信号肽与猪链球菌GDH融合的DNA疫苗构建及体液免疫研究

目的 设计、构建猪链球菌GDH真核表达载体并研究DNA疫苗免疫小鼠的体液免疫.方法 在猪链球菌保护性抗原GDH基因5'末端引入人IL-2信号肽序列,通过PCR进行拼接,得到的融合DNA片段经过酶切克隆入质粒pcDNA3.0,构建核酸疫苗重组质粒pcDNA3.0-gdh.通过肌肉注射途径将重组质粒pcDNA3.0-gdh免疫小鼠,经ELASA实验和Western blot进行检验.结果 构建的表达载体在小鼠体内表达出正确的目的 蛋白,能诱导体液免疫.结论 构建的DNA疫苗能够引起体液免疫,为研究猪链球菌核酸疫苗提供分子工具.     

弓形虫多表位DNA疫苗的构建及其免疫保护作用

目的:构建弓形虫多表位DNA疫苗并研究其免疫保护效果.方法:将编码含弓形虫多个T、B细胞表位的6段弓形虫多肽基因,以5个甘氨酸编码基因相间隔相连接,克隆入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建成多表位弓形虫DNA疫苗.免疫BALB/c小鼠,测定其诱导的特异性抗体水平及T淋巴细胞增殖状况,同时进行弓形虫攻击感染保护实验.结果:成功构建了包含多个弓形虫表位的真核表达质粒pcDNA3.1/T-ME,以其作为DNA疫苗免疫小鼠,可诱导机体产生弓形虫特异性的体液及细胞免疫应答,产生有效的抗弓形虫保护性免疫应答.结论:构建的弓形虫多表位DNA疫苗能诱导机体产生有效的保护性免疫应答,在控制弓形虫感染上具有可行性.     

HIV复合多表位DNA疫苗的设计及免疫研究

目的　设计新型HIV复合多表位DNA疫苗 ,探讨其在小鼠体内的免疫应答。方法以HIV抗原表位为基础进行新型HIV多表位DNA疫苗的抗原分子设计 ,利用化学合成的方法合成全新HIV抗原基因 ,并构建核酸疫苗重组质粒 ,免疫BALB c小鼠 ,利用合成的表位肽进行抗体水平、特异性淋巴细胞增殖实验、特异性CTL检测分析及迟发性超敏反应。同时 ,还对所设计的HIV复合多表位DNA疫苗与编码HIV全结构蛋白的DNA疫苗 (pVAXI gag gp12 0 )进行特异性CTL反应的比较研究。结果　所设计的新型HIV多表位DNA疫苗可在BALB c小鼠体内诱导出针对所选表位的强表位特异性的CTL反应和抗体反应。而HIV复合多表位DNA疫苗与编码HIV全结构蛋白的DNA疫苗相比可诱导产生更强、更广泛的表位特异性的CTL应答。结论　所设计的HIV复合多表位DNA疫苗对BALB c小鼠具有良好的体液和细胞免疫原性     

HCV核心-包膜E2抗原融合基因DNA疫苗的构建及对小鼠的免疫应答试验

目的：观察一种结构新颖的HCV融合抗原DNA疫苗在BALB/c小鼠的免疫效果，探讨其用于防治丙型肝炎的可行性。方法：用重叠延伸PCR拼接编码小鼠IgG kappa链信号肽和通用型辅助性T细胞表位PADRE的DNA片段，PCR分别扩增HCV核心抗原基因和包膜E2抗原基因，将3段基因插入真核表达载体pcDNA3.1，构成重组表达质粒pST-CE2t，转染COS7细胞，免疫组化检测HCV抗原的表达。将pST-CE2t和HCV核心抗DNA疫苗pcDNA3.1core分别肌肉注射接种BALB/c小鼠，检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和CTL反应。结果：pST-CE2t可在COS7细胞内表达HCV核心抗原和E2抗原，接种于BALB/c小鼠能有效诱导体液和细胞免疫应答，其中抗HCV核心抗原免疫应答的强度明显超过pcDNA3.1core，且更趋向于TH1型免疫应答。结论：pST-CE2t对于丙型肝炎的防治有潜在的应用价值。     

共表达不同水平的IL-12对于HBV DNA疫苗质粒免疫原性的影响

目的 在HBsAg DNA疫苗质粒中共表达IL-12佐剂分子,研究IL-12的表达水平对于HBV DNA疫苗质粒免疫原性的影响.方法 构建携带来源于中国地区C型HBV参照序列CHN-HBV07-C经密码子优化的preS2-S基因的DNA疫苗质粒pHBV,并将3个不同IL-12表达水平的佐剂分子表达盒序列分别克隆入该疫苗质粒中,通过瞬时转染293T细胞以检测重组质粒IL-12分子及乙肝表面抗原的表达情况.将不同IL-12表达水平的疫苗质粒免疫BALB/c雌性小鼠,IFN-γ的ELISPOT方法检测HBsAg抗原特异性的细胞免疫应答,化学发光定量ELISA法检测HBsAg特异的抗体水平.结果 成功构建3个不同IL-12表达水平的HBV DNA疫苗质粒,293T细胞转染结果显示:不携带IL-12分子表达盒的对照疫苗质粒pHBV的HBsAg表达水平可达70 ng/ml;低表达IL-12的疫苗质粒pHBV-12l的HBsAg表达水平为18 ng/ml;而高表达IL-12的重组疫苗质粒pHBV-12h的HBsAg表达水平仅为6 ng/ml.BALB/c小鼠的免疫结果表明:高表达IL-12分子的疫苗质粒pHBV-12h所诱导的细胞免疫及体液免疫水平相对于对照疫苗质粒pHBV均显著降低了.低表达IL-12分子的疫苗质粒pHBV-12l所诱导的抗体水平也显著降低了,但其细胞免疫应答水平却显著提高了.结论 在同一疫苗质粒中,高表达IL-12分子的质粒可能会影响到抗原蛋白的表达,而低表达IL-12分子的疫苗质粒却能增强细胞免疫应答.因此,平衡好佐剂分子及抗原蛋白的表达水平对于诱导高水平的免疫应答是个重要的因素.     

HSV-2gD核酸疫苗的构建及免疫效果观察

目的:在前期筛选的HSV-2gD模拟抗原表位序列P6的基础上,以pcDNA3.1(-)为载体、IL-18为佐剂,构建P6与IL-18串联的重组表达质粒,并在真核细胞中表达。将重组质粒免疫小鼠,观察免疫效果。方法:采用串联简并引物PCR法构建重组质粒pcDNA3.1-IL18-P6和pcDNA3.1-IL18,以酶切、测序鉴定。将重组质粒分别转染CHO细胞进行瞬时表达,通过间接免疫荧光和Western blot法检测P6的表达情况。将构建的真核表达质粒肌内注射免疫接种BALB/c小鼠3次,每次间隔1周。末次免疫后1周眼眶静脉采血,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体滴度、IFN-γ及IL-18含量;末次免疫后1个月,处死小鼠,无菌分离脾脏,MTT法测定脾淋巴细胞增殖率。结果:构建的串联重组质粒pcDNA3.1-IL18-P6和pcDNA3.1-IL18经酶切及测序显示基因序列完全正确,经间接免疫荧光、Western blot法检测可证实模拟抗原表位序列P6具有近似天然序列的生物学活性。重组核酸疫苗pcDNA3.1-IL-18-HSV P6免疫小鼠后可刺激血清特异性抗体的产生,诱导分泌较高水平的IFN-γ和IL-18。可促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。结论:成功构建和表达了重组质粒pcD-NA3.1-IL18-P6,其能诱导较强的细胞免疫和体液免疫,从而为构建更加有效的HSV-2DNA疫苗奠定了良好的基础。     

多CTL表位DNA疫苗诱导特异性CTL应答的研究

目的:构建多CTL表位DNA疫苗诱导特异性CTL应答。方法:将编码两个HCVCTL表位(H-2d)的基因序列插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建多CTL表位DNA疫苗。用其免疫BALB/c小鼠后,以经不同CTL抗原肽冲击的P815细胞(H-2d)作为靶细胞,进行CTL杀伤试验。结果:多CTL表位DNA疫苗可诱导机体产生针对其编码的两种HCVCTL表位的特异性CTL免疫应答,且总的特异性CTL杀伤效应增强。结论:通过天然侧翼氨基酸相连的多个CTL表位为编码序列构建的多CTL表位DNA疫苗,不但能诱导机体产生针对各个CTL表位的特异性CTL应答,而且各特异性CTL应答的联合作用可显著增强总的CTL杀伤效应。     

SARS S603-620表位核酸疫苗诱导BLAB/c小鼠产生特异性体液免疫应答

目的构建SARSS抗原的B细胞表位核酸疫苗并观察其免疫效果。方法将已经鉴定的SARSS抗原的B细胞表位S603-620的编码DNA序列插入真核表达载体PCI中,构建核酸疫苗（PCI-S603-620）。使用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切,电泳及DNA测序鉴定。使用脂质体将PCI-S603-620转入293A细胞,使用ELISA检测其在真核细胞中的表达。使用PCI-S603-620免疫小鼠,ELISA检测其诱导的抗体情况。结果对PCI-S603-620进行酶切鉴定,电泳结果表明目的基因片段分子量为100bp左右。PCI-S603-620的DNA测序结果表明其序列与设计序列吻合。PCI-S603-620能在转染的293A细胞中表达。PCI-S603-620免疫小鼠可以诱导特异性抗体产生,效价为1：400。该抗体可以特异性识别SARSS抗原。结论成功构建SARSS抗原的B细胞表位核酸疫苗（PCI-S603-620）。     

TERT多表位疫苗的制备及其免疫原性初步研究

目的:制备端粒酶逆转录酶(TERT)的多表位(meTERT)肽疫苗和DNA疫苗,免疫小鼠,对其免疫原性进行初步研究。方法:用重叠延伸PCR将TERT的多个CD4+和CD8+T细胞表位串联连接,得meTERT的DNA片段;将该片段分别连接到真核表达载体pcDNA3.1及原核表达载体pGEX-4T中,制备DNA疫苗(PCT),并原核表达多表位肽疫苗(PCG);皮下/肌肉(50μg/100μg)免疫小鼠3次,取脾细胞,用ELISPOT法检测分泌IFN-γ和IL-4的细胞频率;用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性脾细胞杀伤率(抗原刺激的SP2/0细胞为靶细胞)。结果:成功制备meTERT的PCT和PCG疫苗;动物实验表明:PCT+PCG联合免疫诱导的分泌IFN-γ的淋巴细胞数量显著高于其它各组(P0.01);另外,PCT+PCG诱导的分泌IFN-γ的淋巴细胞数显著高于分泌IL-4的数量;PCT+PCG联合免疫诱导了显著的脾细胞杀伤活性(67.8%)。结论:含多个CD4+和CD8+T细胞表位的meTERT的DNA疫苗PCT和多表位肽疫苗PCG联合免疫能够诱导强烈的Th1和CTL细胞免疫应答。     

乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性

目的 :探讨HBV复合多表位DNA疫苗诱导体液及细胞免疫的可行性。方法 :将HBV多表位抗原基因BPT克隆到真核表达载体pcDNA3.1中 ,构建重组真核表达载体pcDNA3.1/BPT。将其通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠 ,用间接免疫ELISA法、CTL杀伤功能检测和淋巴细胞增殖试验 ,检测特异性体液免疫和细胞免疫的水平 ,并观察其对免疫小鼠的毒副作用。结果 :用重组质粒pcDNA3.1/BPT免疫BALB/c小鼠后 ,在效靶比为 10 0∶1时 ,可诱导显著地特异性CTL应答 (P <0 .0 5 )。ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG的水平明显升高 (P <0 .0 5 )。在BPT基因原核表达蛋白的刺激下 ,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖显著 (P <0 .0 5 )。RT PCR分析表明 ,IL 12mRNA的水平亦明显升高。结论 :HBV多表位基因疫苗可诱发特异性免疫应答 ,为预防、治疗性HBV疫苗的研制提供了一定的实验依据