SUMO特异性蛋白酶3在HBV复制中的作用机制

目的初步探讨SUMO特异性蛋白酶3(SENP3)在HBV感染中的作用机制。方法体外培养HepG2.2.15细胞,或利用HBV转基因小鼠肝脏组织,通过表达SiRNA干扰等,经蛋白质印迹、实时PCR、免疫组织化学染色等实验技术,检测SENP3在HBV感染细胞模型中的表达。结果 HBV DNA与其PBMC中SENP3的含量呈反比。健康对照组PBMC中SENP3的平均蛋白水平是CHB患者的7.4倍(P0.05)。HBV转基因小鼠肝脏中SENP3表达显著降低,小鼠肝脏组织中AKT磷酸化水平增高,是健康对照组的4.1倍(P0.01)。SENP3在HBV DNA全基因重组质粒转染的HepG2受体细胞(HepG2.2.15)中表达量显著低于未转染HBV DNA的HepG2细胞。与HepG2细胞相比,HepG2.2.15细胞中AKT磷酸化水平显著增高,其含量平均是HepG2细胞的5.2倍(P0.01);在HepG2.2.15细胞中转染SENP3质粒使其过表达,则AKT磷酸化水平降低,HBV DNA含量降低,并与SENP3质粒浓度呈负相关性;分别向HepG2.2.15细胞转染100ng和500ng的SENP3质粒,则细胞中HBV DNA含量由对照组中的7.983.03×106 IU/mL降低至3.45×106 IU/mL和1.92×106 IU/mL;应用siRNA干扰SENP3在HepG2.2.15细胞中的表达,则Akt磷酸化水平升高,其浓度是对照组的5.6倍(P0.01)。结论机体HBV DNA载量与SENP3的表达量呈负相关,SENP3可通过抑制肝细胞AKT磷酸化水平,降低HBV DNA载量。     

microRNA let-7a对乙型肝炎病毒复制的影响

目的 研究microRNA let-7a(以下简称let-7a)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响.方法 (1)收集23例伴有慢性活动性乙型肝炎的肝细胞癌(HCC)患者的手术标本,用实时荧光定量PCR(real-time qRT-PCR)检测let-7a在HCC组织中的表达,分析let-7a的表达和HBV复制状态之间的关系.(2)用real-time qRT-PCR法检测HBV稳定复制的HCC细胞系HepG2.2.15及其亲本HCC细胞HepG2的let-7a表达.(3)通过细胞转染,利用let 7a特异的反义寡核苷酸抑制物下调HepG2.2.15细胞中let-7a的表达,通过实时PCR(real time PCR)检测HBV DNA水平的变化.结果 let-7a在HBV高复制的临床HCC标本中明显高于HBV低复制者(P＜0.05).与HepG2相比,let-7a在HBV稳定复制的HepG2.2.15细胞系中表达上调(P＜0.05).let-7a抑制剂能显著抑制HBV DNA的水平,并且具有时间依赖性(P＜0.05).结论 let-7a的表达和HBV的复制状态呈正相关,let-7a能促进HBV复制.     

低密度cDNA Macroarray对干扰素α抗病毒蛋白的筛选

目的 基于低密度cDNA Macoarray技术筛选出差异表达的干扰素(IFN)α抗病毒基因,以探讨IFN α抗病毒蛋白的表达与HBV复制的关系. 方法 以一定浓度的IFN α处理肝胚瘤细胞株HepG2和HepG2.2.15细胞6h,用cDNA Macroarray分析比较两细胞株IFN α抗病毒基因表达谱,并筛选出差异表达的IFNα抗病毒基因.将表达HBV核心蛋白(HBc)的质粒pHBc-EGFP转染HepG2细胞,RT-PCR法分析HBc对IFN α抗病毒基因表达的影响.将表达抗黏病毒A蛋白(MxA)的表达质粒pcDNA3.1-Flag-MxA转染HepG2.2.15,以酶联免疫吸附试验、Dot blot、Southern blot等方法分别检测HepG2.2.15细胞表达释放的HBsAg与HBeAg、细胞外HBV DNA和细胞内HBV DNA复制中间体(松弛环状DNA、双股线性DNA),以判断HBV复制情况.两组间数据比较采用t检验,组间不同时间点数据比较采用单因素方差分析.结果 cDNA Macroarray分析显示HepG2和HepG2.2.15细胞的抗病毒基因表达谱具有差异性:IFNa抗病毒基因中干扰素诱导跨膜蛋白(IFITM)1、IFITM2、IFITM3、RING4等在HepG2.2.15细胞的表达被部分抑制,而重要的抗病毒蛋白MxA表达被完全抑制.HBc转染组细胞中MxA mRNA表达的相对水平为0.31±0.05,低于空白对照组的0.74±0.04,差异有统计学意义,P＜0.05.MxA蛋白转染HepG2.2.15细胞48、72 h后,MxA转染组细胞上清液中HBsAg的S/CO值分别为1.42+0.21和1.58±0.18,HBeAg的S/CO值为1.44±0.14和2.28±0.24,而空白对照组细胞上清液中HBsAg的S/CO值为1.92±0.19和2.79±0.25,HBeAg的S/CO值为2.31±0.46和3.37±0.29,两组细胞上清液中HBV抗原的S/CO值差异均有统计学意义,P值均＜0.05.细胞外HBV DNA、胞内HBV复制中间体DNA均无明显变化.结论 HBV及其抗原成分的复制和表达影响着IFNα抗病毒蛋白的表达;HBV通过抑制IFN α抗病毒蛋白的表达而发挥拮抗IFNα的抗病毒活性.     

肽核酸抑制HBV复制与表达的体外研究

合成肽核酸(PNA)片段,由OligofectamineTm转染至HepG2.2.15细胞与HBV各编码区保守区域相结合。用ELISA方法测定HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg滴度,PCR测定HBV DNA含量。通过计算抑制百分率,筛选有效PNA片段。结果在500 mol/L浓度下,PG3 HBsAg、HBeAg、HBV DNA表达抑制率分别为51.03%、55.38%、20.10%;PG6 HBsAg、HBeAg、HBV DNA表达抑制率分别为47.00%、43.10%、51.03%。表明PNA可由OligofectamineTm转染至HepG2.2.15细胞,从而抑制HBV的复制和抗原系统的表达。     

地塞米松、环磷酰胺和他克莫司三种免疫抑制剂影响HBV复制的体外研究

目的探讨地塞米松(DEX)、环磷酰胺(CYP)和他克莫司(FK506)在体外对HBV蛋白合成、DNA复制的影响。方法将不同浓度的DEX、CYP和FK506作用于HepG2.2.15细胞系,通过MTT实验确定药物安全浓度范围,通过检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg水平,以及细胞内HBV DNA水平来评价HBV的表达和复制情况。结果DEX、CYP和FK506的药物安全浓度范围分别为0~500、0~1000和0~10μg/mL。与培养基对照处理相比,FK506处理后HBsAg、HBeAg分泌及HBV DNA复制变化差异无统计学意义;CYP处理增加HBsAg分泌,与对照相比差异有统计学意义(P0.05);但HBeAg分泌及HBV DNA复制变化差异无统计学意义;DEX作用减少HBsAg和HBeAg的分泌,与对照相比差异有统计学意义(P0.05);但是细胞内HBV DNA复制水平差异无统计学意义(P0.05)。结论在药物安全浓度范围内,FK506对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制无直接抑制或促进作用。CYP处理后增加HepG2.2.15细胞HBsAg表达,但HBeAg表达及HBV DNA复制变化差异无促进作用;DEX处理抑制HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达,但对HBV DNA复制无抑制作用。     

APOBEC3F剪接亚型与全长APOBEC3F、APOBEC3G对乙肝病毒作用的比较

目的比较APOBEC3F剪接亚型3F79与完整APOBEC3F以及APOBEC3G对HepG2.2.15细胞中HBV DNA复制及HBsAg、HBeAg抗原分泌的影响。方法用PCR合成法扩增人APOBEC3F剪接亚型3F79,构建真核表达载体pEGFPC1-3F79和原核表达质粒pET28a-3F79,将pEGFPC1-3F79与含有全长APOBEC3F和APOBEC3G的质粒Pflag-APOBEC3F、PC-APOBEC3G-HA转染入HepG2.2.15中,检测转染后细胞上清中HBV DNA以及HBsAg和HBeAg的水平。结果构建的重组载体经酶切和PCR鉴定,表明3F79基因正确地插入。将pEGFPC1-3F79与Pflag-APOBEC3F、PC-APOBEC3G-HA转染HepG2.2.15细胞后,pEGFPC1-3F79对细胞中HBV的复制及HBsAg和HBeAg的分泌无明显的抑制作用(P0.05),而转染含有完整APOBEC3F和APOBEC3G质粒的HepG2.2.15细胞与对照组相比,HBsAg、HBeAg、HBV DNA含量明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。结论 3F79不能像完整APOBEC3F和APOBEC3G一样抑制HepG2.2.15细胞中HBV DNA复制以及抗原的分泌。     

靶向乙型肝炎病毒X区的siRNAs对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用

目的观察siRNA对HBV基因表达和复制的抑制情况。方法针对HBVX区设计并化学合成4条siRNAs,观察在不同浓度下对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用。结果 siRNA在30nmoL/L浓度时,4种siRNA对HepG2.2.15细胞HbsAg和HBeAg无明显的抑制作用(P0.05);在60nmoL/L和90nmoL/L浓度下,siR-NA-1和siRNA-4有明显的抑制作用(P0.05),他们对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为41%和43%;siRNA能降低HepG2.2.15细胞HBVDNA的拷贝数。结论化学合成的siRNAs可以有效地抑制HBV基因的表达和复制。     

核定位信号突变型P21真核表达载体的构建及其对HepG2.2.15细胞病毒复制的影响

目的构建核定位信号突变型P21基因的真核表达载体并初步探讨其对HBV复制的影响。方法采用基因定点诱变技术突变P21基因的核定位信号序列,采用DNA重组技术,亚克隆突变型P21基因至pDsRed1-C1真核表达载体中,重组为pDsRed1-C1-p21NLS-,酶切鉴定及DNA测序,脂质体转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR检测目的基因pDsRed1-C1-p21NLS-的表达,荧光显微镜观测目的基因亚细胞定位,ELISA法检测培养上清液中HBsAg、HBeAg的水平。结果 pDsRed1-C1-p21NLS-质粒构建成功,与野生型相比,主要在胞浆表达,促进病毒的复制。二者差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 P21的亚细胞定位,对HepG2.2.15细胞中病毒复制的影响具有明显差异。胞核P21抑制病毒的复制,而胞浆P21促进病毒复制。     

靶向HBV C区RNAi对HBV复制和HBeAg表达的抑制作用

目的观察靶向HBVC基因区的RNA干扰（RNAi）对HBV复制的抑制作用。方法选择HBV基因组C区的Nt2021-2049作为靶序列,合成相应的正、反义寡核苷酸,退火后形成双链,克隆人shRNA表达质粒,将得到的质粒与HBV质粒共转染HepG2细胞,观察HepG2细胞中HBV的受抑情况。结果病毒复制及HBeAg的表达明显受到抑制。结论所选靶区通过RNAi可有效抑制HBV复制。     

细胞内La蛋白对乙型肝炎病毒蛋白质表达的影响

目的 探讨细胞内La蛋白对HBV蛋白质表达的影响.方法 针对人La蛋白序列设计特异性的小分子干扰RNA(siRNA),通过体外转录的方法合成双链siRNA,并转染进入稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞,实时荧光定量基因扩增技术测定HepG2.2.15细胞中的La蛋白mRNA变化水平;电化学发光分析技术检测HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg变化情况.所得数据进行配对假设检验的统计学分析.结果 特异性siRNA干扰La蛋白mRNA的表达,使La蛋白在HepG2.2.15细胞中的表达降低;HepG2.2.15细胞分泌在培养上清液中的HBsAg和HBeAg表达显著下降,相关性分析显示,HBsAg、HBeAg变化水平与La蛋白mRNA变化水平呈正相关,相关系数分别为0.938和0.899.结论 特异性siRNA能够抑制细胞内La蛋白mRNA的表达,La蛋白可通过某种方式影响HBV蛋白质的表达.     

靶向ASGPR1的外源性microRNA对HBV表达和复制的抑制作用

目的:设计并构建ASGPR1靶向的mieroRNA表达载体,观察其对ASGPR1基因的抑制作用及其在HBV感染基因治疗中的应用价值.方法:以ASGPR1为靶基因.设计并构建3个针对ASGPR1不同位点的microRNA表达栽体.通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RTPCR和Western blot检测其对ASGPR1 mRNA和蛋白的抑制作用,乙肝五项定量和HBVDNA检测其对HBV的抑制作用.结果:ASGPR1 mRNA和蛋白的平均水平分别下降了57.3%和49.8%(P＜0.01);在病毒水平3种amiRNA均能明显抑制相应细胞株中HBsAg和HBeAg的分泌,其中以amiRNAASGPR1-610抑制作用最强,对培养72 h的细胞上清中的HBsAg和HBeAg抑制率分别为31.3%和33.6%(P＜0.01),HBV DNA的抑制率为29.7%(P＜0.01).结论:靶向ASGPR1的外源性microRNA能显著抑制靶基因的表达,进而抑制HBV的复制和表达.ASGPR1可以作为慢性HBV感染基因治疗的候选靶点.     

乙型肝炎病毒(HBV)反基因与HBV的结合及对HBV复制的影响

目的 研究三螺旋形成寡核苷酸与HBV基因的结合情况及其对HBV复制的影响。方法 全盛一段能与HBV核心启动子位点（1734-1753nt)形成三螺旋的寡核苷酸（TF020）并标记上生物素分别用脂质体-TF020及裸TF020转染HepG2.2.15细胞,用链酶亲和素-生物素法（SABC）检测其转染效率及其与HepG2.2.15细胞中HBVDNA的结合情况;并采用ELISA、半定量逆转录（RT）-PCR及荧光定量PCR法分别检测经寡核苷酸处理的HepG2.2.15细胞及空白对照细胞上清HBsAg、HBeAg、HBV DNA及细胞中HBV RNA的水平。结果 脂质体-TF020转染HepG2.2.15细胞的效率可达80%,而裸TFO20转染率最高为40%;TF020主要定位于细胞核及胞浆中,TF020处理组细胞上清中HBsAg、HBeAg含量分别较空白对照组降低37.0%及78.2%,HBV DNA水平较空白对照组明显降低;而细胞中2.4kb/2.1kb RNA、3.5kb/3.4kbRNA亦分别降低31.6%及70.2Z%。结论 TF020通过脂质体包裹后可以很好地进入细胞并与HBV DNA结合;TF020能够有效地抑制HBV复制,发挥抗病毒作用。     

蛋白转导结构域介导乙型肝炎病毒聚合酶末端蛋白重链可变区抗体体外抑制病毒的复制

目的 蛋白转导结构域(TAT)介导HBV聚合酶末端蛋白(TP)重链可变区(VH)抗体,研究特异性TAT-VH抗体体外对HBV复制的影响.方法 将TAT-VH基因克隆入原核表达载体pET28a(+),在大肠埃希菌BL21(DE3)LysS内诱导融合蛋白表达并进行纯化.纯化的TAT-VH加入培养的HepG2.2.15细胞,间接免疫荧光法检测其导入HepG2.2.15细胞的效率,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对细胞生长代谢的影响,将TAT-VH加入培养的HepG2.2.15细胞,定量PCR法检测HBV DNA水平.数据行单因素方差分析和t检验.结果 成功制备了TAT-VH融合蛋白,间接免疫荧光及MTT证实TAT-VH可以跨膜导入HepG2.2.15细胞,且对细胞生长无影响;加入5 000 nmol/L TAT-VH的HepG2.2.15细胞培养上清液内HBV DNA为(1.211±0.132)lg拷贝/mL,对照组为(5.325±0.041)lg拷贝/mL(t=72.91,P＜0.05);细胞内分别为(3.521±0.411)和(8.532±0.132)Ig拷贝/mL(t=28.41,P＜0.05).结论 HBV聚合酶TP区特异性TAT-VH抗体在体外可抑制HBV复制,为应用细胞内抗体治疗HBV感染提供了良好的实验基础.     

不同修饰的反义寡核苷酸体外抗乙型肝炎病毒效果的比较

为研究应用锁核酸(locked nucleic acid,LNA)抗HBV的作用,我们设计针对HBV S基因的反义寡核苷酸,分别经过LNA、硫代反义寡核苷酸(phosphorothioate antisenseoligodeoxy nucleotide,PS-ODN)修饰,以阳离子脂质体为载体介导转染HepG2.2.15细胞,比较它们对细胞表达HBsAg、HBeAg和复制HBV DNA的影响.     

针对HBV X基因的siRNA抑制HepG2细胞HBV的复制和表达

目的构建能转录产生针对乙型肝炎病毒（HBV）X基因转录体的小干扰RNA（siRNA）转录载体pSIH—BV／X,研究其在体外对HBV复制和抗原表达的抑制作用。方法将构建成功的pSIHBV／X与HBV1．3倍体真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞，转染后24、48、72h检测上清液中HBsAg、HBeAg的变化，并检测72h时HBV DNA的变化。结果成功构建了针对HBVX基因转录体的siRNA表达载体pSIHBV／X，并发现它能抑制HBsAg、HBeAg的分泌，抑制高峰在72h．抑制率分别是64％和61％，而无关对照序列的siRNA无此作用。荧光定量PCR证实HBV DNA的复制亦受到抑制，抑制率31％。结论针对HBVX基因转录体的siRNA在体外具有抑制HBV复制和抗原表达的作用。     

乙型肝炎病毒L02细胞转染模型的建立与鉴定

我们以L02细胞为基础,利用基因重组技术构建含1.3倍加长乙型肝炎病毒(HBV)全基因组的表达质粒pcDNA-HBV,进行基因转染,获得了类似HepG22.2.15(简称2.2.15细胞)(HepG2转染HBVDNA后所得)具有复制和分泌HBV能力的HBV转染细胞模型。     

miRNA-216a与胰腺癌的研究进展

miRNA-216a是近年来新发现的非编码小分子RNA,在转录水平通过对mRNA的调控影响基因的表达。越来越多的实验证明miRNA-216a在胰腺癌中表达下调,并且通过抑制靶基因表达或者上调自身的表达,进而抑制胰腺癌的发展、侵袭、转移,促进胰腺癌细胞凋亡,miRNA-216a有望成为胰腺癌基因治疗的新靶点,我们就miRNA-216a在胰腺癌中的研究进展作一综述。     

靶向S区和C区基因的M1GS RNA核酶共同抑制HBV的表达

目的:研究靶向HBVS区和C区基因的M1GSRNA核酶共同作用对HBV基因表达的影响.方法:选择HBVayw亚型S区基因294nt和C区基因2333nt为切割位点,以含有编码M1RNA的DNA序列的质粒pTK117为模板,通过PCR扩增得到M1GSRNA核酶的DNA模板,并将其克隆至真核表达载体pEGFP-C1得到重组质粒pEGFP-GSS和pEGFP-GSC.将2个重组质粒共转染HepG2.2.15细胞,转染后ELISA法测细胞培养液中的HBsAg和HBeAg,RT-PCR检测HBVmRNA.结果:成功构建了分别靶向HBVS区基因和C区基因的真核表达载体.共转染HepG2.2.15细胞后,HBsAg和HBeAg的表达分别被抑制了33.2%和39.1%,HBVCmRNA和SmRNA分别被抑制了32.5%和29.7%,而HepG2.2.15细胞的增殖无明显变化.结论:靶向HBVS区和C区基因的M1GSRNA核酶共同作用可特异性抑制HBVS区和C区基因的表达.     

应用基因芯片筛选HBV 对肝癌细胞脂代谢相关基因影响的初步研究

目的通过基因芯片技术探测HBV感染对肝癌细胞脂代谢相关基因表达的影响,为深入研究HBV在肝癌脂代谢中的作用及机制提供新的依据。方法本研究以HepG2细胞作为对照,用稳定表达HBV的肝癌细胞HepG2.2.15来模拟HBV感染的肝癌细胞,利用基因芯片对肝癌细胞HepG2和HepG2.2.15进行分析,筛选出脂代谢相关的差异表达基因,对差异基因参与的信号传导通路进行分析。RT-PCR检测显著差异表达基因CYP1A1、CYP1B1和AHR。结果基因芯片共筛选出肝癌细胞HepG2和HepG2.2.15中差异表达基因共1263个,其中涉及脂代谢的基因有92个,具有表达上调的基因53个,表达下调的基因39个,涉及细胞生长、增殖、分化、运动和耐药等多种分子功能。RT-PCR检测脂代谢差异表达基因,其结果与芯片结果一致,确定芯片检测结果可靠。结论应用人类表达芯片成功筛选出HBV转染的人肝癌细胞后的脂代谢相关差异表达基因,为HBV感染在肝癌中的作用提供线索。     

复方六月雪体外抗HBV的实验研究

目的观察复方六月雪(CLYX)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。方法在最大无毒浓度(TC0)基础上观察不同浓度药物作用于HepG2.2.15细胞,分别在第4天和8天收集细胞培养上清液,采用实时荧光定量PCR法检测上清液HBV DNA的含量,采用ELISA法测定上清液HBsAg和HBeAg的滴度。结果无毒浓度的复方六月雪在HepG2.2.15细胞培养中可有效地抑制细胞HBV DNA的复制及HBsAg和HBeAg的分泌。结论CLYX在体外有显著的抗HBV的作用。