柔红霉素对培养人视网膜色素上皮细胞BAK和BCL-XL表达的影响

目的 观察BAK和BCL-XL在正常培养和经柔红霉素处理后的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中的表达。方法 人RPE细胞培养液中加入终浓度为200μg·L~(-1)柔红霉素作用12h,更换新鲜培养液继续培养24h后,运用抗BAK和BCL-XL的多克隆抗体进行免疫细胞化学染色,观察2种基因在RPE细胞中表达的变化。结果 BAK和BCL-XL在正常RPE细胞中均存在表达,但前者的染色强度大于后者(P<0.05),2者光密度分别为56.4±5.7和32.4±4.7,经柔红霉素处理后,RPE细胞BAK的染色强度增加(P<0.05),而BCL-XL的染色强度不变(P>0.05),其光密度值分别为79.2±6.5和34.7±3.9。结论 BAK和BCL-XL在人RPE细胞中存在表达。柔红霉素可以促进BAK的表达,这可能是其诱导RPE细胞凋亡的机理之一。     

培养人视网膜色素上皮细胞增生的抑制与Ki-67表达

目的 探讨柔红霉素对视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞增生的抑制及其与Ki-67表达的关系。 方法 用180μg/L柔红霉素作用培养的人RPE细胞12h，之后24 h用氚-标记脱氧胸苷(tritium-labelled thymidine deoxyribose,³H-TdR)掺入法测定DNA合成抑制率，免疫细胞化学染色和定量分析观察Ki-67表达，流式细胞术检测细胞周期变化。 结果 培养人RPE细胞DNA合成抑制率与柔红霉素剂量成正比，对照组和柔红霉素组Ki-67阳性细胞率分别为89.3%和45.6%(P＜0.01)，两组中阳性细胞胞核积分光密度值分别为68.1±6.2和27.3±5.5 (P＜0.01)。柔红霉素组^G₂期细胞比例由8.9%增至29.5%。 结论 柔红霉素使培养人RPE细胞阻滞于^G₂期，抑制了细胞增生；Ki-67表达可以反映RPE细胞的增生抑制。（中华眼底病杂志，2000，16：1-70）     

转染Zn2+诱导表达反义bcl-2基因对人视网膜色素上皮细胞的影响

目的:观察转染Zn2 诱导表达的反义bcl-2 基因对人视网膜色素上皮(RPE)细胞的影响。方法:培养的正常RPE细胞与转染反义bcl-2 RPE细胞采用免疫组化,克隆形成试验、MTT,流式细胞仪,TUNEL分别予以观察。结果:转染后RPE细胞细胞骨架角蛋白表达阳性;硫酸锌诱导表达的安全剂量为160μmol/L;诱导表达反义bcl-2 RPE大部分细胞bcl-2 表达为阴性,部分弱阳性;在第10d细胞克隆形成率分别为(4.65±0.043)%与(4.85±0.085)%(P >0.05),诱导表达反义bcl-2 的RPE生长曲线在5d后表现为低增生率(P <0.01);柔红霉素作用后G2期细胞由9.9%增加至30.4%;180μg/L柔红霉素作用反义bcl-2转染组TUNEL阳性细胞可见典型凋亡小体。结论:转染可诱导表达的bcl-2 基因的RPE细胞可以进行细胞凋亡的后续研究。     

柔红霉素对培养人视网膜色素上皮细胞核仁组成区相关嗜银蛋白影响的定量 …

目的:了解视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞核仁组成区相关嗜银蛋白(ar-gyrophilic nucleolar organiser region-associated proteins,AgNORs)的表达量及柔红霉素对其影响。方法:将柔红霉素加入培养人RPE细胞的培养液中(终浓度为180μg/L)作用12小时,撤药后继续培养24小时。对培养细胞行AgNORs染色,图像分析染色结果。结果:对照组和柔红霉素组AgNORs面积(μm~2/核)分别为41.61±4.52和13.66±0.65(P<0.01);平均面密度(AgNORs面积与胞核面积之比)(%)为20.37±1.97和13.06±2.44(P<0.01)。结论:柔红霉素抑制体外培养人RPE细胞核仁组成区转录活性可能是其细胞毒作用的机理之一。眼科学报1999;15:70—73。     

缺氧对牛视网膜色素上皮细胞增生和凋亡基因bcl-2表达的影响

目的 观察缺氧对培养的牛视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞增生和凋亡基因bcl-2表达的影响。 方法 用四甲基偶氮唑蓝［3-(4,5-dimethylthiazole-2yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromid, MTT］比色法和免疫组织化学的方法，将培养的RPE细胞接种于24孔板，每孔细胞密度为5×10 4，分成4组：A组置入缺氧环境中培养(3%O 2 ，5%CO 2，92%N 2，37℃)；B组置入正常环境中培养(5%CO2，95%空气，37℃)；C组：将缺氧环境培养24 h的细胞上清液加到正常环境培养的牛 RPE细胞中培养；D组：将正常环境培养24 h的细胞上清液加到正常环境培养的牛 RPE细胞中培养。24 h后分别取出行MTT比色法及抗bcl-2蛋白抗体染色。 结果 A组与B组、C组与D组比较，前者细胞MTT实验吸光度(A)值［旧称光密度(OD)］均高于后者(P＜0.05); 抗bcl-2蛋白抗体染色，A、B组阳性率分别为72.60%、38.64%； C、D组阳性率分别为83.20%、21.80%。阳性染色在细胞浆，近核膜处染色尤深，部分呈细颗粒状。 结论 缺氧促进牛RPE细胞增生及凋亡基因 bcl-2表达。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 293-295)     

Bax过表达对培养人视网膜色素上皮细胞bak和bcl-xl表达的影响

目的观察bak和bclxl在正常培养和经bax转染后的人视网膜色素上皮(RPE)细胞中的表达。方法采用脂质体对正常培养人RPE细胞进行bax基因的转染,筛选阳性转染的细胞。实验分为正常细胞组,空载体组和基因转染组。运用抗bak和bclxl的多克隆抗体进行免疫细胞化学染色,观察两种基因在RPE细胞中的表达的变化。结果bak和bclxl各组细胞中都存在阳性表达。bak在三组细胞中的染色光密度分别为56.4±5.7,52.3±5.1和75.4±7.5,其中转基因组的染色强度高于正常和空载体组(P<0.05)。bclxl在三组细胞中的染色光密度分别为32.4±4.7,29.5±4.2和28.7±4.3,染色强度在三组之间没有明显差别(P>0.05)。结论bak和bclxl在正常人RPE细胞中存在表达。bax转染可以促进细胞bak的表达,这可能是其诱导RPE细胞凋亡的机制之一。     

蓝光致人视网膜色素上皮细胞凋亡与线粒体膜电位和细胞色素C的关系

目的探讨蓝光光照对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡及对线粒体膜通透性转运功能的影响。方法用蓝光光照体外培养的人RPE细胞。实验分为三部分。第一部分:不同光照度,分为3组,第1组光照度(500±100)lx,第2组光照度(2000±500)lx,第3组光照度(3000±500)lx;光照RPE细胞时间6h,光照结束后24h终止培养。第二部分:同一光照度、不同光照时间,检测RPE细胞亚型时分为3组,第1组光照时间6h,第2组光照时间12h,第3组光照时间24h,光照度均为(2000±500)lx;检测线粒体膜电位时也分为3组,第1组光照时间3h,第2组光照时间6h,第3组光照时间12h,光照度均为(2000±500)lx。第三部分:同一光照度和光照时间,光照度(2000±500)lx,光照RPE细胞时间6h;不同细胞培养终止时间分为4组,第1组终止细胞培养时间为光照后6h,第2组为光照后12h,第3组为光照后24h,第4组为光照后36h。利用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)染色、荧光素标记的AnnexinV-FITC和PI双染流式细胞检测、透射电镜等手段观察RPE细胞凋亡情况。罗丹明123荧光染料孵育人RPE细胞,流式细胞仪检测线粒体膜电位,酶联免疫法测定细胞色素C活性,比色测定法测定Caspase-3的活性。结果第二部分第1组TUNEL染色阳性细胞的体积缩小变圆,胞核浓缩,边聚成新月形或帽状,细胞核碎裂成数个,细胞膜出胞。透射电镜观察发现细胞内线粒体肿胀,线粒体内膜嵴消失,粗面内质网扩张,溶酶体增加。第一部分(500±100)lx光照未引起明显的RPE细胞损伤,但线粒体膜电位明显下降;随着光照度增加,RPE细胞出现凋亡、凋亡继发性坏死及坏死,同时线粒体膜电位逐渐下降。第二部分光照6和12h,凋亡细胞百分比增加,荧光强度明显下降;光照24h凋亡继发性坏死细胞、坏死细胞百分比增加。第三部分光照后6和12h,RPE细胞凋亡百分比逐渐增加;光照后24、36h凋亡继发性坏死细胞和坏死细胞百分比明显增加,光照后各时间点RPE细胞荧光强度明显下降。以光照度(2000±500)lx照射6和12h,可见光照后24和36h两组的细胞色素C浓度明显升高,未检测到Caspase-3活性变化。结论蓝光照射可导致体外培养的人RPE细胞凋亡、凋亡继发性坏死及坏死,其损伤程度与光照度和时间相关;蓝光照射导致培养的人RPE细胞损伤过程与线粒体膜电位降低、细胞色素C释放有关;线粒体膜电位可作为检测蓝光致人RPE细胞凋亡的早期指标。     

吲哚美辛诱导体外培养的视网膜色素上皮细胞凋亡

目的　探讨用吲哚美辛 ( indomethacin,IN)诱导体外培养的人胚胎视网膜色素上皮 ( retinal pigm entepithelium ,RPE)细胞的凋亡。方法　加入终浓度分别为 10 0、 2 0 0、40 0、 6 0 0μmol· L- 1 的 IN,作用 2 4h;6 0 0μm ol· L- 1 IN作用 6、 12、 2 4h后用透射电镜定性观察凋亡细胞 ,并用吖啶橙荧光染色进行定量和定性分析。结果　经 2 0 0、40 0、6 0 0 μm ol·L- 1 IN作用 2 4h后 RPE细胞凋亡指数分别为 ( 2 7.0 0 0 0± 1.3375 ) % ,( 5 1.0 0 0 0±1.370 3) % ,( 6 8.0 0 0 0± 1.6 86 5 ) %与对照组 ( 2 .0 0 0 0± 0 .42 16 ) %相比 ,差异有显著性( t=4.6 2 4,9.0 6 2 ,12 .2 0 6 ,P=0 .0 0 0 ,0 .0 0 0 ,0 .0 0 0 ) ,随着 IN浓度的增加 ,RPE细胞凋亡数逐渐增多 ;6 0 0μm ol· L- 1 IN作用 12、2 4h后 RPE细胞凋亡指数分别为 ( 44 .0 0 0 0±0 .843 3) % ,( 6 4.0 0 0 0± 1.2 6 49) %与对照组 ( 2 .0 0 0 0± 0 .42 16 ) %相比 ,差异有显著性( t=8.6 17,13.2 74,P=0 .0 0 0 ,0 .0 0 0 )。结论　 IN能诱导体外培养的人胚胎 RPE细胞的凋亡 ,并且 RPE细胞的凋亡呈现出随浓度增加和时间延长凋亡细胞数明显增多。     

雌激素对慢性高眼压兔视网膜损伤的保护作用

目的 探讨雌激素对慢性高眼压兔视网膜损伤的保护作用.方法 18只成年健康新西兰雌性大白兔随机分为去势组和假去势组.去势组切除两侧卵巢,假去势组仅切除卵巢周围部分脂肪组织.利用前房注射复方卡波姆建立兔慢性高眼压模型.采用末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TUNEL)检测视网膜组织中凋亡细胞的表达;免疫组织化学方法检测B细胞淋巴瘤/白血病(bcl)-2、bax蛋白的表达情况;应用计算机图像分析系统对检测结果进行分析.结果 造模后4、6、8周,去势组较假去势组视网膜神经节细胞数目明显减少,视神经纤维层和内核层变薄;TUNEL阳性细胞表达均较假去势组高(t=3.285,4.012,3.624;P值均<0.01);视网膜bcl-2表达均较假去势组低(t=4.256,3.867,3.459;P值均<0.01);bax阳性细胞表达情况均较假去势组高(t=3.211,3.625,3.253;P值均<0.01).bcl-2的表达与TUNEL的表达呈负相关,凋亡细胞随着bcl-2的表达增多而减少,bcl-2抑制了凋亡的发生.bax的表达与TUNEL的表达呈正相关,凋亡细胞随着bax的表达增多而增多,bax诱导了凋亡的发生.结论 雌激素对慢性高眼压兔视网膜损伤有神经保护作用,这一保护作用主要是通过减少视网膜组织中的凋亡细胞而实现的.     

雌激素对慢性高眼压兔视网膜损伤的保护作用

目的 探讨雌激素对慢性高眼压兔视网膜损伤的保护作用.方法 18只成年健康新西兰雌性大白兔随机分为去势组和假去势组.去势组切除两侧卵巢,假去势组仅切除卵巢周围部分脂肪组织.利用前房注射复方卡波姆建立兔慢性高眼压模型.采用末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TUNEL)检测视网膜组织中凋亡细胞的表达;免疫组织化学方法检测B细胞淋巴瘤/白血病(bcl)-2、bax蛋白的表达情况;应用计算机图像分析系统对检测结果进行分析.结果 造模后4、6、8周,去势组较假去势组视网膜神经节细胞数目明显减少,视神经纤维层和内核层变薄;TUNEL阳性细胞表达均较假去势组高(t=3.285,4.012,3.624;P值均<0.01);视网膜bcl-2表达均较假去势组低(t=4.256,3.867,3.459;P值均<0.01);bax阳性细胞表达情况均较假去势组高(t=3.211,3.625,3.253;P值均<0.01).bcl-2的表达与TUNEL的表达呈负相关,凋亡细胞随着bcl-2的表达增多而减少,bcl-2抑制了凋亡的发生.bax的表达与TUNEL的表达呈正相关,凋亡细胞随着bax的表达增多而增多,bax诱导了凋亡的发生.结论 雌激素对慢性高眼压兔视网膜损伤有神经保护作用,这一保护作用主要是通过减少视网膜组织中的凋亡细胞而实现的.     

Role of apoptosis in the cytotoxic effect mediated by daunorubicin in cultured human retinal pigment epithelial cells.

To investigate whether apoptosis is involved in the therapeutic effect of daunorubicin on proliferative vitreoretinopathy (PVR), cultured human retinal pigment epithelial cells (RPE) were exposed to a cytotoxic dose of 180 microg/l daunorubicin. After 12-hour treatment with the drug and 24-hour prolonged post-incubation in the drug-free medium, progressive condensation, shrinkage of cytoplasm and nucleus, and fragmented nuclei were identified by light and electron microscopy. TUNEL assay showed the characteristic apoptotic patterns of circumscribed clumps and sometimes even dark masses in nuclei. The expression of bax protein was enhanced, and the integral optical density values for immunocytochemical expression of bax protein increased by 22.0% in the drug-treated group (P < 0.05). The results demonstrated the pivotal role of apoptotic mechanism in the cytotoxic effect mediated by daunorubicin, and confirmed the relationship between the drug-induced apoptosis and overexpression of bax protein. It suggested that the upregulation of bax mediated by daunorubicin could lead to the onset of apoptosis, and therefore contribute to its therapeutic mechanisms for the treatment of PVR.     

增殖细胞核抗原与bcl-2在培养的人视网膜色素上皮细胞的表达

目的观察培养的人视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial cells，RPE）的增殖细胞核抗原（proliferative cell nuclear　antigen，PCNA）和 bc1-2的表达。方法用SABC法对培养的人RPE作鼠抗人PCNA单抗及兔抗人bcl-2抗体免疫组织化学染色。结果RPE在接种后24小时和48小时，PCNA的阳性率分别为31.2%和50.6%，阳性染色位于细胞核内，斑块状。bcl-2的表达为76%～90%，阳性染色在细胞浆，细颗粒状。结论培养中一半RPE有PCNA抗原表达，提示这些细胞处于S期；bcl-2抗原在大多数RPE表达阳性。这些生物标记物可能与培养的RPE生长活性有关。(中华眼底病杂志,1998,14:26-28)     

组织因子靶向肽对蓝光诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

背景 视网膜光损伤可造成视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤,是影响年龄相关性黄斑变性(AMD)发生和发展的重要因素之一.研究表明,组织因子(TF)在氧化损伤的RPE细胞中和AMD患者的脉络膜新生血管(CNV)中呈高表达,推测抑制TF可预防RPE细胞的损伤以及抑制CNV. 目的 观察TF靶向肽(TF-TP)对蓝光诱导的人RPE细胞损伤的保护作用. 方法 体外分离和培养人RPE细胞并分为空白对照组、蓝光照射组和TF-TP组.空白对照组细胞在常规条件下进行处理;蓝光照射组细胞用辐照强度为(4.0±0.5)mW/cm2的蓝光照射12h建立蓝光损伤细胞模型;TF-TP组先分别用不同浓度(10、100、150、200、300 μmol/L)TF-TP培养细胞24 h,再用蓝光照射12h.采用CCK-8法检测各组细胞的存活率;分别在普通倒置显微镜和透射电子显微镜下观察RPE细胞的形态和超微结构变化;采用Hoechst染色法检测各组细胞的凋亡情况;采用Western blot法检测各组细胞中TF蛋白和相关凋亡蛋白bax和bcl-2的表达.结果 不同浓度TF-TP组间RPE细胞存活率比较,差异无统计学意义(F=2.15,P=0.11).空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞存活率分别为(100.0±0.00)％、(43.79±6.55)％和(63.45±3.57)％,150 μmol/LTF-TP组细胞存活率较蓝光照射组明显增加,差异有统计学意义(P=0.00),以150.μmol/L TF-TP为后续实验的最适浓度.光学显微镜下和透射电子显微镜下显示,蓝光照射组有较多皱缩、变形、悬浮细胞,可见细胞微绒毛数量减少,部分线粒体嵴断裂和缺失以及细胞空泡样变性,而150 μmol/L TF-TP组异常形态的细胞较少,细胞绒毛结构较完整,细胞质中空泡样结构改变和线粒体损伤改变明显减轻.空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率分别为(0.98±0.19)％、(9.98±0.82)％和(5.73±0.88)％,组间总体比较差异有统计学差异(F=206.18,P=0.00),其中150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率明显低于蓝光照射组,差异有统计学意义(P＜0.05).与空白对照组相比,蓝光照射组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量明显增加,bcl-2蛋白的相对表达量显著下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与蓝光照射组相比,150 μmol/L TF-TP组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量均明显下降,而bcl-2蛋白的相对表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 TF-TP预处理后可减少蓝光损伤的人RPE细胞的凋亡及增加细胞的存活率,从而对蓝光诱导的人RPE细胞损伤发挥保护作用,其作用机制可能与TF-TP抑制TF介导的bax/bcl-2凋亡通路有关.     

Density-dependent resistance to apoptosis in retinal cells.

PURPOSE: To study effects of cell density on retinal cell survival. METHODS: Apoptotic cell death was induced in cultured retinal cells seeded at higher or lower density by various stimuli including simulated ischemia, excitotoxicity and antibody against heat shock protein 27 (hsp27). Quantitative analysis of apoptotic cells was performed using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling technique and flow cytometry. Cytoskeleton was examined using immunocytochemistry and specific staining of actin by phalloidin and DNase I. In addition, alterations in the cytoskeletal proteins, bcl-2 family of proteins and hsp27 were studied using western blotting. RESULTS: Incubation of the cells under apoptotic stimuli caused higher rates of apoptosis in lower density cultures as determined by TUNEL technique and flow cytometric analysis. Both morphologic examination of cytoskeleton and western blotting revealed that after incubation with various stressors, degradation of actin and tubulin was more prominent in lower density cultures compared to higher density cultures. The expression of bcl-2 and bcl-xL was higher and the expression of bax was lower in lower density cultures compared to higher density cultures at basal condition. After incubation with stressors, bcl-2 and bcl-xL expressions decreased and bax expression increased in both lower and higher density cultures. However, we observed that the expression of hsp27 was higher in higher density cultures than in lower density cultures in the presence or absence of apoptotic stimuli. CONCLUSIONS: These findings demonstrate that retinal cells are more resistant to apoptosis in higher density cultures, independent of the inducer. This might be partly due to protective activity of endogenous hsp27 in the cells at higher density, which contributes to cytoskeletal integrity in response to apoptotic stimuli.     

雌激素对慢性高眼压兔视网膜损伤的保护作用

目的 探讨雌激素对慢性高眼压兔视网膜损伤的保护作用.方法 18只成年健康新西兰雌性大白兔随机分为去势组和假去势组.去势组切除两侧卵巢,假去势组仅切除卵巢周围部分脂肪组织.利用前房注射复方卡波姆建立兔慢性高眼压模型.采用末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TUNEL)检测视网膜组织中凋亡细胞的表达;免疫组织化学方法检测B细胞淋巴瘤/白血病(bcl)-2、bax蛋白的表达情况;应用计算机图像分析系统对检测结果进行分析.结果 造模后4、6、8周,去势组较假去势组视网膜神经节细胞数目明显减少,视神经纤维层和内核层变薄;TUNEL阳性细胞表达均较假去势组高(t=3.285,4.012,3.624;P值均<0.01);视网膜bcl-2表达均较假去势组低(t=4.256,3.867,3.459;P值均<0.01);bax阳性细胞表达情况均较假去势组高(t=3.211,3.625,3.253;P值均<0.01).bcl-2的表达与TUNEL的表达呈负相关,凋亡细胞随着bcl-2的表达增多而减少,bcl-2抑制了凋亡的发生.bax的表达与TUNEL的表达呈正相关,凋亡细胞随着bax的表达增多而增多,bax诱导了凋亡的发生.结论 雌激素对慢性高眼压兔视网膜损伤有神经保护作用,这一保护作用主要是通过减少视网膜组织中的凋亡细胞而实现的.