛋白作为免疫抗原,对新西兰大白兔实施多次免疫(间隔时间分别为3、2和2周)。用ELISA和Westernblot检测抗体效价和特异性。结果获得兔抗HZF1抗体,经过ELISA检测,效价在1:100000以上。Westernblot显示兔抗HZF1抗体能够特异性检测氯高铁血红素诱导的K562细胞中的HZF1蛋白。结论得到高特异性的兔抗HZF1抗体,为HZF1的功能研究以及组织和细胞中HZF1的检测奠定了一定基础。     

人LINGO-1aa76-319蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的人LINGO-1胞外段(hLINGO-1_(aa76-319))融合蛋白,并制备兔源性抗hLINGO-1_(aa76-319)的多克隆抗体(pAb).方法 利用PCR从pCMV-SPORT6获得hLINGO-1_(aa76-319)编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-hLINGO-1_(aa76-319);将阳性重组质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达6×His-hLINGO-1_(aa76-319)融合蛋白,经Ni-NTA螯合树脂纯化,纯化蛋白免疫新两兰大白兔制备多克隆抗血清,Protein A Sepharose柱纯化获得多抗,ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性.结果 成功构建了pET30a(+)-hLINGO-1_(aa76-319)原核表达载体,原核蛋白hLINGO-1_(aa76-319)以包涵体形式在大肠杆菌高水平表达,通过复性与亲和层析获得纯度在90% 以上的hLINGO-1_(aa76-319)蛋白,蛋白浓度为4600 mg/L,制备的抗hLINGO-1_(aa76-319)多抗效价高达1:1.6×106,Western blotting鉴定其具有良好的特异性.结论 获得高纯度hLINGO-1_(aa76-319)蛋白并成功制备特异性pAb,为进一步研究LINGO-1的生物学功能提供实验基础.

Abstract：

Objective To express and purify the fusion protein of extracellular domain of human Ig domain-containing, neurite outgrowth inhibitor (Nogo) receptor-interacting protein-1 (LINGO-1_(aa76-319)) in prokaryotic cells and prepare the rabbit anti-LINGO-1 polyclonal antibody (pAb). Methods The 732 bp DNA sequence of hLINGO-1_(aa76-319), was obtained from pCMV-SPORT6 by PCR and inserted into pET30a (+) plasmid to construct the prokaryotic expression plasmid pET30a(+) -hLINGO-1_(aa76-319) which was subsequently transformed into E.coli. The target fusion protein was expressed with IPTG induction and purified by Ni~(2+)-NTA affinity chromatography column. The antiserum against hLINGO-1_(aa76-319) was obtained from the rabbits immunized with hLINGO-1 _(aa76-319), and the titer of the pAb was determined using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and its specificity identified using Western blotting. Results The prokaryotic expression plasmid pET30a (+)-hLINGO-1_(aa76-319) was constructed successfully. Efficient expression of the target fusion protein was achieved with IPTG induction at the optimal concentration of 0.4 mmol/L and culture temperature at 37 ℃ for 2.5 h. The hLINGO-1_(aa76-319) fusion protein was effectively expressed in E.coli as inclusion bodies, and the soluble protein was obtained through denaturation and refolding procedures, and the purified fusion protein showed a purity above 90%. The titer of the anti-hLINGO-1_(aa76-319) pAb obtained by immunizing the rabbits with the purified protein reached l:1.6×10~6, and Western blotting confirmed its good specificity. Conclusion The fusion protein hLINGO-1_(aa76-319) with high purity has been obtained and the anti-hLINGO-1_(aa76-319) pAb obtained shows a high titer and good specificity, which provide important experimental basis for further functional investigation of LINGO-1.     

人钠/二羧基转运蛋白2融合蛋白载体的构建及其原核表达

目的：观测和鉴定人钠／二羧基转运蛋白2(hSDCT2)在大肠杆菌中的表达，并分离、纯化其蛋白产物。方法：应用：DNA重组技术，构建重组表达质粒pGEX-hSDCT2；IPTG诱导其表达。采用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B亲和层析纯化GST-hSDCT2，经Factor Xa酶切和二次亲和层析后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blotting进行鉴定。结果：成功构建hSDCT2基因融合蛋白载体，SDS-PAGE及Western Blotting显示GST-hSDCT2融合蛋白表达于原核细胞，蛋白产量约占菌体总蛋白量的25％。经酶切及二次纯化后，获得纯化的hSDCT2蛋白。结论：人钠／二羧基转运蛋白2可在大肠杆菌中稳定表达。