改进的PCR在抑癌基因启动子CpG岛甲基化检测中的应用

目的改进聚合酶链反应(PCR),并检验改进后的方法在甲基化检测中的可行性。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,提取基因组DNA,利用亚硫酸氢盐测序法,用常规、降落及改进PCR分别扩增,比较扩增效果,PCR产物纯化回收后,TA克隆入载体pGEM-T,转化大肠杆菌(E.coliDH5α),筛选阳性克隆,经PCR扩增鉴定后获得阳性重组质粒,测序比对。结果改进后PCR与常规、降落PCR相比,扩增效率增高,二聚体及非特异性扩增减少;测序结果显示,MCF-7细胞基因组DNA中,RASSF lA基因启动子CpG岛是高甲基化的,E-cadherin基因启动子CpG岛未呈现高甲基化状态。结论改进后方法提高了以PCR为基础的甲基化分析的可行性,更适用于基因甲基化状态的检测,并为扩增富含CG的基因启动子区域提供参考。     

改进的PCR在抑癌基因启动子CpG岛甲基化检测中的应用

目的改进聚合酶链反应（PCR），并检验改进后的方法在甲基化检测中的可行性。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7，提取基因组DNA，利用亚硫酸氢盐测序法，用常规、降落及改进PCR分别扩增，比较扩增效果，PCR产物纯化回收后，TA克隆入载体pGEM-T，转化大肠杆菌（E．coli DH5α），筛选阳性克降，经PCR扩增鉴定后获得阳性重组质粒，测序比对。结果改进后PCR与常规、降落PCR相比，扩增效率增高，二聚体及非特异性扩增减少；测序结果显示，MCF-7细胞基因组DNA中，RASSFIA基因启动子CpG岛是高甲基化的，E-cadherin基因启动子CpG岛末呈现高甲基化状态。结论改进后方法提高了以PCR为基础的甲基化分析的可行性，更适用于基因甲基化状态的检测，并为扩增富含CG的基因启动子区域提供参考。     

脐血CD34＋细胞和外周血单个核细胞中HOXB4基因表达及其启动子区CpG岛甲基化状态的研究

本研究旨在通过检测脐血CD34＋细胞和正常人外周血单个核细胞（PBMNC）中HOXB4基因表达水平及其启动子区CpG岛的甲基化水平,初步探讨造血系统中HOXB4基因的表达水平与其启动子区甲基化的相关性。采用半定量RT—PCR检测脐血CD34＋细胞和PBMNC中HOXB4基因的表达,应用亚硫酸氢盐测序法检测这两种细胞中HOXB4基因启动子区CpG岛的甲基化位点。结果发现,CD34＋细胞高表达HOXB4,HOXB4基因启动子区CpG岛未发生甲基化;PBMNc不表达HOXB4,HOXB4基因启动子区在ATG上游-129bp的C碱基发生甲基化。结论：HOXB4基因启动子甲基化程度是其基因表达水平的负性调节机制之一。HOXIM在CD34＋细胞中的高表达与其基因启动子低甲基化有关,而HOXB4在PBMNC中的基因沉默则可能与其启动子区的甲基化密切相关。初步筛选出的HOXB4基因启动子区CpG岛甲基化位点,为后续研究奠定了基础,也为扩增造血祖细胞提供一条新途径。     

DNA甲基化调控K562细胞系kir3dl1基因表达

为分析kir3dl1基因启动子区的甲基化模式及其与基因表达的关系，探讨kir3dl1基因的表达调控机制，采用亚硫酸氢盐测序法检测K562细胞中kir3dl1基因启动子区的甲基化状况，应用甲基化抑制剂5．氮胞苷处理K562细胞以诱导CpG岛去甲基化，观察启动子区CpG岛甲基化与kir3dl1基因表达的关系。结果显示：K562细胞中kir3dl1基因核心启动子区CpG二核苷酸甲基化频率在20％-100％之间；K562细胞中kir3dl1基因启动子序列在转录因子E2F可能的结合位点上存在1个碱基的突变，并形成1个新的被甲基化的CpG二核苷酸；应用甲基化抑制剂5．氮胞苷可以诱导不表达kir3dl1基因的K562细胞重新表达该基因。结论：K562细胞中kir3dl1基因表达受启动子甲基化调控，对转录因子E2F的深入研究有助于了解其在kir3dl1基因表达调控中可能的作用。     

亚硫酸氢盐测序法DNA甲基化标记筛查技术的改进研究

目的 改进DNA亚硫酸氢盐测序法(bisulfite genomic sequencing,BGS),建立一种简便快速的甲基化标记筛查技术.方法 基因组DNA在亚硫酸氢盐处理、脱盐纯化后直接进入碱性的PCR体系,通过延长预变性时间完成修饰过程,然后进行常规亚硫酸氢盐PCR(bisulfite-PCR,BSP)扩增;首轮扩增产物再用5'端加有高GC标签序列的引物进行2次扩增,达到调整GC含量和直接测序的目的 .同时用传统和改进BGS法检测3T3-L1细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因和Hela细胞雄激素受体基因启动子的甲基化情况,以评估改进方案的可行性.并用Alu序列实时定量BSP技术比较传统和改进BGS法的灵敏度.结果 无论是高甲基化还是低甲基化片段,改进的BGS法均可实现BSP产物的直接测序,结果与传统法一致.改进法修饰的DNA转化率达到100%,特异度＞93.75%,灵敏度显著高于传统方法(t=2.978 2,P＜0.05),并有良好的重复性.结论 改进后的BGS方法简单灵敏,可用于甲基化标记的快速筛查.     

重亚硫酸氢盐测序法检测Wnt信号通路抑制基因在急性早幼粒细胞白血病细胞中甲基化变化

目的:应用重亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测急性早幼粒细胞白血病细胞株(NB4)Wnt信号通路抑制基因启动子区CPG岛的甲基化状态,筛选NB4细胞中高甲基化的Wnt信号通路抑制基因,并探讨BSP法作为定量研究基因甲基化方法的优缺点。方法:以NB4细胞为研究对象,20例健康人单个核细胞为对照;常规提取DNA并用亚硫酸氢盐处理,然后用PCR扩增目标序列,应用重亚硫酸氢盐测序法(BSP)分析在NB4细胞中Wnt信号通路抑制基因基因的甲基化状态。并通过与甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,M SP)、焦磷酸测序技术(pyrosequencing)比较、评价BSP法检测NB4细胞Wnt信号通路抑制基因甲基化状态的优缺点。结果:BSP产物克隆测序检测NB4细胞Wnt信号通路抑制基因甲基化发生率分别为:WIF-1基因95.26%,DKK3基因86%,SFRP1基因81.67%,SFRP2基因95.71%,SFRP4基因85%,SFRP5基因95%;20例健康人单个核细胞为对照组中Wnt信号通路抑制基因甲基化发生率分别为:WIF-1基因1.5%,DKK3基因4.2%,SFRP1基因0%,SFRP2基因0.9%,SFRP4基因2.5%,SFRP5基因1.75%。与正常人M NC相比,NB4细胞的Wnt信号通路相关抑制基因启动子甲基化率明显增高。结论:急性早幼粒细胞株NB4细胞中存在Wnt信号通路多个抑制基因高甲基化状态。此类基因异常甲基化有可能成为急性早幼粒细胞白血病的早期诊断指标和治疗靶点。     

直接测序与克隆测序检测不育男性H19基因甲基化印记的比较

目的 建立亚硫酸氢盐修饰后测序技术,比较直接测序与克隆测序在不育男性精子印记基因DNA甲基化状态检测中的差别.方法 对样本进行精液分析和精子形态学分析,密度梯度离心法制备精液.提取精液基因组DNA并行亚硫酸氢盐处理,行半巢式PCR,将纯化后PCR产物与pCR 2.1-TOPO 载体连接及转化,分别对PCR产物及阳性克隆菌液进行测序.结果 PCR产物直接测序,前半部分序列丢失约40bp,1号CpG位点甲基化状态信息丢失.每例标本只有-个测序结果,会出现CpG位点的部分甲基化状态.挑取15个克隆进行测序,序列无丢失,18个CpG位点甲基化状态信息均完整.15个克隆CpG位点甲基化状态有所不同,显示出此样本的平均甲基化状态.结论 克隆测序不会造成序列丢失,CpG位点甲基化状态信息完整,克隆测序能较好地反应样本的平均甲基化状态.     

去甲基化处理对NK-92MI细胞系抑制性受体KIR表达的影响

为分析NK细胞系NK-92MI细胞中抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killercellimmnoglobulin-likere—ceptor,KIR）的基因启动子区的甲基化模式及去甲基化处理对基因表达的影响,探讨基因kir可能的表达调控机制,采用亚硫酸氢盐测序法检测NK-92MI细胞kir2DL1和kir2DL2／2DL3基因启动予区的甲基化水平,应用甲基化抑制剂5-氮胞苷处理NK-92MI细胞以诱导CpG岛去甲基化,RT—PCR方法检测其基因表达。结果显示：kir2DL1和kir2DL2／2DL3基因启动子区CpG二核苷酸甲基化频率依次在25％-88％、5％-80％之间;应用甲基化抑制剂5-氮胞苷可以诱导NK-92MI细胞重新表达kir2DL1基因,并使kir2DL1、kir2DL2和kir2DL3基因表达量增加。结论：启动子甲基化参与调控NK-92MI细胞基因kir表达。     

MLXIPL、PMVK、TRIB3基因启动子区甲基化检测方法的建立

目的建立基因MLXIPL、PMVK、TRIB3启动子区DNA甲基化检测的方法。方法用亚硫酸氢钠和对苯二酚处理外周血细胞基因组DNA标本,以修饰后的DNA标本为模板,每个基因分别用内外侧两套不同的引物对启动子区进行巢式扩增。PCR产物进一步克隆、测序。结果测序结果表明,MLXIPL、PMVK、TRIB3启动子区基因中的非甲基化的C碱基转变为T碱基,而CpG岛被甲基化的C碱基则不改变。结论成功地建立了MLXIPL、PMVK、TRIB3基因甲基化检测的方法,为探索基因启动子区甲基化与疾病的关系做出了铺垫。     

巢式MSP法检测恶性血液病细胞株p16基因启动子甲基化状态的研究

本研究应用改进的甲基化特异性PCR（MSP）法，即巢式甲基化特异性PCR法检测6种肿瘤细胞株p16基因启动子的甲基化状态效率，探讨其在筛选p16基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株，及将其作为研究基因甲基化与表达关系的理想细胞模型中的应用。6种肿瘤细胞株基因组DNA经碱变性后以亚硫酸盐修饰，再用巢式甲基化特异性聚合酶链反应扩增，分析检测其p16启动子区CpG岛的甲基化状态。结果表明：CA46、U266都有不同程度的p16基因启动子区甲基化，而Molt4、K562、HL-60、Jurkat的p16基因启动子区均未甲基化。结论：用巢式甲基化特异性PCR可以准确的检测出恶性血液病细胞株p16基因的甲基化状态，方法简单，灵敏且重复性强，可以广泛用于筛选各种p16基因启动子区甲基化的恶性血液病细胞株以及恶性血液病诊断。     

Colorimetric silver detection of methylation using DNA microarray coupled with linker-PCR

BACKGROUND: Aberrant DNA methylation of CpG site is among the earliest and most frequent alterations in cancer. Detection of promoter hypermethylation of cancer-related genes may be useful for cancer diagnosis or the detection of recurrence. Recently, several DNA microarray methods have been developed to detect the methylation status of the multiple genes. However, the microarrays are currently detected in fluorescence using a sophisticated laser-based scanner. These methods are limited by their lower sensitivity. METHODS: We present a sensitive colorimetric silver method coupled with linker-PCR to detect methylation status of four genes, including p16, E-cadherin, VHL, and hMLH1. The signal generated with this method results from the precipitation of silver onto nanogold particles bound to streptavidin used to detect biotinylated DNA. RESULTS: We show that p16, E-cadherin, VHL, and hMLH1 were all methylated in the positive control. However, no methylation was found in these genes for the negative control. P16 gene was only methylated in the sample, whereas others were not methylated. Furthermore, as little as 0.1 fmol of target DNA amplicons could be detected on the arrays. The results were further validated by methylation-specific PCR (MSP) and bisulfite DNA sequencing. CONCLUSIONS: The colorimetric silver detection of DNA microarray could be used as an inexpensive, useful, and sensitive tool to detect methylation status of the multiple genes in the future.     

重型β地中海贫血γ珠蛋白基因启动子区甲基化状态

本研究旨在通过对广西省重型β地中海贫血患者和正常人外周血中γ珠蛋白基因启动子区CpG岛的甲基化位点的确认和对各个CpG位点甲基化率在重型β地中海贫血患者与正常人之间的差异性分析,初步筛选出可能影响γ珠蛋白表达的主要甲基化位点。采用重亚硫酸盐测序法修饰,递降PCR扩增,最后对PCR产物进行DNA克隆测序,得到目的片段中每个CG位点的甲基化情况,定量检测甲基化的确切位置与程度。结果表明:重型β地中海贫血患者与正常人γ珠蛋白基因启动子区存在4个CpG甲基化位点,在序列中分别位于28、122、231和234bp,均呈高度甲基化,其中122和231 bp位点甲基化率明显低于正常对照组,差异均有统计学意义。28和234 bp位点甲基化率与正常对照组均无显著性差异。结论:证实γ基因启动子区存在甲基化位点、明确位点位置且经定量分析证实无论地中海贫血患者还是正常人各个甲基化位点均呈高甲基化状态;初步筛选出影响γ珠蛋白表达的主要位点可能在122和231 bp,为后续通过调节γ珠蛋白的表达缓解重型β地中海贫血的临床症状、靶向基因治疗研究提供了实验依据。     

急性髓系白血病E-cadherin基因表达和CpG岛甲基化状态的研究

目的 探讨急性髓系白血病（AML）患者中上皮钙黏附素（E-cadherin）基因表达及其甲基化状态。方法 分别用RT-PCR和流式细胞术方法检测55例AML患者骨髓细胞和7份正常对照骨髓细胞中E—cadherin基凶和蛋白的表达，并用甲基化特异性PCR方法分析E—cadherin基因5’端CpG岛的甲基化状况。结果 55例AML患者骨髓细胞中E-cadherinmRNA和蛋白表达阳性率分别为23．6％和18．2％，较正常对照组明显下调（P值均〈0．01）；E—cadherin基因5’端甲基化的阳性率为69．1％。E-cadherin mRNA和蛋白表达阴性的31例患者中，29例（93．5％）E—cadherin甲基化阳性，其蛋白水平和mRNA表达水平与启动子甲基化呈明显负相关（P〈0．01）。7份正常对照骨髓细胞E—cadherin mRNA和蛋白表达均为阳性，E—eadherin基因的CpG岛无明显甲基化。结论 AML的粒系分化成熟障碍可能与E—cadherin基因表达下调有关。5’端CpG岛的甲基化可能影响E-cadherin基因表达。     

MS-FLAG, a novel real-time signal generation method for methylation-specific PCR

BACKGROUND: Aberrant promoter methylation is a major mechanism for silencing tumor suppressor genes in cancer. Detection of hypermethylation is used as a molecular marker for early cancer diagnosis, as a prognostic index, or to define therapeutic targets for reversion of aberrant methylation. We report on a novel signal generation technology for real-time PCR to detect gene promoter methylation. METHODS: FLAG (fluorescent amplicon generation) is a homogeneous signal generation technology based on the exceptionally thermostable endonuclease PspGI. FLAG provides real-time signal generation during PCR by PspGI-mediated cleavage of quenched fluorophores at the 5' end of double-stranded PCR products. Methylation-specific PCR (MSP) applied on bisulfite-treated DNA was adapted to a real-time format (methylation-specific FLAG; MS-FLAG) for quantifying methylation in the promoter of CDKN2A (p16), GATA5, and RASSF1. We validated MS-FLAG on plasmids and genomic DNA with known methylation status and applied it to detection of methylation in a limited number of clinical samples. We also conducted bisulfite sequencing on these samples. RESULTS: Real-time PCR results obtained via MS-FLAG agreed with results obtained via conventional, gel-based MSP. The new technology showed high specificity, sensitivity (2-3 plasmid copies), and selectivity (0.01% of methylated DNA) on control samples. It enabled correct prediction of the methylation status of all 3 gene promoters in 21 lung adenocarcinoma samples, as confirmed by bisulfite sequencing. We also developed a multiplex MS-FLAG assay for GATA5 and RASSF1 promoters. CONCLUSION: MS-FLAG provides a new, quantitative, high-throughput method for detecting gene promoter methylation and is a convenient alternative to agarose gel-based MSP for screening methylation. In addition to methylation, FLAG-based real-time signal generation may have broad applications in DNA diagnostics.     

Microarray-based method to analyze methylation status of E-cadherin gene in leukemia

BACKGROUND: Aberrant DNA methylation of the CpG sites of the tumor suppressor gene is closely associated with carcinogenesis. Recently, several studies have indicated the aberrant methylation of E-cadherin gene could be a potential marker for leukemic patients. METHOD: We used bisulfite-modified DNA as a template for PCR amplification, resulting in conversion of unmethylated, but not methylated, cytosine into thymine within CpG islands of interest. The amplified product containing a pool of DNA fragments with altered nucleotide sequences was then hybridized with an oligonucleotide-based microarray. Five sets of oligonucleotide probes were designed to detect the methylation patterns of E-cadherin gene CpG islands in leukemia samples. The results were further validated by methylation-specific PCR (MSP). RESULTS: We found that all leukemia samples were methylated at different levels within the target sequences. The specific regions (the CpG sites #16-19 and #20-22) were revealed as hotspots for methylation in leukemic patients. These results showed that the microarray assay could successfully detect methylation changes of E-cadherin gene in leukemia quantitatively. CONCLUSION: The oligonucleotide-based microarray can be a quick and reliable tool to map methylation status in CpG islands. This established microarray could be potentially useful for clinical researches and diagnosis.     

膀胱癌组织中上皮细胞钙依粘连蛋白基因启动子区CpG岛甲基化状态的分析

目的　探讨膀胱癌中肿瘤抑制基因上皮细胞钙依粘连蛋白(E cadherin)启动子区CpG岛的甲基化状 态及其与mRNA表达的关系。方法　收集30例新鲜的膀胱癌组织及其癌周正常组织;采用甲基化特异聚合酶 链反应(MSP)检测E cadherin基因启动子区CpG岛的甲基化状态;采用逆转录PCR检测E cadherin基因的mR NA表达。结果　E cadherin基因在膀胱癌组织中的甲基化阳性率(43.3%)显著高于在癌周正常组织中的甲基 化阳性率(6.7%,P<0.01);在复发性膀胱癌中的甲基化阳性率(64.7%)显著高于在原发性膀胱癌中的甲基化 阳性率(15.4%,P<0.05);在不同分级、分期膀胱癌中的差异无显著性。13例异常甲基化的膀胱癌组织中有10 例未检测到CDH1mRNA的表达,而13例未甲基化膀胱癌组织中有2例未检测到,二者差异有显著性(P< 0.01)。结论　E cadherin在膀胱癌组织中有一定程度的过甲基化,但与膀胱癌的临床分期和病理分级无显著相 关性,提示其可能参与了膀胱癌的发生;E cadherin基因CpG岛的过甲基化可能成为判断膀胱癌复发的指标之 一;E cadherin基因CpG岛的过甲基化可能是造成E cadherinmRNA不表达的原因之一。     

儿童急性淋巴细胞白血病AKAP12启动子区域异常甲基化

目的探讨儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）中A激酶锚定蛋白12（AKAP12）基因启动子区域CpG岛异常甲基化情况及其与临床病理参数之间的关系。方法用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测儿童ALL患者骨髓和对照骨髓以及淋巴细胞白血病细胞株6T—CEM中AKAP12基因启动子区域CpG岛甲基化状态，并采用亚硫酸盐测序法检测启动子区域发生甲基化的频率。采用荧光定量逆转录PCR（FQ—RT—PCR）检测6T—CEM中，经过甲基化酶抑制剂（5-Aza—CdR）处理后，AKAP12恢复表达的情况。结果32例ALL患者MSP结果显示AKAP12基因甲基化比率为62．5％（20／32），但与患者的临床病理学参数均无显著相关。经过5-Aza-CdR处理后，可使6T-CEM中AKAP12恢复表达，且表达强度与剂量成正比。结论AKAP12基因启动子的异常甲基化与ALL的发生有密切的联系，AKAP12基因启动子甲基化有望成为一个诊断ALL的分子标志物。