A Novel Chitosan CpG Nanoparticle Regulates Cellular and Humoral Immunity of Mice

Objective To develop a safe and novel immunoadjuvant to enhance the immunity and resistance of animals against E. coli infection. Methods An 88-base immunostimulatory oligodeoxynuleotide containing eleven CpG motifs （CpG ODN） was synthesized and amplified by PCR. The chitosan nanoparticle （CNP） was prepared by ion linking method to entrap the CpG ODN that significantly promotes the proliferation of lymphocytes of pig in vitro. Then the CpG- CNP was inoculated into 21-day old Kunming mice, which were orally challenged with virulent K88/K99 E. Coil 35 days after inoculation. Blood was collected from the tail vein of mice on days 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, and 49 after inoculation to detect the changes and content of immunoglobulins, cytokines and immune cells by ELISA, such as IgG, IgA, IgM, IL-2, IL-4, and IL-6. Results The CpG provoked remarkable proliferation of lymphocytes of pig in vitro in comparison with that of control group （P〈0.05）. The inoculation with CpG-CNP significantly raised the content of IgG, IgM, and IgA in the sera of immunized mice （P〈0.05）. The levels of IL-2, 1L-4, and IL-6 in the mice significantly increased in comparison with those in controls （P〈0.05）, so was the number of white blood cells and lymphocytes in immunized mice. The humoral and cellular immunities were significantly enhanced in immunized mice, which resisted the infection of E coli and survived, while the control mice manifested evident symptoms and lesions of infection. Conclusions CpG-CNP can significantly promote cellular and humoral immunity and resistance of mice against E. coli infection, and can be utilized as an effective adjuvant to improve the immunoprotection and resistance of porcine against infectious disease.     

含CpG基序的寡核苷酸对乙型肝炎病毒基因疫苗的细胞免疫效应的影响

目的探讨人工合成的CpG ODN作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生细胞免疫应答的影响.方法构建编码乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗,人工合成含CpG基序(motif)的硫代磷酸寡核苷酸(CpG ODN)作为佐剂,观察其对HBV基因疫苗接种Balb/c小鼠诱导产生淋巴细胞增殖和淋巴细胞杀伤等细胞免疫应答的影响.结果与空载体对照组相比较,HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的淋巴细胞增殖及杀伤效应(P＜0.05);应用CpGODN组与未应用组相比较,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞免疫应答(P＜0.05).结论CpG ODN作为佐剂,对HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生细胞免疫应答具有促进作用.     

CpG ODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠和HBV转基因C57BL/6J小鼠

目的:探讨人工合成硫代修饰的含CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)作为佐剂对HBsAg诱导BALB/c和HBV转基因小鼠产生免疫应答的影响. 方法: 用人工合成CpG ODN与血源HBsAg联合免疫BALB/c和HBV转基因C57BL/6J小鼠,采用ELISA方法观察小鼠血清HBsAg及抗-HBs水平,用ELISPOT方法判断CpG ODN对HBsAg免疫小鼠脾T淋巴细胞分泌细胞因子的影响. 结果: CpG ODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠较HBsAg单独注射组同期抗-HBs滴度明显提高,尤其在首次免疫后6、8、12 wk,2组比较差异显著(P<0.05),联合免疫较CpG ODN单独免疫自首次免疫后4 ～16 wk差异显著(P<0.05).与HBsAg,CpG ODN 单独免疫比较,联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFN- γ T细胞分别增加3或9倍;CpG ODN,HBsAg联合免疫可诱导转基因小鼠产生抗-HBs,随时间延长,抗体滴度逐渐升高,并能使更多小鼠产生抗体,而单用HBsAg组、CpG ODN组均不能诱导抗-HBs的产生,免疫后各组血清HBsAg浓度较免疫前明显下降(P <0.05),但组间无明显差别(P>0.05),与HBsAg,CpG ODN 单独免疫比较,联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFN- γ T细胞分别增加3或11倍. 结论: CpG ODN作为佐剂可增强HBsAg诱导BALB/c小鼠产生体液及细胞免疫应答,CpG ODN ,HBsAg联合免疫可打破HBV转基因小鼠对HBsAg免疫耐受,可望成为慢性乙型肝炎的有效预防和治疗性疫苗.     

伤寒Ty21a-CpG佐剂减毒活疫苗诱导抗体应答的研究

目的探讨人工合成的CpG-ODN 作为佐剂对伤寒Ty21a减毒活疫苗诱导小鼠产生抗体的影响.方法将不同剂量的人工合成的含CpG ODN的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂与伤寒Ty21a减毒活疫苗混合,以小鼠作为免疫动物进行免疫接种,采用试管凝集法检测免疫小鼠的血清特异性抗体滴度.结果 CpG-ODN 30μg佐剂组与不用佐剂的Ty21a减毒活疫苗相比较,应用CpG-ODN 组小鼠产生更强的抗体应答,抗体几何均数滴度相比有明显的差异.结论 CpG-ODN作为佐剂可促进伤寒Ty21a减毒活疫苗诱导昆明小鼠产生特异性免疫应答.     

脂质体包裹CpGODN和肿瘤抗原治疗肝癌的免疫效应

目的探索脂质体、CpG寡核苷酸（ODN）以及Hepa1-6肝癌细胞裂解物联合应用治疗肝癌的免疫效果。方法建立C57BL／6小鼠肝癌模型,以PBS、ODN＋rtep（肝癌细胞Hep）,Lip（Lipofectamine脂质体）＋HDN＋Hep荷瘤鼠背部皮下注射,各组小鼠肝脏HE染色,FCM检测小鼠脾脏CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、NKl．1-FITC的组成,ELISA法测免疫小鼠血清中IFN-Y、IL-4水平。结果脂质体包裹CpGODN＋Hepa1-6肝癌细胞裂解物中CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-F1TC、NKl．1-FITC的体外杀伤活性以及荷瘤小鼠血清中IFN-7、IL-4水平均显著高于CpGODN＋Hep组以及PBS组。结论脂质体包裹CpGODN＋Hep能显著提高机体的免疫功能,尤其是特异性细胞免疫功能。     

CpG-ODN调节小鼠免疫细胞对HBsAg体液免疫应答性的初步研究

目的：初步探寻能够刺激小鼠免疫系统产生针对HBsAg的体液免疫应答的最佳CpG-ODN序列。方法：应用正交设计法设计含有不同序列的10例CpG-ODN免疫小鼠，以研究影响CpG-ODN免疫活性的6个因素；免疫时间，CpG基序侧翼核苷酸、5‘‘‘‘‘‘‘‘-poly(A)、硫代修饰，回文结构和CpG-基序数量，筛选出量优组合的CpG-ODN。结果：10例CpG-ODN与HBsAg一起免疫小鼠均可不同程度地诱导小鼠抗HBsAg抗体水平的变化，显示出CpG-ODN较强的佐剂效应。结论：CpG-ODN与HBsAg一起免疫小鼠可诱导小鼠产生强烈的抗体应答，以六个因素均存在时CpG-ODN的免疫刺激活性较强，即10号序列5‘‘‘‘‘‘‘‘-AAAAAACGTTAACGTT-3’为本实验中刺激小鼠免疫系统产生针对HBsAg的体液免疫应答的最佳序列。     

含CpG免疫刺激序列的质粒增强HBsAg诱导的免疫应答

目的 探讨以含有多拷贝CpG寡脱氧核苷酸的质粒作为治疗性乙肝疫苗佐剂的可行性。 方法 构建含有6个拷贝D型CpG ODN的质粒pKO-CG6,将该质粒以及载体pKO分别刺激健康人以及HBV感染者的外周血单核细胞（PBMC）,检测PBMC的增殖以及分泌的细胞因子IFN-与IL-12,进一步将重组HBsAg分别联合这两种质粒免疫小鼠,检测小鼠的细胞和体液免疫应答。结果 质粒pKO-CG6与载体pKO在体外均能有效激活健康人以及HBV感染者PBMC的增殖反应,并促进IFN-与IL-12的产生,其中pKO-CG6的免疫刺激活性明显强于载体pKO。小鼠体内试验表明,虽然载体pKO也具有免疫佐剂作用,但pKO-CG6更能显著增强HBsAg诱导的免疫应答,尤其是细胞免疫应答。 结论 含有多拷贝D型CpG ODN的质粒能有效激活HBV感染者的PBMC,并增强HBsAg在小鼠体内的免疫原性,对于治疗性乙肝疫苗具有潜在应用前景。     

热休克蛋白融合蛋白抗肿瘤免疫佐剂的初步筛选

目的：筛选一种具有增强热休克融合蛋白HSP-MUC1抗肿瘤作用的免疫佐剂。方法：将HSP-MUC1与新型CpG ODN或人源性IFNα2b混合后皮下注射MUC1阳性荷瘤小鼠,各分4组,分别是磷酸盐缓冲液（PBS）、HSP-MUC1、CpG ODN（hIFNα2b）及HSP-MUC1+CpG ODN（HSP-MUC1＋hIFNα 2b）。观察各组肿瘤发生率及肿瘤体积变化。结果：HSP-MUC1+CpG ODN组与PBS组及HSP-MUC1组比较小鼠的肿瘤发生率及肿瘤重量均降低(P<0.05);单独应用CpG ODN组表现出与HSP-MUC1+CpG ODN组相似的抑瘤作用,与PBS组及HSP-MUC1组比较,肿瘤发生率及肿瘤的重量均降低（P<0.05）;而HSP-MUC1+IFNα2b组与PBS组及HSP-MUC1组比较,小鼠肿瘤发生率及肿瘤重量差异均无显著性（P>0.05）。结论：CpG ODN是一种能增强HSP-MUC10抗肿瘤作用的免疫佐剂,人源性IFNα2b则不能增强HSP-MUC1的抗肿瘤活性。     

佐剂CpG ODN对HBV基因疫苗诱导抗体产生的影响

目的 探讨人工合成的ＣｐＧ ＯＤＮ作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生抗ＨＢｓ的影响。方法 构建编码乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原蛋白Ｓ的重组真核表达质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,人工合成含ＣｐＧ ｍｏｔｉｆ的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂,以ＢＡＬＢ／ｃ小鼠作为实验动物进行免疫接种,采用ＥＬＩＳＡ法检测免疫小鼠的抗ＨＢｓ应答。结果 与生理盐水作为佐剂组相比较,应用ＣｐＧ ＤＯＮ组小鼠产生更     

Enhancement of Immunological Activity of CpG ODN by Chitosan Gene Carrier

To investigate the enhancement of immunological activity of CpG ODN by chitosan gene carrier in mice, the effect of lymphocyte proliferation was detected in mice by using MTT, the levels of IgG and cytokines (IL-2 and IL-12) in serum were measured by ELISA and peripheral blood T lymphocyte subsets CD4 , CD8 were analyzed by flow cytometry. Our results showed that spleen lymphocytes isolated from the CS-CpG ODN group of mice showed the strongest proliferation (SI =1.551), and the levels of IgG, IL-2 and IL-12 in serum were higher than those of other groups. Com- pared with the immunization with CpG ODN, the immunization with CS-CpG ODN gene carrier was more efficient in up-regulating the percentage of CD4 T cells and the ratio of CD4 /CD8 of mice. It was concluded that CS gene carrier of CpG ODN was much more effective in improving immunity of CpG ODN in mice.     

CpG ODN对哮喘气道MMP-9表达的影响

目的：探讨非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤的寡核苷酸链（CpG ODN）对哮喘气道重塑和气道基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的影响。方法：以卵蛋白致敏激发的小鼠慢性哮喘模型为对象,观察对照组、哮喘组、CpG ODN组及地塞米松组之间支气管壁厚度改变及气道MMP-9表达。结果：（1）CpG ODN组和地塞米松组的支气管壁厚度大于对照组而小于哮喘组（P〈0．05）,而CpG ODN组和地塞米松组间则无显著差异（P〉0．05）;（2）CpG ODN组和地塞米松组MMP-9表达高于对照组（P〈0．05）而小于哮喘组（P〈0．05）,CpG ODN组和地塞米松组间则无显著差异（P〉0．05）。结论：慢性哮喘小鼠气道壁明显增厚,而早期行CpG ODN干预则可抑制肺内MMP-9的表达而减轻气道重塑。     

CpG寡聚脱氧核苷酸抑制肾癌细胞增殖及肿瘤生长的体内外实验研究

目的 研究CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG ODN）在体内外对肾癌细胞增殖及肿瘤生长的抑制作用,并探讨其可能的作用机制.方法 采用CCK-8法检测不同浓度CpG ODN1826和non-CpG ODN1982（ODN1982）干预对体外培养人肾透明细胞癌Caki-1细胞增殖的影响.24只BALB/c裸鼠皮下接种Caki-1细胞建立荷瘤裸鼠模型,4 d后根据每周1次的治疗方式随机分为对照组（PBS）、ODN1982组（50μgODN1982）、小剂量CpG ODN1826组（25 μg CpG ODN1826）和大剂量CpG ODN1826组（50 μg CpGODN1826）,每组6只.于建模后35 d处死动物,比较各组荷瘤裸鼠的肿瘤体积、质量及肿瘤组织学改变;体外分离各组荷瘤裸鼠脾淋巴细胞,乳酸脱氢酶释放法检测不同靶标比例（脾淋巴细胞：Caki-1细胞或脾淋巴细胞：小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞）的荷瘤裸鼠脾淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性.结果 ODN1982对Caki-1细胞的体外增殖活性无显著影响;500μg/mL CpGODN1826干预可显著抑制Caki-1细胞增殖.至实验终止时点,小剂量和大剂量CpG ODN1826组荷瘤裸鼠的肿瘤体积显著小于ODN1982组和对照组（P＜0.05）;各组间肿瘤质量比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）;组织学观察显示,小剂量和大剂量CpG 0DN1826组肿瘤组织较多炎性细胞浸润.当靶标比例为50∶1时,大剂量CpG ODN1826组裸鼠脾淋巴细胞对Caki-1细胞和YAC-1细胞的杀伤活性分别为（9.74±1.16）%和（79.65±5.23）%,显著高于对照组的（7.67±0.22）%和（10.12±3.03）%及ODN1982组的（7.66±0.93）%和（27.60±9.83）%（P＜0.05）.结论 CpG ODN对体外肾癌细胞增殖及荷瘤裸鼠肿瘤组织生长均具有明显抑制作用,其机制可能与CpG ODN增强荷瘤裸鼠的固有免疫应答有关.     

多种属CpG ODN诱导特异性抗体反应的研究

目的 探讨人工合成的CpG ODN对不同物种的免疫刺激活性,开发具有广谱免疫刺激活性的CpG ODN.方法 将特定的CpG ODN单独或与不同的抗原联合分别免疫鸡和小鼠,用ELISA检测不同时间鸡和小鼠特异性抗体的滴度.结果 CpG ODN均能诱导鸡和小鼠产生抗原特异性抗体,且抗体水平明显高于对照组(P＜0.05).结论 这种CpG ODN在一定程度上具有广谱免疫刺激特性.     

CpG寡聚脱氧核苷酸在灵长类动物中免疫调节活性的研究进展

包含CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(ODN)具有类似于微生物DNA激活内在免疫系统的能力，可提高适应性免疫力而抑制传染性生物的早期传播。CpG ODN在疫苗佐剂的设计以及哮喘、过敏、传染病和癌症的治疗中显示出良好的应用前景。由于CpG识别体系在进化中出现的种间差异，在啮齿类动物中表现出最强活性的CpG ODN却无法有效地刺激灵长类动物产生免疫应答。已有大量证据表明CpG ODN在小鼠中具有治疗活性，而其在灵长类动物中作用的研究仍需继续深入。现就作用于灵长类动物的CpG ODN的分类、作用机制和其作为疫苗佐剂与免疫保护剂以及在癌症、过敏和哮喘等多种疾病治疗上的应用研究进行综述。     

ISA720与CpG联合佐剂增强恶性疟原虫抗原的免疫原性

目的评价CpG佐剂对以PfCP-2．9f/ISA720佐剂为基础的联合疟疾抗原的免疫原性。方法使用ISA720及ISA720＋CpG佐剂与恶性疟原虫抗原制备制剂,免疫BALB／c小鼠,考察不同佐剂增强免疫的效果。通过检测免疫血清中特异性IgG的水平、识别天然抗原的能力、分析特异性IgG的亚类分布等指标进行评价。结果CpG佐剂显著提升了联合疟疾抗原在BALB／c小鼠中产生特异性抗体的量（P〈0．01）,免疫血清能有效识别红内期疟原虫天然抗原,IFA滴度显著提高（P〈0．01）,IgG亚类分析显示该佐剂能有效刺激小鼠产生针对PfCP-2．9和Pfclet-3的多种IgG亚类抗体。结论CpG显著提高了联合疟疾抗原的免疫原性。     

CpG寡核苷酸对C57BL/6小鼠肝癌模型影响的初步研究

目的建立C57BL/6小鼠肝癌模型并研究CpG寡核苷酸（ODN）对C57BL/6小鼠肝癌模型的治疗效果。方法用HE染色鉴定C57BL/6小鼠肝癌模型。肝癌模型建立后,分别用PBS及CpG寡核苷酸处理C57BL/6小鼠肝癌模型,并用FCM检测小鼠脾脏CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、NK1.1-FITC的组成,ELISA法测免疫小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平。结果成功建立C57BL/6小鼠肝癌模型,ODN处理组的肝癌细胞裂解物中CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、NK1.1-FITC的体外杀伤活性以及荷瘤小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平均显著高于PBS组。结论 CpG ODN能够提高小鼠对肝癌的免疫功能,尤其是特异性细胞免疫功能     

日本血吸虫重组Bb疫苗不同途径免疫BALB/c小鼠不同时间诱导的免疫应答作用

目的: 探讨日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(rBb)疫苗不同途径免疫BALB/c小鼠后不同时间诱导的免疫应答作用,阐明该疫苗的免疫应答机制。方法: 将88只BALB/c小鼠随机分为2组,每组44只,分别经皮下注射(皮下注射组,SC组)和鼻腔黏膜(鼻腔黏膜接种组,IN组)接种免疫小鼠,在免疫后0~20周每2周每组随机取4只小鼠,无菌取脾,制备悬浮脾细胞,采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测脾细胞增殖活性,流式细胞仪(FACsort)检测T细胞亚群和脾细胞凋亡率,双抗体夹心ELISA法检测脾细胞上清液中干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素10(IL-10)和白细胞介素17(IL-17)的动态变化。结果: 与免疫0周时比较,SC组小鼠脾细胞增殖活性于免疫后8周达到峰值(P<0.05),IN组小鼠于免疫后4周达到峰值(P<0.05)。与免疫0周时比较,SC组和IN组小鼠CD4⁺T细胞均于免疫后8周达到峰值(P<0.05);CD8⁺T细胞分别于8周和6周达到峰值,但差异无统计学意义(P>0.05)。与免疫0周时比较,2组小鼠脾细胞上清液中IFN-γ水平均于免疫后2周达到峰值(P<0.05),SC组和IN组IL-17水平分别于免疫后14和12周达到峰值(P<0.05)。与免疫0周时比较,SC组小鼠脾细胞凋亡率于免疫后2周达到峰值(P<0.05),IN组于4周达到峰值(P<0.05)。IN组与SC组小鼠各检测指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论: 经皮下注射和鼻腔黏膜途径接种的日本血吸虫重组Bb疫苗早期即可诱导小鼠产生有效的免疫应答,以Th1型免疫应答为主,2种免疫途径所诱导的免疫应答无明显差异。     

热休克蛋白65-MUC1融合蛋白对小鼠干扰素γ产生细胞的诱生作用

目的：研究热休克蛋白65-MUC1（HSP65-MUC1）融合蛋白对小鼠免疫细胞的激活作用。 方法：用HSP65-MUC1融合蛋白免疫C57BL/6小鼠3次后,取脾脏和淋巴结,分离淋巴细胞,体外用HSP65-MUC1融合蛋白、MUC1肽或非特异性刺激剂如CpG ODN和ConA进行刺激,采用酶联免疫斑点法（enzyme linked immunospot, ELISPOT）检测免疫细胞分泌干扰素γ的情况。 结果：HSP65-MUC1融合蛋白免疫后小鼠的淋巴细胞在特异性或非特异性抗原刺激下所分泌的干扰素γ比PBS组明显增多。 结论：HSP65-MUC1融合蛋白对小鼠干扰素γ产生细胞有很强的诱生作用。     

结核杆菌多价核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

目的构建包含结核杆菌3种抗原蛋白Ag85A、ESAT-6和CFP-10真核表达质粒的多价DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法PCR扩增获得结核杆菌ag85 a、esat-6和cfp-10基因片段,分别克隆入真核表达质粒VR1020的BamHⅠ位点构建DNA疫苗,以此多价DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内的特异性抗体应答和细胞免疫反应,并与BCG免疫组、质粒VR1020免疫组和生理盐水对照组相比较。结果多价DNA疫苗免疫小鼠后能产生特异性的细胞和体液免疫应答,DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞IFN-γ的表达量显著高于BCG免疫组,而DNA疫苗免疫组小鼠所产生的特异性抗体水平低于BCG免疫组。结论成功构建了结核杆菌多价DNA疫苗,免疫小鼠后检测到特异性细胞和体液免疫应答。     

Th1反应及γ-干扰素在幽门螺杆菌疫苗免疫保护中的作用

目的　探讨磷酸胞苷酰寡核苷酸 (CpG ODN)作为幽门螺杆菌 (Hp)疫苗佐剂的作用及Th1反应与γ 干扰素 (γ IFN)在免疫保护作用中的角色。方法　以Hp全菌超声粉碎物 (WCS)为抗原 ,CpG ODN为佐剂经鼻道或口服免疫小鼠 ,采用 5× 10 6CFU和 5× 10 8CFUHp两个菌量攻击小鼠 ,2周及 8周处死小鼠鉴定感染及炎症情况 ,收集小鼠血清、唾液、胃液 ,ELISA法检测血清中IgG、IgG1、IgG2a及IgA水平和唾液、胃液中IgA水平。流式细胞术检测脾细胞内CD+ 4 和CD+ 8T细胞分泌γ IFN和白细胞介素 4 (IL 4 )的水平。结果　当细菌攻击量由 5× 10 8Hp降至 5× 10 6Hp时 ,滴鼻WCS/CpG组保护率由 70 %提高至 90 % ,无免疫对照组的感染率也由 10 0 %降至 80 %。细菌攻击后2周及 8周时 ,滴鼻WCS/CpG ODN组的血清IgG和IgG2a均高于对照组 (P <0 0 5 ) ;CD+ 4 细胞和CD+ 8细胞中的γ IFN水平也均高于其他各组 (P <0 0 5 )。结论　CpG ODN可作为Hp疫苗佐剂成分 ,其免疫保护作用与Th1反应和γ IFN相关。