蛇床子素对转染APP595/596基因的SH-SY5Y细胞的保护作用

目的:研究蛇床子素对转染APP595/596基因的SH-SY5Y细胞的作用,以探讨其可能的作用机制。方法:体外培养SH-SY5Y细胞,并转染APP595/596基因,体外构建研究Aβ致病作用的细胞模型。采用CCK-8法检测细胞存活率;检测LDH评价细胞的损伤程度;流式细胞术检测细胞凋亡;用RT-PCR和Western blot法检测β-分泌酶(又称β位点APP裂解酶1,β-site APP cleaving enzyme 1,BACE 1)的mRNA及蛋白的表达;采用免疫荧光细胞化学和Western blot法检测Aβ的表达。结果:蛇床子素对转染APP595/596基因的SH-SY5Y神经细胞有保护作用,可增加细胞的存活率,降低LDH的释放,抑制细胞的凋亡,减少BACE1的mRNA与蛋白的表达,抑制Aβ的生成。结论:蛇床子素可保护转染APP595/596基因的SH-SY5Y神经细胞,其保护机制可能与减少BACE l的mRNA与蛋白表达有关。     

α7神经型尼古丁受体的神经保护作用及其与阿尔茨海默病发病的关系

目的探讨α7神经型尼古丁受体（nAChR）表达改变与淀粉样蛋白前体蛋白（APP）代谢、细胞存活率及脂质过氧化水平的关系,以了解α7 nAChR的神经保护作用,以及该受体水平与阿尔茨海默病发病的关系。方法设计并合成α7 nAChR基因特异性小分子干扰RNA（siRNA）,转染SH-SY5Y细胞;用20μmol／LDMXB处理细胞;培养48h后收集细胞,分别应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot方法检测转染细胞及DMXB处理后的细胞α7 nAChR mRNA及蛋白表达水平的变化;并用1μmol／L β-淀粉样肽25-35（Aβ25-35处理细胞,测定分泌型APP、总APP蛋白表达的变化;比色法测定脂质过氧化产物含量;MTT方法测定细胞活力。结果转染siRNA后,与对照组相比,α7 nAChR mRNA及蛋白表达量降低（抑制率分别为80％和69％）、脂质过氧化产物丙二醛含量明显增加、分泌型APP表达下降、细胞活力明显低于对照组,且能增强Aβ的细胞毒性作用;用DMXB处理细胞后能使α7 nAChR的表达增加23％、增加分泌型APP的表达、并能对抗Aβ引起的细胞活力下降及脂质过氧化水平的增强。结论α7 nAChR可能通过增强α-分泌酶对APP的切割、增强细胞抗氧化能力及对抗Aβ的神经毒性作用来发挥神经保护作用,其表达减少与阿尔茨海默病的发病机制有密切的关系。     

RNA干扰抑制α3神经型尼古丁受体的表达对SH-SY5Y神经细胞抗氧化能力的影响

目的 探讨通过RNA干扰技术抑制α3神经型尼古丁受体(nAChR)基因表达后该受体对神经细胞抗氧化能力的影响,来了解α3 nAChR的神经保护作用.方法 设计并体外合成α3 nAChR的特异性编码siRNA序列的寡核苷酸,退火后克隆至pSilencer 3.1-H1 nco质粒中,构建重组质粒α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo.将α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo转染SH-SYSY细胞,用含G418的培养液筛选,挑选阳性克隆后采用即时荧光定量PCR和Western blot方法检测转染细胞中α3 nAChR mRNA及蛋白表达水平的变化.用1 μmo1/Lβ淀粉样肽1-42(Aβ1-42)处理转染细胞后,用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法测定细胞活力;用比色法测定其脂质过氧化产物含量、超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性.结果 成功构建α3 nAChR siRNA表达质粒,转染后经G418筛选获得稳定转染重组质粒的细胞克隆株,与对照组相比,α3 nAChR mRNA及蛋白表达量均降低(抑制率分别为98%和66%);经转染处理的细胞活力明显低于对照组,细胞中脂质过氧化产物丙二醛含量明显增加,超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性不同程度的降低;抑制α3 nAChR基因表达后能增强Aβ的神经细胞毒性作用.结论 成功构建的α3 nAChR siRNA表达质粒能特异性抑制α3 nAChR基因表达,α3 nAChR基因表达抑制后可引起氧化应激水平升高,并增加Aβ的神经毒性,表明α3 nAChR具有一定的抗氧化能力和神经保护作用.     

依达拉奉通过microRNA-25抑制高糖诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

目的:探讨依达拉奉通过微小RNA-25(microRNA-25,miR-25)对高糖诱导的人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法:将SH-SY5Y细胞用含高浓度葡萄糖的DMEM培养基和依达拉奉的联合培养液共同培养24 h。MTT比色法测定SH-SY5Y细胞存活率;DCFH-DA荧光探针法检测SH-SY5Y细胞中活性氧簇(ROS)的水平;采用流式细胞术检测SH-SY5Y细胞的凋亡率;Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平;实时定量PCR检测细胞中miR-25的表达水平。为进一步阐明依达拉奉抑制高糖诱导的神经细胞凋亡的作用靶点,我们将miR-25抑制剂应用于细胞,之后采用caspase-3凋亡试剂盒检测细胞的凋亡率。结果:与对照组相比,高糖诱导后细胞存活率明显降低,细胞中的ROS水平和细胞凋亡率明显升高,Bax的表达明显增加,Bcl-2的表达明显降低,miR-25的表达水平也明显降低。给予依达拉奉治疗之后,细胞存活率明显升高,ROS含量和细胞凋亡率明显降低,Bax的蛋白水平明显降低,Bcl-2蛋白水平明显升高,miR-25的表达水平亦明显升高。进一步给予miR-25抑制剂后,caspase-3的水平明显升高,此时同时给予依达拉奉后并不能抑制高糖引起的神经细胞的凋亡。结论:依达拉奉对高糖诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有抑制作用,其作用靶点可能是miR-25。     

人AMPKα2基因pEGFP-N1-AMPKα2表达载体的构建和鉴定

目的 构建表达人单磷酸腺苷激活的蛋白激酶催化亚单位α2(AMPKα2)基因的pEGFP-N1-AMPKα2载体,转染SH-SY5Y细胞系,观测其上调AMPKα2基因的效果.方法 PCR法扩增AMPKα2基因片段,克隆到pEGFP-N1质粒载体上.对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析.用质脂体将重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2转染到SH-SY5Y细胞系,经G418筛选阳性克隆后,用RT-PCR和Western blot法检测AMPKα2的mRNA和蛋白表达.流式细胞仪检测转染重组质粒细胞内ROS变化.结果 经DNA测序和酶切鉴定表明,pEGFP-N1-AMPKα2表达载体构建成功.重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2转染SH-SY5Y细胞系后,细胞中AMPKα2蛋白表达量明显增高.SH-SY5Y细胞转染pEGFP-N1-AMPKα2后,ROS含量增多.结论 成功构建了人AMPKα2基因的pEGFP-N1-AMPKα2表达载体.pEGFP-N1-AMPKα2能有效上调AMPKα2基因在SH-SY5Y细胞系中的表达,为将来应用其研究AMPK在局麻药致细胞损伤中的作用奠定了基础.     

P38MAPK的激活上调SH-SY5Y细胞APP表达及组蛋白H3乙酰化水平

目的研究P38MAPK信号通路的激活对淀粉前体蛋白(APP)表达的影响及其相关表观遗传学机制。方法体外培养神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),Western blot法检测SH-SY5Y的APP蛋白表达及组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的表达;吸光度值法检测组蛋白3(H3)和组蛋白4(H4)整体乙酰化水平。结果 P38MAPK信号通路经特异性激动剂激活SH-SY5Y 72 h后,APP表达明显增高至对照组的1.5倍(0.41±0.09vs0.28±0.08,P<0.01);同时组蛋白H3整体乙酰化水平增高(0.20±0.04vs0.06±0.03,P<0.01),但H4乙酰化水平无明显改变;组蛋白乙酰化酶CBP表达增高至对照组的2.5倍(0.30±0.03vs0.11±0.05,P<0.01),而组蛋白去乙酰化酶HDAC3表达下降至对照组的40%(0.19±0.05vs0.49±0.03,P<0.01)。结论 P38MAPK信号通路可能通过上调组蛋白乙酰化水平增加SH-SY5Y的APP蛋白表达。     

miR-449a过表达抑制人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y增殖并促进其凋亡

目的探讨miR-449a对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y的增殖和凋亡的影响。方法用Lipofectamine TM2000将miR-449a模似物或miR-449a对照转染至SH-SY5Y细胞,分为空白、miR-449a模似物和miR-449a对照SHSY5Y细胞组;实时荧光定量PCR(q-PCR)检测各组细胞中miR-449a表达;CCK8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡和周期,Western blot检测c-Myc蛋白和Bax/Bcl-2蛋白表达。结果 miR-449a模似物瞬时转染SH-SY5Y细胞后,miR-449a的表达水平明显高于正常对照组(P0.05);SH-SY5Y细胞增殖能力受到明显抑制(P0.05);凋亡率明显增加(P0.05);c-Myc蛋白表达显著降低(P0.05);细胞促凋亡蛋白Bax表达升高;抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P0.05)。结论 miR-449a可通过c-Myc影响SH-SY5Y细胞的增殖和周期,通过调节Bax/Bcl-2影响其凋亡。     

SH-SY5Y细胞高表达糖原合成激酶3β对tau蛋白磷酸化和微管稳定性的影响

目的：构建高表达糖原合成激酶3β（GSK3β）的SH-SY5Y（人骨髓神经母细胞瘤细胞）转基因细胞模型,观察GSK3β高表达对宿主细胞tau蛋白磷酸化、微管稳定性的影响。 方法：构建GSK3β真核表达质粒,转染SH-SY5Y细胞,使GSK3β在SH-SY5Y细胞中得到高表达,应用蛋白免疫印迹方法,观察tau蛋白磷酸化、总tau蛋白、微管蛋白乙酰化水平的变化情况。 结果：GSK3β真核表达质粒转染SH-SY5Y细胞36 h后,GSK3β在SH-SY5Y细胞中的表达达到高峰,tau蛋白Ser199/202、Thr231、Thr205等位点的磷酸化水平在转染后48 h达到高峰; tau蛋白总量未有明显变化。转染后60 h,微管蛋白乙酰化水平明显减低。 结论：高表达GSK3β的SH-SY5Y细胞可使tau蛋白的磷酸化水平增高,从而降低tau蛋白结合和稳定微管蛋白的能力,导致微管蛋白乙酰化水平明显减低。     

miR-221促进神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞N-MYC表达和细胞增殖

目的探讨过表达miR-221对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中N-MYC表达及其细胞增殖能力的影响。方法构建miR-221过表达慢病毒载体并建立稳定转染细胞系,实验设未处理组、空载组和miR-221组,以实时定量荧光PCR(RT-q PCR)检测miR-221表达;以RT-q PCR和Western blot检测N-MYC mRNA及蛋白表达;流式细胞术检测细胞周期;CCK8法检测细胞增殖。结果经测序证实慢病毒载体构建成功,与未处理的SH-SY5Y细胞相比,稳定表达miR-221的SH-SY5Y细胞(miR-221组)miR-221表达升高约7倍(P0.01);miR-221组N-MYC mRNA和蛋白表达水平较未处理组显著增多(P0.01);miR-221组G0/G1期细胞比例明显减少(P0.05),S期细胞比例显著增多(P0.05);miR-221组细胞增殖能力明显增强(P0.01)。结论过表达miR-221能够上调神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中N-MYC的表达,并可能通过促发细胞从G0/G1期向S期转化促进细胞增殖。     

HuD在N2aAPP细胞和APP/PS1转基因小鼠中的表达

目的研究RNA结合蛋白HuD在AD细胞和动物模型中的表达水平,探讨HuD与AD的关系;明确PI3K/AKT通路对神经细胞HuD表达的调控作用。方法免疫荧光检测HuD在C57BL/6小鼠脑组织中的表达水平;构建过表达APP的N2a APP细胞模型,Western blot检测HuD的表达情况;购买APP/PS1转基因小鼠,Western blot检测HuD在脑组织中的表达情况;应用LY294002处理3种神经细胞(N2a、SH-SY5Y和HT22),阻断PI3K/AKT通路,观察该通路对HuD的调控作用。结果 HuD在整个C57BL/6小鼠脑组织中均有表达,且在海马体的颗粒细胞尤为明显;在N2a APP细胞,HuD的表达水平明显低于对照组;APP/PS1转基因小鼠脑组织中的HuD水平也低于野生对照鼠;LY294002处理下调了HuD在神经细胞中的表达水平。结论 HuD在N2a APP细胞和APP/PS1转基因小鼠中均呈低表达;HuD在神经细胞中受PI3K/AKT通路的调控,为研究HuD与AD的关系及寻找新的AD诊断和治疗靶点提供了理论基础。     

Tenuigenin treatment decreases secretion of the Alzheimer's disease amyloid beta-protein in cultured cells

Amyloid beta-protein (A beta) is a pivotal pathological factor in Alzheimer's disease (AD). Tenuigenin, extracted from the Chinese herb Polygala tenuifolia, seems to ameliorate the reduction in cholinergic function on rat models induced by A beta. To examine this therapeutic effect, we tested whether Tenuigenin could inhibit secretion of A beta in neuroblastoma cells stably transfected with two amyloid precursor protein (APP) constructs: the APP695 cDNA (SH-SY5Y APP695) and the C-terminal 99 amino acid residues of APP plus the signal peptide (SH-SY5Y SPA4CT). Tenuigenin inhibited the secretion of A beta and the C-terminal 99 amino acids of APP (C99) in SH-SY5Y APP695 cells, but did not change the A beta and C99 levels in SH-SY5Y SPA4CT cells. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assays showed that Tenuigenin inhibited the proteolytic activities of BACE1 (beta-secretase) on its substrate in vitro. In addition, Tenuigenin did not demonstrate any cytotoxic effects, nor did it affect APP mRNA expression, holoAPP synthesis or sAPP alpha secretion. Our data suggest that Tenuigenin can inhibit the secretion of A beta in SH-SY5Y APP 695 cells via BACE1 inhibition. Taken together, these results suggest that Tenuigenin may be worthy of future study as an anti-AD drug.     

α-突触核蛋白在体外培养SH-SY5Y细胞内过表达可导致氧应激

目的：观察α-突触核蛋白基因在SH-SY5Y细胞内过表达对细胞的影响。 方法： LipofectAMINE法转染SH-SY5Y细胞，用G418对转基因细胞进行筛选，免疫荧光细胞化学检测α-突触核蛋白表达，氧化应激敏感的荧光素探针DCF-DA对活细胞进行染色后用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞内氧应激状况，还原型谷胱甘肽测定试剂盒通过分光光度计检测细胞内还原型谷胱甘肽水平。 结果： 转染细胞筛选后，细胞呈α-突触核蛋白免疫反应阳性；转α-突触核蛋白基因细胞内存在DCF信号增强和还原型谷胱甘肽水平下降。 结论： α-突触核蛋白过表达可引起细胞内氧应激，表明α-突触核蛋白在帕金森病发病机制中可能起重要作用。     

阿尔茨海默病发病机制中β淀粉样蛋白对星形胶质细胞和神经细胞α7尼古丁受体的影响

目的 探讨阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）患者脑组织和高表达β淀粉样蛋白前质蛋白（APP）转基因小鼠脑组织中α7尼古丁受体亚型的改变,以及β淀粉样蛋白（Aβ）对体外培养的星形胶质细胞和神经细胞中α7尼古丁受体亚型蛋白表达的影响。方法 选取尸解后AD患者脑组织和高表达APP转基因小鼠脑组织,用免疫组织化学方法（ABC法）检测人脑组织中胶质细胞和神经细胞α7尼古丁受体的表达,用Westernblot方法测定小鼠脑组织中α7尼古丁受体蛋白含量;体外培养星形胶质细胞和神经细胞,用不同浓度的A1325-35进行处理,然后用Westernblot方法测定细胞中α7尼古丁受体蛋白水平。结果 AD患者脑组织中星形胶质细胞数量增多,并密集于老年斑周围;AD患者脑组织表达d7尼古丁受体的星形胶质细胞增多,而表达α7尼古丁受体的神经元减少;高表达APP转基因小鼠脑组织中胡尼古丁受体蛋白水平升高49％;用不同浓度的Aβ25-35处理培养细胞后,星形胶质细胞中胡尼古丁受体蛋白水平增高（达38％）,而神经细胞中胡尼古丁受体蛋白水平减少可达32％。结论 神经元α7尼古丁受体减少可能与AD患者智力障碍的发生有关,而过多Aβ刺激星形胶质细胞后所引起的胶质细胞胡尼古丁受体表达增多则可能是一种神经保护性代偿方式。     

α-synuclein-EGFP在体外培养SH-SY5Y细胞中过表达对包涵体形成及线粒体结构改变的影响

为了观察 α-synuclein-p EGFP真核载体在 SH-SY5 Y细胞内表达状况及其对细胞的影响 ,本研究用 L ipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ,用荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,用荧光免疫细胞化学法检测α-synuclein蛋白表达以及用 H-E染色、光学显微镜观察转基因表达产物在细胞内的积聚 ,电镜观察转基因细胞超微结构形态学变化 ,rhodamine12 3染色、荧光显微镜检测线粒体跨膜电位变化。结果证明 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,在细胞内同时表达报告基因和目的基因 ;外源基因的表达产物可在细胞内积聚形成包涵体并引起线粒体结构和功能改变。本研究结果提示 ,本实验获得的细胞模型可模拟 Parkinson病发生过程中一些基本的神经病理学特点 ,可为进一步探讨 Parkinson病患者多巴胺能神经元变性缺失机制提供依据     

Nicotinic acetylcholine receptors in human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells.

Whole-cell patch-clamp recordings were used to investigate nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in the human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. Acetylcholine, nicotine and the neuronal nAChR agonist dimethylphenylpiperazinium iodide (DMPP), but not muscarine, all evoked inward currents in the cells (voltage-clamped at -60 mV). DMPP's actions were concentration- and voltage-dependent, and were antagonised by the neuronal nAChR antagonist mecamylamine (1-3 microM). Atropine was ineffective at 0.1 microM, but at 1 microM caused significant reductions in current amplitudes. Pre-incubation of cells with 2 microM alpha-cobratoxin had no effect on the actions of DMPP, and inward currents could also be induced when extracellular NaCl was replaced with CaCl2. DMPP also reversibly depolarized SH-SY5Y cells. These findings clearly identify nAChRs in SH-SY5Y cells, and provide two possible mechanisms by which receptor activation may lead to noradrenaline release, namely by triggering Ca2+ influx through the nAChR itself or by opening voltage-gated Ca2+ channels.     

L-3-n-butylphthalide regulates amyloid precursor protein processing by PKC and MAPK pathways in SK-N-SH cells over-expressing wild type human APP695

Amyloid precursor protein (APP) is cleaved by α-secretase, within the amyloid-β (Aβ) sequence, resulting in the release of a secreted fragment (αAPPs) and precluding Aβ production. We investigated the effects of a promising anti-AD new drug, l-3-n-butylphthalide (L-NBP), on APP processing and Aβ generation in neuroblastoma SK-N-SH cells overexpressing wild-type human APP695. L-NBP significantly increased αAPPs release, and reduced Aβ generation. The steady-state full-length APP levels were unaffected by L-NBP. It suggested that L-NBP regulated APP processing towards to the non-amyloidogenic α-secretase pathway. Protein kinase C (PKC) and mitogen activated protein (MAP) kinase might be involved in L-NBP-induced αAPPs secretion. L-NBP significantly increased PKCα and ? activations, lowered PKCγ activation and increased the phosphorylation of p44/p42 MAPK. Furthermore, PKC and MAPK inhibitors partially reduced L-NBP-induced αAPPs secretion. The results suggested alternative pharmacological mechanisms of L-NBP regarding the treatment of Alzheimer's disease (AD).     

Decoy mRNAs reduce beta-amyloid precursor protein mRNA in neuronal cells

Overproduction of amyloid precursor protein (APP) and beta-amyloid likely contribute to neurodegeneration in Alzheimer's disease (AD). In an effort to understand neuronal APP gene regulation, we identified a 52 base element (52sce) immediately downstream from the stop codon that stabilizes APP mRNA. Deletion of this domain drastically destabilized APP mRNAs and reduced APP synthesis in vitro. Chimeric globin-APP mRNAs containing the globin coding sequence fused to the entire APP 3'-UTR, showed regulation similar to full-length APP mRNA. A variety of cytoplasmic lysates contain 52sce RNA binding activity, suggesting cis-trans interactions regulate the element's functionality. Finally, the overexpression of chimeric mRNAs, containing the GFP coding sequence and APP 3'-UTR, dramatically reduced endogenous APP steady-state levels in SH-SY5Y neuroblastoma cells and suggests a novel approach to reduce the amyloid burden in AD patients.