汉坦病毒H8205株IL-2/G1融合基因在Vero细胞中的稳定表达

目的 探讨外源性IL-2／G1融合基因在非洲绿猴肾细胞(Vero)获得稳定表达的可行性,为汉坦病毒基因工程疫苗的研制提供一定的实验基础。方法将汉坦病毒H8205株G1的cDNA重组人源IL-2基因后克隆到真核表达载体pcDNA3．1／His,形成重组真核表达质粒pcDNA3．1／His-IL-2-G1,在脂质体介导下,将其导入Vero细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,并继续培养6周,然后通过间接免疫荧光、ELSIA、SDS-PAGE电泳等方法检测IL-2-G1基因在Vero细胞中的稳定表达情况。结果成功构建重组质粒pcDNA3．1／His-IL-2-G1,其片段插入方向正确。经间接免疫荧光和SDS-PAGE电泳证实,转染了真核表达质粒pcDNA31／His-IL-2-G1后在Vero细胞培养上清和胞浆中有融合蛋白的表达,其相对分子量为78000u,与预期的相符合。经人IL-2 ELISA检测试剂盒检测证实在培养上清和细胞裂解物所表达的融合蛋白有IL-2特性。结论在脂质体介导下,外源性IL-2／G1融合基因能够成功导入Vero细胞并获得稳定表达。     

汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因的克隆与表达

目的 构建融合基因pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1，为进一步研究汉坦病毒新型裸DNA疫苗奠定基础。方法 采用PCR从含有人源IL-2的质粒中扩增出IL-2片段，将人源IL-2插入真核表达载体pcDNA3．1／His—B中，构建的质粒命名为pcDNA3．1／His-昏IL-2。同样采用PCR扩增汉坦病毒H8205株G1基因片段，将回收的G1片段经双酶切插入到pcDNA3．1／His-B-IL-2，构建成新的质粒pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1。采用脂质体介导包裹，转入NIH3T3细胞中进行瞬时表达；采用原位杂交观察细胞内的基因表达，SDS-PAGE法作重组质粒pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1瞬时表达产物的鉴定。结果 融合基因可转录并表达-分子量为78kD左右的蛋白，对照组则未见电泳条带出现。结论 成功构建pcDNA3．1／His-B-IL-2-G1融合基因，融合基因能在真核细胞中瞬时表达。     

结核分枝杆菌热休克蛋白65与汉坦病毒G2糖蛋白融合基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65（HSP65）和汉坦病毒G2糖蛋白重组融合基因为基础的真核表达载体。为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定基础。方法 采用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv株基因中．扩增出HSP65的编码基因，从T-H8205G2质粒扩增出G2糖蛋白的编码基因．经相应限制性核酸内切酶消化后．插入真核表达载体pcDNA3．1／His，并将此重组质粒通过脂质体介导转染NIH3T3细胞．用SDS-PAGE、免疫组织化学及免疫荧光方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果 获得正向插入的pcDNA3.1/ His-HSP65-G2重组表达质粒，表达产物的相对分子量为105kD．与理论预期大小一致．并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体和HSP65单抗起特异反应。表明构建的pcDNA3．1／His-HSP65-G2能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性。结论 编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功。     

中国汉坦病毒H82O5株G2糖蛋白基因的克隆及在真核细胞中的瞬时表达

从感染病毒乳鼠脑组织提取总RNA，采用RT－PCR和分子克隆技术将扩增到的G2糖蛋白基因插入含CMV启动子的pcDNA3.1/His质粒载体中，通过脂质体介导转染COS－7细胞，用SDS－PAGE、Western-blot及IFIA方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果证明获得正向插入的G2－pcDNA3.1/His重组表达质粒，表达产物的相对分子量为56ku，与理论预期大小一致，并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体起特异反应。表明构建的G2－pcDNA3.1/His重组质粒所表达的蛋白为中国汉坦病毒株特有，能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性，重组质粒可应用于汉坦病毒的DNA疫苗研究。     

结核杆菌HSP65与汉坦病毒H8205株G2基因的构建

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65和汉坦病毒G2重组融合基因为基础的核酸疫苗。方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，从T—H8205G2质粒扩增出G2蛋白的编码基因，经相应限制性核酸内切酶消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1／His，并将此重组质粒通过酶切、SDS—PAGE分别测定表达产物的相对分子量。结果 获得正向插入的pcDNA3．1／His—HSP65-G2重组表达质粒，与理论预期大小一致。结论 以编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定了基础。     

重组汉坦病毒包膜糖蛋白G1、G2基因体内外表达的评价

目的　构建分别编码汉坦病毒浙 37(Z37)株包膜糖蛋白G1、G2的真核表达质粒 ,并在离体及活体内评价重组汉坦病毒 (HV)包膜糖蛋白G1、G2基因的表达。方法　将编码G1、G2的基因片段分别插入至真核表达载体 pcDNA3.1( ) ,获重组质粒pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2。在体外转录翻译系统和真核细胞中表达重组基因 ,并在BALB/C小鼠中评价包膜糖蛋白G1、G2所激发的特异性体液免疫应答效果。结果　重组质粒pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2转染COS 7细胞后 ,IFA法可检测到细胞内有特异性荧光分布 ;在体外蛋白质转录、翻译系统 ,重组质粒 pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2所表达的蛋白质分子量分别约为 70KD及 5 5KD ;在免疫的部分小鼠体内可检测到特异性抗体。结论　成功地构建了分别编码HVZ37株包膜糖蛋白G1、G2的重组质粒 ,并能在体内外表达     

汉坦病毒H8205株M-IL-2融合基因的构建

目的研究汉坦病毒新型裸DNA疫苗,构建融合基因pcDNA3.1/HisBIL2M(G1 G2)。方法采用PCR扩增汉坦病毒H8205株G1和G2基因片段,将回收的G1和G2片段经双酶切插入到pcDNA3.1/HisBIL2,构建成新的质粒pcDNA3.1/HisBIL2M。结果融合基因转录一分子量为100kD左右的蛋白,对照组则未见电泳条带出现,回收的片段与预期的相符。结论成功构建pcDNA3.1/HisBIL2M融合基因。     

汉坦病毒包膜糖蛋白基因核酸免疫的初步研究

目的将克隆有汉坦病毒包膜糖蛋白基因M片段及G1、G2基因的重组质粒免疫动物，了解上述目的基因在核酸疫苗中的应用价值。方法大量制备已构建好的pcDNA3．1-M、pcDNA3．1-G1、pcDNA3．1-G2重组质粒DNA及对照空质粒pcDNA3．1。然后用这四组质粒DNA通过肌肉注射的方法免疫6～8周龄的BALB／c小鼠（每组5只），每4周免疫一次，共免疫3次，每次免疫前及最后一次免疫后2周断尾取血，用免疫荧光的方法检测基因免疫的体液免疫应答效果。结果重组质粒pcDNA3．1-G1免疫小鼠有4只血清抗汉坦病毒抗体为阳性，重组质粒pcDNA3．1-G2以及重组质粒pcDNA3．1-M免疫小鼠各有1只血清抗汉坦病毒抗体为阳性。结论汉坦病毒糖蛋白基因核酸免疫动物后可刺激机体产生特异性的体液免疫应答。     

汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因疫苗的免疫效应

目的探讨汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因疫苗（pcDNA3．1／HisB-IL-2-G1）的免疫效应。方法将pcDNA3.1／HisB-IL-2-G1融合基因疫苗通过肌肉注射途径免疫BALB／c小鼠，每隔3周免疫1次，共免疫3次；酶联免疫法（ELISA）检测抗汉坦病毒（HTNV）抗体；空斑减少中和试验检测免疫血清中和抗体效价；淋巴细胞增殖试验（MTT法）检测免疫小鼠的细胞免疫反应；动物保护试验以BALB／c小鼠为感染动物模型，在第3次免疫后2周，腹腔内注射100TCID50（半数感染量）HTNV，然后以免疫荧光法观察鼠肾切片，评价其保护力。结果pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗免疫后可刺激机体产生特异性抗体和中和抗体，中和效价为1：20～1：80。MTT法结果表明，免疫小鼠的脾淋巴细胞有特异性增殖反应。动物试验表明pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗能保护小鼠免受HTNV感染。结论pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗可诱导特异性体液免疫应答和较强的细胞免疫应答。     

人促甲状腺激素受体全长表达载体在真核细胞内的稳定表达

目的构建pcDNA3.1/人TSH受体（human thyroid-stimulating hormone receptor,hTSHR）基因真核表达载体（已完成）,将该真核表达载体在CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中表达,并筛选获得稳定表达细胞株。方法通过脂质体介导,用重组质粒pcDNA3.1-hTSHR转染CHO细胞,以G 418筛选稳定表达细胞株,挑取单克隆,扩大培养并传代;取P5代细胞,抽提基因组DNA及蛋白分别用PCR及Western blot方法鉴定被转染CHO细胞hTSHR的表达情况。结果得到阳性单克隆5个,传代培养。P5代细胞PCR扩增产物为约530 bp特异性条带,大小与预期相符,未见非特异性条带。Western印记法结果表明被转染CHO传代细胞有hTSHR蛋白表达。结论pcDNA3.1-hTSHR真核表达载体可以在CHO细胞中稳定表达,成功构建稳定表达细胞株。为测定自身免疫性甲状腺疾病患者血清TSHR奠定了基础。     

Dab2/DOC-2基因的研究进展

Dab2/DOC-2是具有信号转导功能的磷蛋白,在丝裂原信号转导途径中起作用,通过蛋白质的相互作用和蛋白磷酸化发挥作用,参与控制细胞生长的信号通路而发挥生长抑制效应,Dab2/DOC-2又作为胞质衔接蛋白,参与细胞内蛋白运输。在肿瘤中纯合子基因缺失时被激活,是抑癌基因的候选成员。其在多种肿瘤中低或失表达,如卵巢癌,乳腺癌,绒毛膜癌和前列腺癌等,重新表达能抑制肿瘤的生长。Dab2也在胚胎的发生过程中发挥重要的作用。     

霍乱弧菌抑制子基因及间隔区(rstR-ig2)多态性研究

目的研究霍乱弧菌CTXφ基因组抑制子基因及间隔区（rstR-ig2）多态性。方法聚合酶链反应（PCR）及限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）、型特异性引物PCR分型。结果霍乱弧菌（VC）01群古典型（CVC）5株均为class类型。VC01群埃尔托型（EVC）155株共分为4个类型：class、ET、class＋ET、class ＋newET,后2个类型为首次发现。不同地区分离的EVC均以ET类型为主,以class和class＋ET类型为辅。O139群VC82株共分为4个类型：ET、ET＋new O139、ET＋calc、ET＋calc＋newO139,后3个类型为首次发现;福建省分离的菌株以ET4-newO139类型为主,其它地区分离的均以ET类型为主。结论EVC和O139群VC的rstR-ig2基因均以ET类型为主．首次发现5种不同类型rstR-ig2基因共存的新类型。     

小鼠肾素－Ⅱ全长基因的物理图谱

小鼠肾素－Ⅰ（Ｒｅｎ－１）和肾素－Ⅱ（Ｒｅｎ－２）的ｃＤＮＡ有９６％的同源性。以ＸｈｏⅠ从重组质粒ｐＫＧ－Ｒ２Ｄ上切取包含Ｒｅｎ－２全长基因及周围序列的２４ｋｂ片段。该片段分别经单、双酶切后，用Ｒｅｎ－１ｃＤＮＡ半长（７３５ｂｐ）及全长序列（１４００ｂｐ）为探针进行分子杂交，据片段大小及杂交带的位置关系构建出此２４ｋｂ片段的物理图谱。     

CDX2基因研究进展

基因系尾型同源盒基因(CDX2)尾型同源框转录因子2,是一种新发现的特异性的核转录因子,属于果蝇尾部相关同源框基因家族成员,不仅控制着胚胎细胞的发育和分化,而且在成人组织的分化和增殖调控中起着重要作用。新的研究发现,消化道、泌尿生殖、妇科、头颈部等部位均有CDX2表达。本文就CDX2基因的研究现状予以综述。     

TAFA2基因剔除小鼠模型的建立

目的 建立TAFA2基因剔除小鼠模型,为在体研究TAFA2基因的生物学功能及其与中枢神经系统发生、发育的关系创造条件. 方法 运用生物信息学手段确定小鼠TAFA2基因组的序列,设计基因剔除策略,构建基因剔除载体pBR322-MK-MCS-TAFA2,以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆,PCR鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆. 结果 同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚后获得嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti（野生型）毛色的小鼠41只,其中14只为TAFA2基因剔除杂合子小鼠,阳性率为34.1%.在雌、雄杂合子小鼠交配的后代中获得纯合子小鼠,初步的表型观察未发现TAFA2基因剔除小鼠出现异常改变. 结论 已成功建立了TAFA2基因剔除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象.     

汉坦病毒H8205株G2-人源IL-2融合基因免疫效果的研究

目的对比研究两种融合基因pcDNA3．1／HisB-IL2-G2与pcDNA3．1／HisB-G2的免疫效果。方法大量制备重组质粒后免疫Balb／c小鼠，剂量为100μg／次。于0、4和8周，共免疫3次。免疫前和免疫后第2、6、10周采血，用间接免疫荧光法(IFA)与ELISA检测抗汉坦病毒(HTNV)抗体；用空斑减少中和试验(PRNT)检测免疫血清的中和效价；用淋巴细胞增殖试验检测免疫小鼠的细胞免疫反应；用免疫脾细胞转移保护实验检测疫苗的保护效应。结果两种融合基因均可刺激机体产生特异性的抗汉坦病毒76—118株的交叉抗体和中和抗体，且差异无显著性意义，而pcDNA3．1／HisB-IL2-G2诱导特异的细胞免疫明显高于pcDNA3．1／HisB-G2。结论pcDNA3．1／HisB-IL2-G2融合基因的免疫效果优于pcDNA3．1／HisB-G2，该研究结果为进一步研制有效的肾综合征出血热(HFRS)基因疫苗提供了重要实验依据。     

长片段基因FMNL2 PCR实验的体会

目的尝试扩增长片段FMNL2基因。方法采用巢式PCR或和降落PCR相结合的方法进行了FMNL2基因编码区全长及FMNL2-NT、-CT的扩增。结果高效、特异地扩增出FMNL2基因编码区全长及FMNL2-NT、-CT片段。结论巢式PCR或和降落PCR相结合,提高了目的基因的扩增效率和扩增产物的特异性。     

HER-2癌基因信号转导与肿瘤发生之间的关系

HER-2与许多恶性肿瘤的发生、发展密切相关。HER-2可通过信号转导途径间接调控许多肿瘤相关基因的表达,亦可作为转录因子直接调控某些基因的表达,而一些基因表达产物又进而增强HER-2或其他基因的表达,这就构成了以HER-2为中心的基因表达调控网络,这些基因表达产物和HER-2可能共同成为肿瘤诊断和预后的标志物。阐明这个网络中各个分子间的相互作用关系,将为HER-2过表达肿瘤的治疗提供新的药物设计靶标。     

磺酰脲受体1基因与2型糖尿病

在胰腺 β细胞膜上表达的磺酰脲受体 1(SUR1)是胰岛 β细胞ATP敏感钾通道 (KATP)的功能亚单位。SUR1作为调节亚基和ATP/ADP感受器与内向性整流K+通道Kir6 .2共同组成胰腺KATP通道 ,编码二者的基因被定位于人染色体11p15 .1上 ,两者相隔 4 .5kb。KATP是通过将糖代谢释放的信号与细胞膜的去极化和胰岛素的出胞作用相互连接而在葡萄糖诱导的胰岛素分泌中起关键作用。由于糖代谢产生ATP或由磺脲类药物的作用导致KATP的关闭提高了细胞内的K+的浓度并导致了 β细胞膜的去极化 ,导致电压依从性Ca2 +通道的打开 ,Ca2 +的内流及胞内C…