SARS病毒S蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的探讨SARS冠状病毒的刺突(spike，S)蛋白的免疫学特性，以及S蛋白作为SARS—CoV病毒疫苗组分的可行性。方法将S蛋白基因分段克隆入原核表达载体pET—15b，并在大肠杆菌中表达，经过亲和层析得到纯化的重组蛋白rSa和rSb；将全长S基因克隆入真核分泌表达载体pSecTagB，得到重组DNA疫苗pSecS，免疫小鼠，得到SAS—CoV S蛋白抗血清。然后用纯化的重组蛋白rSa和rSb建立的SARS—CoV S抗体ELISA检测技术研究所构建的S-DNA疫苗的免疫效果。结果分段的重组蛋白rSa和rSb在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达，并能与SARS确诊病人血清以及pSecS免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应，原核表达的重组分段S蛋白具有SARS—CoV S蛋白相似的抗原性。结论原核表达的两段重组S蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS—CoV检测中；所构建的SARS—CoV的S基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体，这为进一步SARS DNA疫苗的研制提供一定的借鉴作用。     

SARS病毒S2蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的 构建SARS冠状病毒(SARS-CoV)S2基因的原核和真核表达质粒,研究该真核表达重组质粒作为DNA疫苗的可行性.方法 采用RT-PCR技术从灭活的SARS冠状病毒RNA扩增得到SARS-CoV-S2基因片段,定向克隆入原核表达载体pET-28a和真核表达载体pCDNA3.1 中,构建pET-28a-SARS-CoV-S2和pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒.用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导重组质粒pET-28a-SARS-CoV-S2在大肠埃希菌BL21(DE3)plysS中表达融合蛋白;并将重组pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒免疫BALB/c小鼠,采用ELISA、Western blot的方法检测被免疫小鼠的抗体应答情况.结果 应用RT-PCR技术,从灭活的SARS冠状病毒扩增得到大小约为998 bp SARS-CoV-S2基因片段后,构建了含SARS-CoV-S2基因片段的原核表达质粒pET-28a-SARS-CoV-S2和真核表达质粒pCDNA3.1-SARS-CoV-S2;通过IPTG诱导,重组pET-28a-SARS-CoV-S2质粒在表达菌BL21(DE3)plysS内表达S2融合蛋白;用纯化的重组真核表达质粒经基因枪免疫BALB/c小鼠后,获得了高效价的特异性抗体.结论 成功构建了可表达SARS-CoV-S2融合蛋白的原核表达质粒pET-28a-SARS-CoV-S2.重组pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒可作为DNA疫苗使被免疫小鼠产生明显的免疫应答.为建立SARS特异性血清学诊断方法和研制SARS DNA疫苗奠定了一定的基础.     

SARS冠状病毒S蛋白多价核酸疫苗的构建和免疫学原性

目的构建以SARS冠状病毒（severe acutere spiratory syndrome coronavlrus,SARs．c0V）S蛋白3个保守片段基因的组合为抗原基因DNA疫苗,采用肌肉注射的方法接种小鼠后观察机体产生免疫应答的情况。方法将人工合成的S蛋白3个保守片段基因组合（称为Sa）克隆至真核表达载体pcDNA3、1（-）,随之将重组质粒进行小鼠肌肉免疫,定期检测血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平,流式细胞仪观察其淋巴细胞表型变化,PCR法检测质粒分布,免疫组化检测抗原表达。结果疫苗注射后15d就能在血清中检测出病毒特异性抗体,并且疫苗能在机体中持续表达抗原引发机体持续的免疫应答,直到注射后45d免疫应答都不见减弱;以CTLT淋巴细胞为主的CD8＋T淋巴细胞的百分比含量增加极显著,引起强大的体液免疫和细胞免疫;而空载体质粒对照组未检测出明显的特异性免疫应答。结论以S蛋白3个保守片段基因组合为抗原基因的DNA疫苗通过肌注能诱导小鼠针对SARS病毒强大的免疫应答。     

SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

SARS 冠状病毒S2蛋白胞外段的原核表达及其细胞膜融合效应研究

目的 构建SARS冠状病毒S2蛋白胞外段( S2ED)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白表达质粒,获得在原核细胞中表达的目的 蛋白.方法 在生物信息学预测基础上,利用PCR方法 扩增S2ED和EGFP的编码序列,插入到质粒pET-14b中构建融合表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白His-S2ED-EGFP.采用Ni-NTA亲和树脂纯化融合蛋白可溶部分,利用SDS-PAGE和免疫印迹的方法 鉴定纯化后的蛋白,通过荧光显微镜考察S2ED与Hela细胞胞膜能否发生融合效应.结果 重组质粒pET-14b-S2ED- EGFP的构建正确无误,并能够在BL21(DE3)中高效表达.纯化后的蛋白与Hela细胞孵育后,未观察到蛋白通过膜融合的过程内化进入细胞.结论 S2ED的绿色荧光蛋白融合表达载体构建成功,并在原核细胞中获得了部分可溶的表达和有效的纯化.虽然原核表达的重组蛋白未能在Hela细胞上发挥预期的生物学效应,但是该工作将为加深S2蛋白介导的胞膜融合过程的认识以及未来进行以特异性细胞结合肽为基础的定向靶细胞转运系统研究奠定重要的基础.     

SARS疫苗研究进展

严重急性呼吸综合征(sARS)是由SARS相关冠状病毒(sARS-GoV)引起的一种新的传染病.虽然SARS的流行已经被有效控制,但很可能因实验室样本外泄或动物宿主中南类SARS-CoV演化而来的病毒的分离株导致再次爆发,阻止SARS再次流行最有效的方法就是研制安全有效的疫苗,所以,SARS疫苗的研究仍然是目前SARS相关研究的重点.不同类型SARS疫苗的研究已经迅速展开,并且有些疫苗研究已取得了突破性的进展,进入了临床试验阶段.但在SARS疫苗的研究过程中也遇到了很多问题,如抗体依赖性感染增强(ADE)、SARS-CoV病毒变异快、没有理想的动物模型等.本文对SARS疫苗的研究、疫苗研究中存在的问题等进行了综述.     

SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因克隆和变异分析

目的:获得SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因的克隆.方法:将SARS病毒RNA基因组逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其亚克隆到pUCm-T载体中进行酶切及测序分析,并与Genbank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为1905 bp,与Genbank中另外45株的SARS病毒株的S蛋白S1片段基因比较,共有13个位点发生突变,其中有8处为同义突变,5处为错义突变.结论:成功克隆SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因,为该基因的表达及功能研究奠定了基础.     

SARSN状病毒S蛋白S1区多肽与SARS病人血清的免疫反应

目的 测定根据计算机预测的SARS冠状病毒S蛋白S1区的抗原表位多肽与SARS病人血清的免疫反应．以寻找和确定SARS相关冠状病毒的中和抗原表位。方法 采用多肽合成仪合成SARS冠状病毒S蛋白S1区的多肽．并用ELISA方法检测合成的多肽与SARS病人血清的免疫反应。结果 合成的8个多肽与SARS病人血清免疫反应的光密度值是其与正常人血清免疫反应的光密度值的1．5～2．6倍。结论 合成的多肽与SARS病人血清的免疫反应较低，提示这些多肽是否为SARS冠状病毒的抗原表位还要进一步研究。     

SARS冠状病毒S蛋白基因片段的表达及其单克隆抗体的制备

目的: 表达SARS冠状病毒S蛋白片段,并制备特异性单克隆抗体(mAb).方法: 原核表达SARS冠状病毒S蛋白片段,从SARS病毒cDNA中扩增S蛋白(N端205至419aa)基因片段,测序结果正确.将该基因片段插入pQE-30中,构建重组质粒pQE-30-S1m,以重组质粒转化E.coli M15诱导表达His-S1m蛋白.纯化后免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb.结果: 表达并纯化了重组蛋白His-S1m,获得1株抗His-S蛋白的mAb1H2.Ig亚类鉴定为IgG1a,轻链为κ型.经Western blotting检测,mAb1H2与S蛋白发生特异性反应,而与His蛋白无交叉反应.结论: 成功表达了重组S蛋白并制备了特异性mAb,为SARS-CoV的早期诊断及进一步研究S蛋白的功能奠定了基础.     

SARS相关冠状病毒S2基因的克隆及其DNA疫苗的免疫效果

目的：构建抗原基因为SARS相关冠状病毒(severe acute resplratory syndrome coronavtrus,SARS—CoV)S2基因的DNA疫苗,将其接种小鼠后观察病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的S2基因片段克隆至真核表达载体,随之将质粒进行小鼠肌内接种免疫,定期检测血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：疫苗接种后第2周就能检测出病毒特异性抗体,随着时间的延续,抗体水平逐步升高,而空质粒对照组未检测出明显的特异性抗体。结论：以S2为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体。     

SARS相关冠状病毒M基因片段的克隆及其DNA疫苗诱导的体液免疫

目的：构建含有SARS相关冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS—CoV)M基因片段的核酸疫苗，观察其免疫小鼠后病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的M基因片段克隆到核酸疫苗真核表达载体pVAX1中，免疫小鼠后，用SARS—CoV抗体ELISA检测试剂盒定期检测免疫小鼠血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：构建了重组核酸疫苗质粒pVCo—M，免疫小鼠后可诱导产生出病毒特异性抗体。结论：以M为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体，为进一步改进或探索同类DNA疫苗提供有益启示。     

SARS冠状病毒S蛋白抗原表位串联基因的设计和表达

目的:表达严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒S蛋白的抗原表位序列,为研制新型的SARS病毒疫苗提供新思路。方法:应用生物信息学分析软件分析SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位序列,设计全新的抗原表位编码基因序列,构建表达载体并在大肠杆菌中表达该基因。结果:设计并合成了SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位序列的新基因序列,在大肠杆菌中实现了该基因的高表达。结论:可以重新设计新基因产生新型候选重组疫苗。     

SARS相关冠状病毒S1融合蛋白的原核表达与纯化

目的：克隆严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)S1蛋白编码DNA,构建原核表达质粒pGEX-5T／S1,并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白。方法：采用PCR方法扩增合成S1片段,并克隆入载体中,经双酶切鉴定和测序后把S1序列定向插入原核表达载体pGEX-5T的多克隆位点,转化大肠杆菌K802,将纯化后的融合蛋白用于SARS—CoV抗体阳性血清的检测。结果：GST—S1融合蛋白以可溶形式表达,纯化后的蛋白用ELISA法检测,结果与对照相符。结论：成功诱导原核表达并纬化出融合蛋白S1,为将其应用于SARS—CoV的特异性检测和亚单位疫苗研究奠定了基础。     

Immune response in Balb/c mice induced by recombinant spike protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus

Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) is a highly aggressive pathogen that caused SARS in 2003 and 2004. Spike protein (S) on the surface of virus particles mediates the attachment of the virus to cell surface receptors and induces the fusion of viral and cellular membranes.     

SARS冠状病毒S蛋白S1区多肽与SARS病人血清的免疫反应

目的 测定根据计算机预测的SARS冠状病毒S蛋白S1区的抗原表位多肽与SARS病人血清的免疫反应,以寻找和确定SARS相关冠状病毒的中和抗原表位。方法 采用多肽合成仪合成SARS冠状病毒S蛋白S1区的多肽,并用ELISA方法检测合成的多肽与SARS病人血清的免疫反应。结果 合成的8个多肽与SARS病人血清免疫反应的光密度值是其与正常人血清免疫反应的光密度值的1.5～2.6倍。结论 合成的多肽与SARS病人血清的免疫反应较低,提示这些多肽是否为SARS冠状病毒的抗原表位还要进一步研究。     

SARS患者血清中SARS相关冠状病毒抗体产生规律的初步分析

目的 :了解严重急性呼吸综合征 (SARS)患者血清中 SARS病毒特异性 Ig M、Ig G抗体产生的规律。方法 :随机选取32例 SARS患者 5 5份血清标本 ,应用 EL ISA分别检测抗 SARS病毒 Ig M、Ig G抗体。结果 :Ig M抗体阳性率为 5 6 .4 % ,平均出现时间为 (5 .88± 2 .6 2 ) d,其中 2例患者在发病后第 2天即出现阳性 ,平均消失时间为 (14 .2 5± 2 .97) d;Ig G抗体阳性率为4 1.9% ,平均出现时间为 (11.4 0± 4 .2 0 ) d,其中 2例患者在发病后第 3天即为阳性 ;Ig M和 Ig G抗体的总体阳性漏检率为6 .2 5 %。结论 :SARS患者于发病后 3～ 7d血清中出现特异的 Ig M抗体 ,可用于实验室诊断 ;同时进行 Ig M和 Ig G抗体的检测可用于发病 8～ 14 d左右的实验室排查检测