甲基叔丁基醚对大鼠肝组织基因表达的影响

目的甲基叔丁基醚（ＭＴＢＥ）是一种新型的汽油添加剂,动物试验显示其具有一定的致癌性。为了解其动物致癌性的可能机制,我们检测了经ＭＴＢＥ亚慢性染毒的大鼠肝组织中原癌基因ｃｍｙｃ基因和功能基因谷胱甘肽Ｓ转移酶Ｐ（ＧＳＴＰ）基因的表达情况。方法４０只雄性ＳＤ大鼠,体重１８０～２００ｇ,随机分为４组。将ＭＴＢＥ溶于适量豆油中,灌胃染毒,染毒剂量分别为２００ｍｇ／ｋｇ,６００ｍｇ／ｋｇ,１０００ｍｇ／ｋｇ和对照组。每天１次,每周５天,共１３周。动物肝组织于液氮速冻后,一步法提取总ＲＮＡ。随机引物法地高辛标记ｃｍｙｃ和ＧＳＴＰ探针,与ＲＮＡ进行点杂交,图像分析仪分析结果。结果大鼠肝组织中ｃｍｙｃ基因表达水平明显增高,ＧＳＴＰ基因表达未见增强。结论ＭＴＢＥ可明显诱导ｃｍｙｃ基因的高表达,提示其具有促进细胞增殖的作用,这是其动物致癌性的可能机制之一。     

甲基叔下基醚对大鼠肝组织基因表达的影响

目的 甲基叔丁基醚（ＭＴＢＥ）是一种新型的汽油添加剂,动物试验显示其具有一定的致癌性。为了了解其动物致癌性的可能机制,我们检测了经ＭＴＢＥ亚慢性染毒的大直组织中原癌基因ｃ－ｍｙｃ基因和功能基因谷胱甘肽Ｓ－转移酶Ｐ（ＧＳＴ－Ｐ）基因的表达情况。方法 ４０例雄性ＳＤ大鼠,体重１８０－２００ｇ,随机分为４组。将ＭＴＢＥ溶于适量豆油中,灌胃染毒,染毒剂量分别为２００ｍｇ／ｋｇ,６００ｍｇ／ｋｇ,１０００ｍ     

CPB-ST融合基因的构建及表达研究

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ双酶切含有大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１前体蛋白基因的质粒ｐＸＳＴ１，回收３２５ｂｐ的ＳＴ基因片段，然后，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的带有产气荚膜梭菌β－毒素基因（ＣＰＢ）的重组质粒ｐＥＣＢ２中ＣＰＢ基因的下降，转化受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶切反应鉴定重组质粒，得到了理想重组质粒ｐＥＣＢ－ＳＴ１。重组菌株Ｂｌ２１（ＤＥ３）（ｐＥＣＢ－ＳＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ及ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以表达ＣＰＢ－ＳＴ融合蛋白，而且该融合蛋白无天然β－毒素和ＳＴ１的生物毒性。     

大肠杆菌肠毒素ST_1—LT_B融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１，回收０．８４ｋｂ的ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因，再将载体ｐＥＴ—２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后将其与ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因连接，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒，得到了理想重组质粒ｐＸＥＴ－ＳＬＴ１。重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以高效表达ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白，该融合蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％，而且无天然ＳＴ１生物毒性     

弓形虫P30基因在大肠杆菌中的表达研究

将编码弓形虫主要表面膜抗原（Ｐ３０）基因插入原核表达载体ｐＧＥＭＥＸ１的Ｔ７启动子下游,构建的重组质粒ｐＧＥＭＥＸ１／Ｐ３０转入宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）。用ＩＰＴＧ诱导Ｐ３０基因表达,ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验表明重组子能够表达３０ｋＤ蛋白,表达产物可以和兔抗弓形虫阳性血清特异性结合,具有较好的免疫原性。     

产气荚膜梭菌β-毒素基因的克隆及CPB-ST融合基因的构建

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从Ｂ型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了９３０ｂｐ的β－毒素基因。用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ对ＰＣＲ产物进行双酶切处理，然后，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的载体质粒ｐＥＴ－２８Ｃ（＋）的多克隆位点，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切分析和ＰＣＲ扩增检测。证明重组质粒ｐＥＣＢ２中含有产气荚膜梭菌的β－毒素基因。经核苷酸序列分析，明确了克隆的β－毒素基因在重组质粒中的连接向位和阅读框架是正确的。利用已构建的另一重组质粒ｐＸＳＴ１（带有肠毒素性大肠杆菌的耐热性肠毒素ＳＴ基因），通过ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶切处理，将切下的ＳＴ基因片段定向连接到ｐＥＣＢ２重组质粒中ＣＰＢ基因的下游。经特定酶切分析鉴定，得到了理想重组子质粒ｐＥＣＢＳＴ１，ＣＰＢ－ＳＴ融合基因在重组质粒ｐＥＣＴ－ＳＴ１中的连接向位是正确的     

苯并芘诱发人肺癌组织中p53和Ki—ras基因突变研究

为了研究ｐ５３和ｋｉ－ｒａｓ基因在苯并芘致肺癌过程中的作用，我们用免疫组织化学，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法对人肺癌细胞系（ＢＴ）ｐ５３基因和ｒａｓ基因进行了研究，结果发现ＢＴ癌细胞有ｐ５３蛋白和ｍＲＮＡ水平增高，ｃｏｄｏｎ２７３出现了Ｇ→Ｔ突变；ｐ２１癌蛋白高表达，Ｋｉ－ｒａｓ基因ｍＲＮＡ水平增高和ｃｏｄｏｎ１２出现Ｇ→Ｔ突变。结果提示二者协同参与苯芘致肺癌过程，从分子水平为苯并芘     

人乳头瘤病毒16型L1基因重组表达质粒的构建及在E.Coli宿主中的表达与鉴定

构建ｐＧＥＸ４Ｔ－１－ＨＰＶ１６Ｌ１重组表达系统。为进一步研制基因工程疫苗奠定基础,采用ＰＣＲ方法扩增ＨＰＶ１６中国分离株Ｌ１外源基因片段,ｐＧＥＸ４Ｔ－１为表达载体。构建ｐＥＧＸ４Ｔ－１－ＨＰＶ１６Ｌ１重组表达系统,在大肠杆菌宿主ＢＬ（２１）中,经ＩＰＴＧ诱导,表达融合蛋白ＧＳＴ－Ｌ１,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ进行鉴定结果表明,成功构建ｐＥＧＸ４Ｔ－１－ＨＰＶ１６Ｌ１重组     

苯并芘诱发人肺癌组织中p53和Ki－ras基因突变研究

为了研究ｐ５３和ｋｉ－ｒａｓ基因在苯并芘致肺癌过程中的作用，我们用免疫组织化学，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法对人肺癌细胞系（ＢＴ）ｐ５３基因和ｒａｓ基因进行了研究。结果发现ＢＴ癌细胞中有ｐ５３蛋白和ｍＲＮＡ水平增高，ｃｏｄｏｎ２７３出现了Ｇ→Ｔ突变；ｐ２１癌蛋白高表达，Ｋｉ－ｒａｓ基因ｍＲＮＡ水平增高和ｃｏｄｏｎ１２出现Ｇ→Ｔ突变。结果提示二者协同参与了苯并芘致肺癌过程。从分子水平为苯并芘的致肺癌变机制研究提供了证据，支持肺癌变过程中原癌基因和抗癌基因协同作用的假说     

A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的高效表达

将含Ａ型产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒ｐＫＭＡ１００用核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，经电泳分离、透析袋电洗脱法回收了０．９５ｋｂα毒素基因片段，再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后将处理好的ｐＥＴ－２８ｂ（＋）与０．９５ｋｂ的α毒素基因片段进行连接、转化。经ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切分析和序列分析，证明重组质粒ｐＸＥＴＡ１含有α毒素基因，且具有正确的阅读框架。构建的重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）能表达α毒素，但已经完全丧失其毒性。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层凝胶扫描分析，ＩＰＴＧ诱导后的ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）所表达的目的蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和免疫试验结果表明，表达产物能被α毒素抗血清识别，且免疫小鼠后，用强毒株培养上清攻击，结果免疫小鼠能抵抗至少４ＬＤ１００的攻击，这说明表达产物具有良好的免疫原性。     

苯并芘诱发人肺癌细胞系（BT）的染色体异常及myc，p53及Rb基因研究

本文对由致癌物苯并芘诱发的人肺癌建立的细胞系（ＢＴ）进行了染色体分析及ｍｙｃ，Ｒｂ和ｐ５３基因研究。发现许多异常染色体，以３号，５号，１１号，１３号，１７号染色体改变较多，对定位于这些染色体上的Ｈａ－ｒａｓ，ｒａｆ－１，ｐ５３，Ｒｂ和ｃ－ｍｙｃ的表达、扩增及重排情况进行了分析，发现ｃ－ｍｙｃ，ｐ５３，Ｒｂ三个基因发生了改变，说明染色体异常导致的基因改变与苯并芘诱发人肺癌的发生机制可能密切相关。     

Sulfur amino acid restriction induces the pi class of glutathione S-transferase expression in primary rat hepatocytes

The regulation of genes by amino acids is attracting increasing attention. In the present study, we investigated the restriction of expression of the pi class of glutathione S-transferase (GST Yp) by sulfur amino acids. Hepatocytes isolated from male Sprague-Dawley rats were cultured with L-15-based medium containing low (LSAA; 0.1 mmol/L L-methionine and 0.1 mmol/L L-cysteine) or high (HSAA; 0.5 mmol/L L-methionine and 0.2 mmol/L L-cysteine) amounts of sulfur amino acids for up to 6 d. Cellular protein contents did not differ between LSAA- and HSAA-treated cells over the entire period. In contrast, glutathione concentrations were suppressed by the LSAA medium and on d 6 were only 20% of those of HSAA-treated cells (P < 0.05). As shown by immunoblot analysis, GST Yp protein levels were greater in LSAA-treated cells than in HSAA-treated cells (P < 0.05). The induction of GST Yp by L-methionine and L-cysteine restriction was not affected by insulin and dexamethasone, but the latter suppressed GST Yp expression (P < 0.05). LSAA increased GST Yp mRNA levels and GST activity toward ethacrynic acid (P < 0.05). GST Yp induction occurred only in cells with a limited supply of L-methionine; restriction of L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, and L-phenylalanine had no significant effect. In contrast with the induction of GST Yp, the expression of the GST isoforms Ya and Yb was not changed by amino acid restriction. In conclusion, hepatic GST Yp gene expression is upregulated by a limited availability of sulfur amino acids.     

华支睾吸虫GST的新编码基因的克隆与纯化

目的 扩增华支睾吸虫(Cs)一个编码谷胱甘肽转移酶(GST)的新基因，确认是否存在内含子，进行原核表达，纯化。方法 用PCR方法从成虫cDNA文库和基因组中扩增CsGST基因，测序，定向克隆到原核表达载体pET-30a( )，在大肠杆菌BL21／DE3表达，按照Ni-NTA agarose说明书纯化重组蛋白，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和薄层色谱(TLC)分析。结果 CsGST基因全长639bp，没有内含子，构建的原核表达质粒pET-30a( )-CsGST在大肠杆菌中得到了有效表达，融合蛋白的分子量约为30kDa。重组蛋白达总蛋白的33％，纯化后的重组蛋白纯度为97％。结论 CsGST基因没有内含子，在大肠杆菌中能有效表达，重组蛋白得到了纯化，为进一步研究该基因的功能打下基础。     

茶色素防癌作用的实验研究

作者用一组体外短期检测试验,检验了茶色素在肿瘤的起动、促进、增殖阶段的作用并与茶多酚进行比较。选用基因正向突变和周期阻断法微核实验作为起动阶段指标,选用代谢协作和小鼠耳炎性水肿实验作为促癌阶段指标,选用Ｈｅｌａ 细胞存活率和软琼脂生长及小鼠Ｓ１８０实体瘤实验,检测对肿瘤细胞存活和增殖的影响。结果发现茶色素与茶多酚在肿瘤发生的起动、促进和增殖各阶段均显示出明显的保护作用;体外给予茶多酚、茶色素处理Ｈｅｐ Ｇ２肝肿瘤细胞,发现茶色素及其单体成分及茶多酚可诱导醌还原酶（ＱＲ）活性和谷胱甘肽硫转移酶（ＧＳＴ）活性;在用二乙基亚硝胺（ＤＥＮ）诱导的大鼠肝癌前病变,阳性对照组的ＧＳＴ水平有一定程度的降低;饮用０．１％ 茶多酚、茶色素可显著诱导大鼠肝ＧＳＴ活性,茶多酚的诱导率为２５％ ,茶色素的诱导率为１８％ ,而且ＧＳＴ１－１、１－２、３－３蛋白表达均有明显升高。结果表明茶色素与茶多酚同样具有抗肿瘤作用,茶色素对具有抗氧化作用和解毒作用的Ⅱ相代谢酶ＱＲ和ＧＳＴ 具有诱导作用,这可能是茶色素防癌作用的重要机制     

甲基叔丁基醚遗传毒性研究

甲基叔丁基醚（ＭＴＢＥ）是一种新型的汽油添加剂，被用来提高汽油辛烷值和减少汽车尾气中有害物质的排放。我们采用Ａｍｅｓ试验、程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验和细胞微核试验等反映不同遗传学终点的系列试验，检测了国产ＭＴＢＥ的遗传毒性。在Ａｍｅｓ试验（ＴＡ９８和ＴＡ１００菌株）中，在加和不加Ｓ－９的情况下，ＭＴＢＥ均未表现出致突变性。大鼠肝细胞ＵＤＳ试验显示，ＭＴＢＥ具有轻微的ＤＮＡ损伤作用。在ＮＩＨ３Ｔ３细胞微核试验中，ＭＴＢＥ呈现阴性结果。上述结果提示，ＭＴＢＥ在ＤＮＡ水平具有一定的遗传毒性     

茶多酚、茶色素对大鼠肝癌癌前病变抑制作用及机理研究

用腹腔注射二乙基亚硝胺及四氯化碳和部分肝切除建立的改良Solt Farber大鼠肝癌癌前病变模型以观察茶多酚和茶色素对其抑制作用 ,并对其可能机制进行探讨。结果表明 ,与阳性对照组相比 ,饮0 1%茶多酚和茶色素动物的谷胱甘肽硫转移酶P型 (GST P)阳性灶的面积和数目显著减少。Westernblot分析表明茶多酚和茶色素诱导了p2 1WAF1 表达 ,抑制了Bcl 2蛋白的表达 ,诱导了Bax蛋白的表达。本研究表明茶多酚和茶色素对大鼠肝癌癌前病变具有明显的抑制作用 ,而抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡可能是其重要机制。     

甲基叔丁基醚无铅汽油肾脏毒性的实验研究

目的：了解甲基叔丁基醚（MTBE）无铅汽油对肾脏的毒性及毒作用机制。方法：昆明种小鼠经呼吸道静式染毒，MTBE无铅汽油22．9、11．4及2．3g/m^3每天一次，连续2h，共22d亚急性染毒。日立－7150型全自动生化仪检测血清中尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）含量；肾组织均浆中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量分别用荧光法，邻苯三酚自氧化固定时间法测定；电镜观察肾皮质区超微结构的变化，结果：22.9g/m^3染毒组雌性小鼠血清中BUN含量与阴性对照组间比较差异有显著性（P＜0．05）；电镜观察到22.9g/m^3染色毒对照组雌雄性小鼠的肾小球基底膜，肾小管细胞线粒体及绒毛均未见显著异常改变。结论：MTBE无铅汽油对肾小球的滤过功能有一定的影响，雌性小鼠可能更为敏感。     

结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶-GST融合蛋白表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX4T-1构建表达载体pGEX4T-pncA,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH10b,再经IPTG诱导表达谷胱甘肽S转移酶(GST)-吡嗪酰胺酶融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果扩增出了结核分枝杆菌pncA基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-pncA,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。结论构建了质粒载体,并诱导表达了GST-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础。     

三种汽油增氧剂对小鼠成纤维细胞DNA损伤的研究

目的 比较3种汽油增氧剂对小鼠成纤维细胞DNA的损伤作用。方法 采用单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）对3种汽油增氧剂甲基叔丁基醚（MTBE）、无水乙醇（EA）和碳酸二甲酯（DMC）所致的L－929小鼠成纤维细胞的DNA损伤进行了研究。结果 在一定浓度范围内（37.500-150.000mg/ml)，MTBE可直接引起L－929小鼠成纤维细胞的DNA损伤，出现拖尾的彗星细胞。其拖尾细胞百分率和DNA迁移长度均随受试物浓度的增加而增加，且有明显的剂量－效应关系，即MTBE浓度从9.375mg/ml增加到150.000mg/ml时，彗星率从接受阴性对照组的4％增加到接近阳性对照组的85％,彗尾长度也发生了相应的改变。而EA和DMC无此关系。结论 在本试验条件下（浓度为150.00mg/ml)，MTBE对DNA具有明显的损伤作用；未发现EA和DMC对DNA的损伤作用。