α晶体蛋白对视网膜神经节细胞作用的初步研究

目的 探讨α晶体蛋白对体外培养视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的作用.方法 原代培养RGCs,Thy1.1免疫荧光法鉴定RGCs并进行纯度检测,10-7、10-6、10-5、10-4 g/L α晶体蛋白加入后于1、3、12 h、1、2 d和3 d在相差倒置显微镜下观察RGCs形态学变化;计数突起数目和轴突长度;应用免疫荧光及激光共聚焦扫描技术观察实验组α晶体蛋白在体外培养RGCs上的定位并进行荧光强度半定量分析.结果 Thy1.1鉴定RGCs纯度为90%～95%,RGCs 10-4、10-5 g/L组突起数目及轴突长度显著大于对照组,以10-4 g/L组变化最显著.免疫荧光结果显示10-4 g/Lα晶体蛋白组RGCs与α晶体蛋白抗体呈阳性结合,并呈先升高后降低趋势.结论 α晶体蛋白能够促进RGCs生长,最佳浓度为10-4 g/L,细胞膜上抗体结合阳性,表明α晶体蛋白可与RGCs膜结合,这在α晶体蛋白促进RGCs存活和轴突再生的反应中可能起重要作用.     

α-晶体蛋白干预大鼠RGCs过氧化损伤作用实验研究

目的 观察α-晶体蛋白（α-crystallin）在过氧化氢（H2O2）损伤大鼠视网膜神经节细胞（retina ganglion cells,RGCs）中的影响并探讨其机制.方法 原代培养大鼠RGCs并用Thy1.1鉴定,α-crystallin组加入α-晶体蛋白（10^-4、10^-5、10^-6g/L）预处理2h,然后加入H2O2（终浓度为0.5mmol/L）进行损伤实验,观察3、12、24h细胞形态学变化、轴突长度和突起数目的变化及细胞凋亡发生,检测RGCs培养上清液中相关酶（超氧化物歧化酶/SOD、谷胱甘肽过氧化物酶/GSH Px和过氧化氢酶/CAT、乳酸脱氢酶/LDH）活性及丙二醛/MDA水平的变化.Fluo-3/AM荧光比值成像技术测定RGCs胞浆游离钙离子水平.结果 单纯损伤组RGCs存活率与SOD、CAT、GSH Px活性随损伤时间延长显著降低,LDH活性和MDA含量升高;α-crystallin组RGCs存活率与SOD、CAT、GSH Px活性升高,LDH、MDA生成减少,其变化呈浓度依赖性.α-crystallin组RGCs突起断裂程度明显少于单纯损伤组.单纯损伤组24h DNA电泳出现明显凋亡梯形带,α-crystallin低浓度组出现较弱凋亡带.单纯损伤组RGCs钙离子荧光强度急剧升高,12h达平台期.α-crystallin组钙离子变化随α-crystallin浓度增高而减弱.结论 α-晶体蛋白能够减轻H2O2介导的RGCs自由基损伤效应,其机制与抑制RGCs钙离子内流、升高RGCs抗氧化酶活性有关.     

RGCs缺氧条件下钙离子水平动态变化及与TNF-α及脂质过氧化反应的关系研究

目的 探讨体外培养大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs),在缺氧条件下细胞质内游离钙离子水平动态变化规律及与培养液中TNF-α含量及脂质过氧化反应的关系.方法 正常对照组RGCs在常规条件下培养、缺氧组在1%氧浓度下培养1、3、12、24 h.采用激光扫描共聚焦技术检测RGCs细胞质游离钙离子水平、黄嘌呤氧化酶法和硫代戊巴比妥酸法检测培养液SOD活性和MDA含量、TNF-α水平检测采用酶标双抗夹心免疫吸附法(ELISA).结果 正常对照组RGCs细胞质钙离子水平无显著变化,缺氧组RGCs细胞质内游离钙离子荧光强度急剧升高,缺氧12 h达平台期,较正常对照组显著升高(P＜0.01).缺氧组细胞培养液SOD活性随缺氧时间延长显著降低,MDA含量及TNF-α含量显著升高(P＜0.01).结论 体外培养RGCs在缺氧条件下其细胞细胞质内游离钙离子水平呈上升趋势,其表达变化与缺氧时培养液中脂质过氧化反应逐渐增强、TNF-α水平上升及RGCs抗氧化能力降低有关.     

α-crystallin与多种细胞作用的免疫荧光观察

目的 在α-crystallin(α晶体蛋白)对RGCs保护性作用研究并进行定位研究的基础上,对α-crystallin与其他细胞之间的作用相比较,以期揭示α-crystallin与RGCs作用的本质.方法 原代培养大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)、大鼠巨噬细胞、大鼠心肌细胞以及传代培养的ECV细胞株、293细胞细胞株、猪视网膜色素上皮细胞(RPE).应用免疫荧光结合激光共聚焦技术观察α-crystallin与多种细胞的作用.结果 免疫荧光结合激光共聚焦发现α晶体蛋白在3种细胞中有阳性免疫沉积物出现在细胞膜上,其对照组阴性;3种细胞见实验组和对照组均有阳性免疫沉积物出现在细胞浆、细胞核中.结论 α晶体蛋白不是特异性与RGCs发生作用,它是广泛存在的生物学效应物质.α晶体蛋白具有sHSP的抗应激损伤特性,对于不表达内源性α晶体蛋白的同时又是抗损伤能力较弱的RGCs,可通过增加外源性α晶体蛋白达到有效保护RGCs的目的 .     

次声对α-晶体蛋白分子伴侣活性的影响

目的　探讨次声对 α-晶体蛋白分子伴侣活性的影响 .方法　采用 Sephacryl S- 30 0凝胶柱分离牛α-晶体蛋白 .应用次声压力舱 ,以 16 Hz,130 d B次声作用 αL-晶体蛋白溶液 (g· L- 1 ) ,每天作用 2 h,连续 16 d.分光光度计检测 36 0nm时αL-晶体蛋白对加热诱导过氧化氢酶 (CAT)和βL-晶体蛋白凝聚的保护作用 .孵育 6 0 min,以 αL-晶体蛋白占对照靶蛋白光散射值的百分比表示α-晶体蛋白分子伴侣功能 .结果　与对照蛋白比较 ,α-晶体蛋白具有特异性保护 CAT和 βL-晶体蛋白热凝聚的作用 .次声作用第 16日 ,对照组 αL-晶体蛋白保护 βL-晶体蛋白热凝聚的作用为 (92 .0± 3.1) % ,次声组为 (81.2± 5 .4 ) % ,降低约 10 .8% (P<0 .0 1) ;对照组 αL-晶体蛋白保护 CAT热凝聚的作用为 (73.8± 5 .1) % ,次声组为(6 1.8± 9.1) % ,降低约 12 .0 % (P<0 .0 1) .结论　次声可影响α-晶体蛋白的分子伴侣活性     

人眼α-晶体蛋白分子伴娘活性的研究

目的 了解不同年龄人α-晶体蛋白分子伴娘活性,进一步探索α-晶体蛋白的分子伴娘活性与年龄相关性白内障形成间的关系。方法(1)用凝胶过滤法分别分离成年人及老年人水溶性晶体蛋白。在55℃高温条件,观察不同年龄人α-晶体蛋白对β-low晶体蛋白的凝集和变性的抑制程度差异。结果(1)两组不同年龄的人α-晶体蛋白对热诱导的β-low晶体蛋白的凝集和变性的抑制程度有差异,成年人α-晶体蛋白对热诱导的β-low晶体蛋白的凝集和变性的抑制作用比老年人α-晶体蛋白强。结论(1)随着年龄的增加,人α-晶体蛋白的分子伴娘活性呈下降趋势。     

α-晶体蛋白对抗氧化酶失活的保护

目的 研究α－晶体蛋白的分子伴侣特性。方法 采用ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００ＨＲ凝胶性分离纯化牛α－晶体蛋白。应用分光光度计检测超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和过氧化氢酶（ＣＡＴ）的活性,以酶失活后保留的酶活性占其对照组活性的百分比表示α－晶体蛋白的伴侣作用。结果 糖与酶的孵育导致时间依赖性的ＳＯＤ和ＣＡＴ失活。果糠和核糖比６－磷酸葡萄糖和葡萄糖具有糖基化诱导ＳＯＤ和ＣＡＴ的快速失活效应。α－晶体蛋白与     

αA晶体蛋白基因启动子与HSP70融合基因对大鼠半乳糖性白内障的抑制作用

目的通过观察αA晶体蛋白基因启动子（αACP）与HSP70基因的融合基因表达载体（即pαACP-HSP70）对大鼠半乳糖性白内障的抑制作用,了解外源性HSP70在白内障发生发展中的作用。方法颈背部皮下注射D-半乳糖建立半乳糖性白内障大鼠模型;利用多价阳离子脂质体法包裹表达质粒,球后注射质粒到半乳糖性白内障大鼠眼部。裂隙灯观察大鼠晶状体混浊度的变化。通过荧光显微镜直接观察绿色荧光蛋白基因（EGFP）的表达。结果半乳糖＋α-70组、半乳糖＋HSP70组和半乳糖＋EGFP组均可直接观察到大鼠晶状体上皮细胞中有绿色荧光,且半乳糖＋α-70组荧光强度最强,与半乳糖＋HSP70组、半乳糖＋EGFP组有统计学意义（P〈0.05）,NS组与半乳糖＋NS组未见绿色荧光蛋白表达;半乳糖＋α-70组白内障出现的程度与同期的半乳糖＋NS组、半乳糖＋EGFP组及半乳糖＋HSP70组相比明显减轻（P〈0.05）,并且其所出现白内障的时间亦延迟（P〈0.05）。结论 pαACP-HSP70融合基因能在大鼠晶体上皮细胞内表达;外源HSP70可能起到延缓白内障发生和发展的作用。     

OPTN突变致RGCs自噬异常引起POAG的研究进展

原发性开角型青光眼(POAG)是一种常见的致盲性眼病,其发病机制复杂,与OPTN基因发生突变有关。其中与POAG相关的OPTN突变有H26D、E50K、M98K、E103D、691_692insAG、T202R、A336G、A377T、H486R、R545Q等。OPTN基因编码的Optineurin蛋白是重要的自噬受体,参与细胞自噬。研究发现OPTN基因某些突变可通过使视网膜神经节细胞(RGCs)自噬异常引起POAG。本文从OPTN突变与POAG、OPTN与其编码蛋白Optineurin、RGCs自噬与POAG、OPTN突变致RGCs自噬异常的相关基础研究等方面进行综述。     

RCS大鼠视网膜变性过程中α亚型神经节细胞树突形态学变化

目的研究皇家外科学院大鼠(royal college of surgeon rat,RCS)视网膜变性过程中α亚型视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)树突形态学变化规律。方法按照视网膜色素变性发展的不同阶段,选取出生后21、30、60、90d的RCS-P+大鼠(RCS组)与RCS-rdy+大鼠(对照组)各3只,采用DiI示踪标记方法观察RCS组α亚型视网膜神经节细胞的树突在视网膜变性过程中形态学变化的规律。结果RCS组各天龄间、对照组大鼠发育过程中各天龄间、RCS组与对照组相对应天龄段间一、二级分支数目之间比较无显著差异(P0.05)。RCS组大鼠视网膜变性过程中,α亚型RGCs树突一级分支直径60d组较21d组变细[(2.02±0.17)μmvs(2.66±0.11)μm,P0.01],RCS组与对照组大鼠α亚型RGCs树突一级分支直径比较,21d增粗[(2.66±0.11)μmvs(2.23±0.10)μm,P0.01]。RCS组90d(15.44±1.50)较21d(26.91±3.01)、30d(27.20±1.99)α亚型RGCs细胞树突分支频率显著减少(P0.01,P0.05)。对照组大鼠发育过程中α亚型RGCs树突分支频率比较,60d(28.67±2.78)较21d(16.09±1.71)、30d(17.75±1.79),90d(26.18±2.48)较21d组有显著增加(P0.01,P0.05),其余各组间没有明显差异(P0.05)。RCS组与对照组大鼠α亚型RGCs树突分支频率相对应21、30、60、90d组间比较均有显著差异(P0.05)。结论RCS大鼠视网膜色素变性过程中,视网膜α亚型RGCs树突分支频率在早期增多,但随着病变的发展到中、晚期树突终末分支显著减少,提示在视网膜变性过程中α亚型RGCs树突的信息传递功能可能发生了变化。     

LBA对剥夺性弱视大鼠视网膜神经节细胞保护作用

目的 研究枸杞子提取物(LBA)对视觉剥夺性弱视大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)保护作用.方法 选择新生Wistar大鼠30只,随机分为阴性对照组、阳性对照组和用药组,每组10只.出生1周后缝合所有大鼠左侧眼睑,阴性对照组、阳性对照组和用药组每天分别腹腔注射等量的生理盐水、左旋多巴(20 mg/kg)及LBA(10 m...     

外源性H2O2对大鼠纯化视网膜神经节细胞存活及轴突生长的影响

目的研究外源性H2O2对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)存活和轴突生长状况的影响及其与神经微丝蛋白NF-H表达变化的关系,探讨H2O2的氧化应激引起RGCs损伤的机制。方法纯化培养SD乳鼠RGCs,应用不同浓度H2O2(250、500μmol/L)分别作用4、8、24、32h后测定存活、有突起的视网膜神经节细胞数及其最长突起长度。采用免疫组织化学染色加图像分析系统检测H2O2对RGCs表达神经微丝蛋白NF-H的影响。结果纯化培养的SD大鼠RGCs纯度可达96.24%。H2O2以浓度和时间依赖的方式影响纯化培养的RGCs存活数,500μmol/L的H2O2在32h可以导致RGCs存活数下降约50%。同时,500μmol/L H2O2孵育后RGCs细胞轴突长度与对照组比较明显减短,差异有统计学意义(P<0.01),且减短程度随时间延长而增大;NF-H表达差异也有统计学意义(P<0.01),且NF-H在RGCs中分布紊乱。结论 H2O2的氧化应激损伤能够以时间和浓度依赖的方式影响纯化培养的RGCs存活,可影响RGCs轴突生长,这可能与其下调RGCs中神经微丝蛋白的表达有关。     

αA晶体蛋白基因启动子与HSP70融合基因表达载体的构建及鉴定

目的构建αA晶体蛋白基因启动子与HSP70融合基因表达载体pαACP-HSP70。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术,从质粒pIRES2-EGFP-HSP70中扩增HSP70基因,将已构建的含αA晶状体蛋白基因特异性启动子活性片段(αACP)的质粒pαACP-IRES2-EGFP双酶切,回收载体片段,利用基因重组技术,将HSP70基因片段定向插入载体启动子αACP之后,构建特异性表达载体,命名为pαACP-HSP70,并通过PCR、酶切和DNA测序进行鉴定。结果构建的pαACP-HSP70质粒通过酶切图谱鉴定、PCR检测有1924 bp条带出现,通过测序显示所克隆的HSP70基因与基因库中的同种序列比较,核苷酸序列有100%的同源性。结论成功构建了晶状体上皮细胞特异性表达载体pαACP-HSP70。     

TNF-α、IL-6对青光眼大鼠视网膜的影响

摘要:目的 探究肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)对青光眼大 鼠视网膜的影响。方法 将64只3~5月龄的SD大鼠随机分为空白组、空白+TNF-α组、空白+IL-6组、空白+TNF-α +IL-6组、青光眼组、青光眼+TNF-α组、青光眼+IL-6组、青光眼+TNF-α+IL-6组,每组8只。各青光眼组动物在右 眼复制青光眼模型,按分组给予 TNF-α和(或)IL-6处理,比较各组造模前后,给药3、6周的眼压及视网膜组织病理和组 织细胞凋亡情况。分离培养新生大鼠视网膜神经节细胞,并将其分为对照组、谷氨酸组、谷氨酸+TNF-α组、谷氨酸+ IL-6组及谷氨酸+TNF-α+IL-6组,比较各组细胞的增殖与凋亡情况。结果 给药6周,青光眼+TNF-α组眼压最高、 视网膜组织细胞凋亡最明显,其次为青光眼组、青光眼+TNF-α+IL-6组和青光眼+IL-6组(均 P<0.05),非青光眼各 组眼压及视网膜组织细胞凋亡相当,差异无统计学意义(P>0.05);青光眼组、青光眼+TNF-α组、青光眼+IL-6组、青 光眼+TNF-α+IL-6组视网膜神经节均存在病理改变,其中青光眼+TNF-α组细胞病变最为显著。视网膜神经节细胞 被成功分离及培养;培养24~72h,谷氨酸+TNF-α组增殖最弱,凋亡率最高,其次为谷氨酸组、谷氨酸+TNF-α+IL-6 组和谷氨酸+IL-6组(均P<0.05)。结论 IL-6可能具有保护青光眼所致视网膜细胞损伤的作用,或与抑制视网膜神 经细胞 TNF-α相关的炎性病变有关。     

α-晶体蛋白作为分子伴娘对糖基化诱导过氧化氢酶失活的保护

α晶体蛋白作为分子伴娘对糖基化诱导过氧化氢酶失活的保护严宏１ＨａｒｄｉｎｇＪ２张东杲１（１第四军医大学唐都医院眼科西安７１００３８２ＮｕｆｉｅｌｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＯｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏ...     

阿斯匹林类药物和α-晶体蛋白保护酯酶的失活

目的研究阿斯匹林类药物和α-晶体蛋白对酯酶的保护作用. 方法凝胶色谱分离牛α-晶体蛋白,酯酶分别与糖类、磷酸糖、氰酸钾和激素加阿斯匹林(Asp)、布洛芬(Ibu)、扑热息痛(Para)和α-晶体蛋白温育,采用分光光度法测定酶活性. 结果糖化、氨甲酰化和类固醇诱导酯酶失活的作用呈浓度依赖性,类固醇失活效应最快. 10 mmol*L-1 Asp可部分保护果糖和类固醇诱导酯酶的失活,尽管Ibu抑制酶活性,但其羧基化(Ibu-1)和羟基化(Ibu-2)代谢物有保护作用. α-晶体蛋白与酯酶摩尔比为1∶1时,可完全特异地保护果糖、果糖6-磷酸和泼尼松龙-21-半琥珀酸诱导的酯酶失活;而在1∶4时,保护率分别为67.0%,55.0%和38.3%. 结论 Asp和Ibu保护酯酶免于失活的作用机制可能不同;α-晶体蛋白作为分子伴侣可保护酯酶免于失活.     

孕酮对慢性高眼压模型大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的：建立大鼠慢性高眼压模型，检测孕酮对高眼压下大鼠视网膜神经节细胞的保护作用。方法：通过烧灼3条巩膜上静脉制作慢性高眼压动物模型，此模型按腹腔注射不同浓度的孕酮而分为高、中、低浓度孕酮注射组及空白对照组，左眼为模型眼，右眼为自身对照眼，3个月后处死动物，取眼球制石蜡切片，行HE染色、Thy-1.1免疫组化染色及TUNEL原位凋亡检测。结果：各组模型眼比较，高浓度孕酮注射组视网膜神经节细胞数多于低、中浓度孕酮注射组及空白对照组（P<0.05），且TUNEL阳性细胞数也少于低、中浓度孕酮注射组及空白组(P<0.05)。结论：孕酮对慢性高眼压模型大鼠的视网膜神经节细胞有保护作用，并且此保护作用与孕酮的浓度有关。     

自噬在早期糖尿病大鼠视网膜神经病变中的作用

目的 探索自噬在糖尿病大鼠视网膜损伤中的表达变化及其与视网膜神经节细胞(RGC)损伤的相关性.方法 共有60只Wistar大鼠经链脲佐菌素腹腔注射制作糖尿病大鼠模型.造模成功后,分别在糖尿病0、4、12周检测RGC数量、视网膜电图(ERG)、视网膜血管形态学变化,Western blot法检测自噬标记物LC3b-Ⅱ与Beclin-1的蛋白表达,免疫组化法检测LC3b-Ⅱ在视网膜上的表达部位.结果 糖尿病造模成功后,视网膜RGC数在第12周时减少至0周时的(88.6±2.2)%,差异有统计学意义(P<0.05).并且ERG的b波以及总振幅在第4周时就出现降低,差异有统计学意义(P<0.01).Western blot检测显示,糖尿病4周和12周大鼠视网膜中的LC3b-Ⅱ和Beclin-1表达均逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05).免疫组化方法显示LC3b-Ⅱ在各时期糖尿病大鼠视网膜中的视网膜神经节细胞层表达阳性.结论 糖尿病视网膜病变中自噬参与了RGC的损伤.     

遗传性先天性白内障与αA-晶体蛋白基因相关性研究

目的 分析遗传性先天性核性和绕核性白内障与定位于21q22．3的αA-晶体蛋白（CRYAA）基因之间的关系。同时对比单链构象多态性（SSCP）和变性高效液相色谱法（DHPLC）两种方法检测单核苷酸多态性（SNP）。方法 用PCR方法扩增CRYAA基因的3个外显子,分别用SSCP和DHPLC两种方法分析扩增产物,对异常者进行DNA测序,寻找基因变异情况。结果用SSCP分析15个样本,未见异常条带;同时用DHPLC检测15个样本,其中1个样本出现双峰,将该样本扩增产物测序鉴定,发现在5’端第6个核苷酸为G／A杂合,二者是同一氨基酸的2个密码子,该核苷酸为CRYAA基因的多态性位点。未发现该基因突变。结论 实验中未发现15例先天性白内障患者与CRYAA基因之间有关联。应用SSCP与DHPLC同时分析,DHPLC检测出1个多态性位点。DHPLC对杂合子检出的敏感性要高于SSCP。