基于斑马鱼模型三棱抗血栓活性部位筛选及其化学成分研究

目的：筛选中药三棱抗血栓活性部位并对其化学成分进行研究。方法：采用斑马鱼血栓模型对中药三棱80%乙醇提取物的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位的抗血栓作用进行测试。以硅胶柱色谱等方法对抗血栓作用显著的部位进行分离纯化，通过NMR，MS等方法并结合文献数据鉴定化合物结构。结果：乙酸乙酯萃取物能显著增加斑马鱼血栓模型的心脏染色强度（P<0.01），其余各部位抗血栓作用不明显。在该部位分离得到11个化合物，分别鉴定为对羟基苯甲酸（1）、5-羟甲基糠醛（2）、对甲氧基苯甲醛（3）、对羟基苯甲醛（4）、对香豆酸（5）、阿魏酸（6）、香草酸（7）、原儿茶酸（8）、香兰素（9）、Methyl-3，6-dihydroxy-2-[2-（2-hydroxyphenyl）-ethynyl]benzoate （10）及1，3-O-二阿魏酰基甘油（11）。结论：三棱提取物的乙酸乙酯萃取部位具有显著的抗血栓作用，其主要化学成分为酚酸类化合物。     

枸杞子及其有效成分的药理作用研究进展

枸杞子Lycium barbarum是食药同源中药材,具有滋阴兴阳、止消渴、补劳伤的功效,富含枸杞多糖、枸杞总黄酮、类胡萝卜素和氨基酸等多种有效成分。现代药理学的研究显示,枸杞子及其活性成分具有抗肿瘤、调节血糖血脂、保护视力、抗抑郁与焦虑、防治神经系统疾病、抗炎抑菌、抗氧化、保护肝肺肾等作用。对枸杞子及其有效成分的药理作用进行总结和归纳,以期为其进一步应用开发及新药研究提供依据。     

枸杞子的化学成分与生物活性

枸杞子富含多糖、类胡萝卜素等营养成分,既是常用食品,又是传统药品。生物活性研究显示其具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤以及增强免疫功能等多种活性,应用前景良好。     

不同枸杞子中枸杞多糖的含量分析

目的 分析不同枸杞子样品中枸杞多糖的含量. 方法采用硫酸苯酚法测定. 结果 不同种枸杞子中多糖含量顺序是:云南枸杞>宁夏枸杞>柱筒枸杞>枸杞>新疆枸杞>截萼枸杞>北方枸杞>黄果枸杞>黑果枸杞>红枝枸杞. 不同产地枸杞子样品含量顺序是:宁夏>新疆>内蒙古>青海>河北>陕西>山西>甘肃. 栽培枸杞子样品枸杞多糖含量大于野生样品. 结论 枸杞子中的枸杞多糖含量:栽培样品高于野生;宁夏及其周边地区和全国主要栽培基地产的样品高于其他地区. 宁夏枸杞(种)的样品高于其他种.     

续断抗骨质疏松活性部位的筛选

目的 探讨续断抗骨质疏松的活性部位.方法 采用成骨细胞促增殖实验,对续断不同萃取部位进行抗骨质琉松药效学筛选,同时采用紫外分光光度法测定了各萃取部位总皂苷的含量,综合药效学和化学成分分析结果,对活性部位进行了探索.结果 续断正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物能非常显著地促进成骨细胞的增殖,效果明显优于石油醚萃取物与水层;乙酸乙酯萃取物对成骨细胞的促增殖率高于相同浓度的正丁醇萃取物;续断正丁醇萃取物和水层萃取物总皂苷含量分别为75.01％±1.6％.22.84％±0.2％,石油醚和乙酸乙酯萃取物中未检测到皂苷.结论 续断抗骨质疏松活性有效成分主要集中于乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物,除续断皂苷外,续断中可能还存在其它成分具有抗骨质疏松活性.     

枸杞子活性多糖的研究

目的　对4个均一枸杞多糖：LBP1a-1,LBP1a-2,LBP3a-1和LBP3a-2进行结构研究和药理评价。方法采用凝胶柱色谱、酸水解、过碘酸氧化和波谱学等方法测定多糖样品的分子量、单糖组成及连接方式,并以小鼠脾淋巴细胞增殖反应为免疫活性指标对多糖样品进行活性评价。结果　4个多糖样品的分子量分别为11.5×10⁴,9.4×10⁴,10.3×10⁴,8.2×10⁴,LBP1a-1,LBP1a-2为1,6连接的葡聚糖;LBP3a-1,LBP3a-2具有1,4连接的多聚半乳糖醛酸主链,及微量的半乳糖和阿拉伯糖分支。4个多糖均具有免疫促进作用。结论　4种多糖首次从枸杞子中分离得到,具有1,4连接多聚半乳糖醛酸主链结构的多糖活性较强。     

基于模式生物斑马鱼模型的中药药效物质筛选技术及应用

目的作为一个复杂成分体系,中药药效物质的精准辨识和筛选是中药现代化研究的一个瓶颈问题,探索新的实验技术十分重要。方法斑马鱼是新兴的模式生物,具有体外受精、胚胎透明,不需要解剖可方便在显微镜下观察组织器官的发育等生物学优势,可在细胞板中完成实验,需要样品量少,已被欧洲替代法验证中心推荐为新的替代动物。斑马鱼全基因组测序结果显示斑马鱼与人的基因组相似性达87%,大量的研究表明斑马鱼对药物反应与临床反应也高度相似,为斑马鱼应用于研究人类疾病与药物筛选奠定了理论和实践基础。本实验室利用斑马鱼模型构建了较为齐全的中药药效物质筛选的技术体系,并对甘草、阿胶、栀子、乳香等传统中药进行药效或毒性成分的筛选辨识研究。结果本实验室利用斑马鱼模型建立了可涵盖肿瘤、心血管、神经系统、骨骼、皮肤、重要器官等的活性/毒性筛选技术平台。从前期大规模的筛选中,发现甘草具有一定的抗肿瘤作用,进一步利用斑马鱼活性跟踪技术和高速逆流色谱分离技术,发现了2个未报道的抑制血管生成的活性成分。新阿胶是山东福胶集团的独家品种,是以猪皮为来源,作为阿胶的替代品,但是现代药理学数据缺乏导致市场认可度低,因此我们利用斑马鱼模型系统开展了新阿胶的化疗损伤后的"扶正"与"生血"的作用机制。中药栀子临床发现具有防治血栓的功效,但是抗血栓的药效标志物并不清楚,作者采用斑马鱼模型整合代谢组学技术,发现3个代表性的抗血栓成分。乳香在历代典籍中具有"孕妇慎服"记载,但是原因不明,我们利用斑马鱼模型构建发育毒性模型,并结合灰色关联度分析法,证明乳香具有一定的发育毒性,并发现了潜在的毒性靶器官,并发现了主要的毒性效应成分。结论斑马鱼作为一种新型的模式生物,在中药药效物质筛选、活性评价、毒性预警方面都具有广阔的应用前景。     

枸杞子“走油”化学物质基础内涵的初步阐释

目的:初步探讨并阐释枸杞子贮藏中"走油"的化学物质基础内涵。方法:采用透明聚乙烯塑料袋作为枸杞子的包装材料,于室温下贮藏,定期观察外观性状变化,并于贮藏0月,3月,6月,12月时取样,对各样品中枸杞多糖的含量进行测定。结果:枸杞子贮藏3月时开始"走油",且"走油"前后枸杞多糖含量差异较大,贮藏3月时多糖含量降低30%～50%,贮藏6月降低程度逐渐平缓,贮藏12月时4批样品中的3批枸杞子的枸杞多糖含量已低于药典规定值1.8%。结论:伴随枸杞子贮藏中"走油"现象的发生,枸杞多糖含量随之降低,提示枸杞多糖为枸杞子"走油"的化学物质基础。     

基于脂多糖诱导斑马鱼炎症模型研究何首乌多糖抗炎活性

目的 探究何首乌中水溶性多糖(water-extractedPolygonum multiflorum polysaccharides,WPMP)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所致斑马鱼系统性炎症的保护作用。方法 WPMP经分离纯化后得到2种组分(WPMP-1和WPMP-2),收集斑马鱼胚胎于28.5℃中培养箱中孵育,设置空白组、LPS诱导模型组,通过孵化率、心率、卵黄囊面积、活性氧生成率、NO生成率等指标确定LPS最佳诱导炎症浓度,确定炎症模型后,加入不同组分的WPMP,并以上述相同指标评价WPMP的抗炎效果。结果 不同浓度WPMP (10,50,100 μg·mL^-1)对LPS引起的斑马鱼炎症具有保护作用,呈现浓度依赖性,能够恢复卵黄囊正常大小,显著降低心率、活性氧生成率以及NO生成率,且在相同多糖浓度下,WPMP-2的抗炎活性高于WPMP-1。结论 PMP具有较好的抗炎作用,为WPMP作为一种天然的抗炎成分提供了科学依据。     

斑马鱼内毒素炎症模型构建及及中药抗内毒素炎症活性筛选

革兰阴性菌外膜结构成分脂多糖(LPS)即内毒素,是其主要致病因子,具有广泛而复杂的生物学效应,可直接或间接引起机体发热、代谢改变、免疫功能紊乱,多器官功能损害、休克乃至死亡等许多病理生理过程。这些效应主要是通过LPS与细胞表面的受体结合,激活细胞内信号转导系统,促进细胞因子及炎症介质的大量合成与释放,导致机体失控性炎症反应。在现代医学对由内毒素触发全身炎症反应综合征的治疗仍然一筹莫展的今天,不断有中药、复方或其所含成分被证明对受内毒素攻击的动物有保护作用。我们先期的研究结果亦证明,中医经典复方凉膈散具有良好的抗内毒素炎症活性,从中药寻找抗内毒素治疗措施呈现良好的前景,抗内毒素中药活性筛选成为关注的热点。然而,对于中药或复方来说,由于成分复杂,影响因素众多,限制了细胞筛选体系和分子筛选体系的应用,特别是在以有效部位、提取物甚至水煎剂为研究对象时则更加困难。若用哺乳动物模型进行大规模筛选,则费时、费力、费物资,代价难以承受。斑马鱼被广泛用作研究人类疾病的动物模型,利用斑马鱼模型来筛选药物已成为发现候选药物的关键技术。近年来,转基因、诱导突变和反义morpholino knockdown等技术的使用,结合活体成像技术,使斑马鱼成为研究人类炎症免疫疾病相关的病理生理学及在活体内进行高通量药物筛选的良好模式生物。近年在国家自然科学基金资助下,开展了斑马鱼内毒素炎症模型构建及基于该模型的中药抗内毒素炎症活性筛选研究。采用LPS卵黄囊注射诱导成功建立斑马鱼内毒素炎症模型。以LPS诱导的中性粒细胞及巨噬细胞的迁移聚集、斑马鱼死亡率、生存时间可作为评价抗内毒素炎症活性参考指标。利用斑马鱼内毒素炎症模型开展了凉膈散方提取物(不同极性提取部位)抗内毒素活性筛选,凉膈散方中单味中药提取物(不同极性提取部位)抗内毒素活性筛选及凉膈散方所含活性单体抗内毒素活性筛选。研究证明该模型用于中药抗内毒素活性评价是可行的。鉴于有效成分组方是创新中药研发的新形式、新方法,我们利用斑马鱼内毒素炎症模型开展了抗内毒素中药有效成分组方的配伍与配比研究,获得优化配方并申请专利保护。利用LPS诱导的马鱼内毒素炎症模型,建立适宜于不同层次(中药单体成分、单味中药及复方不同提取部位或组分)中药形式抗内毒素活性筛选方法,为抗内毒素中药筛选提供一个介于体外初筛与哺乳动物验证之间的快速、低成本和活体筛选新方法,具有良好的应用前景。     

山苦荬保肝活性部位筛选及其化学成分研究

目的:筛选山苦荬保肝活性部位并对其化学成分进行研究.方法:采用系统溶剂法,以70％乙醇对山苦荬药材进行提取,用不同溶剂对所得提取物进行萃取,分别得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位和剩余水部位.以对乙酰氨基酚诱导人肝细胞HL-7702复制肝损伤细胞模型,采用MTT法检测上述各部位(40μg/mL,均以生药量计)对损伤细胞的保...     

转基因斑马鱼模型应用于索拉非尼抗肝癌活性筛选的方法研究

目的 使用斑马鱼 (Danio rerio) 肝癌模型进行药物筛选,确定筛选方法和最适条件。方法 用不同浓度盐酸多西环素 (Dox) 处理转基因斑马鱼胚胎,诱导其肝脏异常增生,通过综合评价诱导效应与毒性效应,确定适合的诱导浓度;选择适宜的诱导浓度,对索拉非尼抑制肝部异常增生的能力进行评估。结果 确定了盐酸多西环素的最适诱导浓度为30~60mg/L,索拉非尼对斑马鱼模型的肝部异常增生有显著的抑制作用,同时也观察到药物的毒副作用。结论 该模型适用于索拉非尼及其类似物抗肝癌活性的评价与筛选,是评估化合物体内生物活性的快速筛选模型,同时也可以观测毒副作用,在其它抗肝癌药物及与Ras下游信号通路相关靶点的药物的筛选等方面具有广阔的应用前景。     

不同产地高良姜的质量分析及其抗肿瘤活性部位筛选

目的对来自不同产地的高良姜饮片进行质量分析,确定优质高良姜药材来源,在此基础上,筛选其对6种肿瘤细胞的抗肿瘤活性部位。方法以高良姜素含量为指标,利用HPLC法对不同产地的高良姜进行质量分析,色谱柱为Agilent C_(18)(4.6 mm×250 mm,5μm)柱,检测波长266 nm,柱温25℃,流动相甲醇-0.2%磷酸(55∶45),流速1 mL·min~(-1)。采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇依次对高良姜85%乙醇提取物进行萃取,将得到的各提取部位用MTT法评价其体外细胞毒活性,进行抗肿瘤活性筛选。结果广东产高良姜中高良姜素含量高于其他2个产地,为14.17 mg·g~(-1)。高良姜石油醚萃取部位和二氯甲烷萃取部位对6种肿瘤细胞均有明显抑制作用,活性强于乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位与水部位,且呈现时间和浓度依赖关系。对人宫颈癌细胞株Hela抑制效果最好,石油醚萃取部位24 h与48 h的IC_(50)分别为7.88、6.55μg·mL~(-1);二氯甲烷萃取部位24 h与48 h的IC_(50)分别为6.13、4.78μg·mL~(-1)。结论 HPLC法优选方便、高效,高良姜抗肿瘤活性的有效部位为石油醚萃取部位和二氯甲烷萃取部位。     

甲硝唑诱导斑马鱼骨丢失模型的建立

目的通过构建甲硝唑诱导胰岛β细胞破坏的转基因斑马鱼骨丢失的动物模型,为寻找可保护胰岛β细胞的促骨形成药物提供经济便捷的平台。方法用酶切鉴定正确的重组质粒p-IsceI-INS:nfsB进行显微注射,建立胰岛β细胞转基因斑马鱼系。选用受精后30 h的转基因斑马鱼胚胎分别暴露于5,10,15μmol·L^-1甲硝唑溶液中,作为甲硝唑组;同时设1%二甲亚砜溶媒作为阴性对照组,nfsB蛋白将无毒性的前体药物转变为细胞毒素,在活体直接破坏胰岛β细胞。48 h后及时更换胚胎养殖水终止甲硝唑的破坏作用,常规28.5℃下在24孔板中培养至斑马鱼颅骨形成。测定斑马鱼血糖水平,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒定量测定糖基化终产物;采用茜素红对斑马鱼骨骼进行染色,以显微检测、数码成像方法定量分析骨骼染色区域。结果与阴性对照组比较,5,10,15μmol·L^-1甲硝唑组斑马鱼骨骼染色面积和累计吸光度显著减小,提示利用甲硝唑破坏胰岛β细胞构建转基因斑马鱼的骨骼矿化量和骨密度都显著降低,成功诱导斑马鱼骨丢失模型。并用该模型成功验证依替膦酸二钠防治骨质疏松的作用。结论成功构建破坏胰岛β细胞诱导转基因斑马鱼骨丢失模型,为在整体动物水平筛选可保护胰岛β细胞的促骨形成的小分子化合物和中草药提供一个新型的动物模型。     

枸杞多糖对去势雌性大鼠骨质疏松影响的研究

目的研究枸杞多糖(LBP)对去势雌性大鼠骨质疏松骨质变的影响。方法选用两月龄成年雌性SD实验大鼠50只,随机分为假手术组,去势+生理盐水组,去势+枸杞多糖高剂量组,去势+枸杞多糖低剂量组,去势+己烯雌酚组等5组,每组10只。术后各组常规饲养10周后给药干预,12周后行股骨干重测量、骨矿密度检查并观察骨的形态学改变。SPSS1.0统计软件分析。结果与去势+生理盐水组相比,去势+枸杞多糖高剂量组、去势+低剂量组均能增加去势雌性SD大鼠骨密度值,两组骨小梁结构较完整、连续性较好、吸收陷窝少。结论枸杞多糖对成年去势雌性大鼠骨质疏松有明显的骨质改善作用。     

基于斑马鱼模型的中药来源化合物血管抑制活性筛选

目的 利用斑马鱼高通量模型,对10种中药来源化合物进行筛选。方法 选取受精后转基因血管荧光Fli-1品系斑马鱼对10个中药来源的化合物进行筛选,用不同的药物浓度分别作用于斑马鱼,观察对斑马鱼体血管的影响。以斑马鱼肠下血管面积为主要指标,斑马鱼肠下血管出芽数为次要指标进行定量分析,考察各化合物对斑马鱼血管生成的抑制作用。结果 木犀草素(87.34 μmol·L^–1)、洋川芎内酯A(52.02 μmol·L^–1)、盐酸小檗碱(537.91 μmol·L^–1)、和厚朴酚(9.39 μmol·L^–1)、齐墩果酸(10.95 μmol·L^–1)组斑马鱼肠下血管面积与正常对照组相比肠下血管面积显著减少(P<0.01或P<0.001);木犀草素、洋川芎内酯A、盐酸小檗碱、齐墩果酸、和厚朴酚对肠下血管面积的抑制作用分别为12%,17%,18%,15%,24%;各化合物与正常对照组相比斑马鱼肠下血管出芽数无显著性差异;阳性对照组(索拉非尼5 μmol·L^–1)斑马鱼肠下血管面积与正常对照组比较显著性减少(P<0.05),其对血管新生的抑制作用为22%,肠下血管出芽数与正常对照组相比显著性减少(P<0.05)。结论 木犀草素、洋川芎内酯A、盐酸小檗碱、齐墩果酸、和厚朴酚具有抑制血管新生作用。     

枸杞子多糖对S180荷瘤小鼠细胞免疫功能的影响及其抑瘤作用

本文研究了S180荷瘤小鼠细胞免疫功能的动态变化过程。小鼠接种瘤细胞后d2和d4 RPI分别为正常的166％,390％;d6细胞免疫反应下降,RPI仅为正常的21％,d9为12％,d14为4％,LBP10mg/(kg.d)(共7d,下同)可使荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞[~3H]TdR参入值(cpm)由139±62提高到5581±783,RPI从相当于正常的0.3％提高到24.6％;10～20mg/(kg·d)的抑瘤率为31～39％。Cy12.5mg/kg从单次sc的抑癌率为14％,与LBP 10mg/(kg·d)合用的抑瘤率为54％,有明显的协同作用。     

二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸及其组合对斑马鱼阿尔茨海默病模型认知障碍的改善作用和机制

目的 omega-3多不饱和脂肪酸二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)能够抑制M1型小胶质细胞的过度激活促炎细胞因子的释放和细胞凋亡,而EPA具有抗抑郁的作用。与EPA比较,DHA似对记忆的改善作用更强。由于两者在食物、衰老和疾病中的比值多变,其单一和最佳组合的功效不明,本实验拟利用AD模型比较研究EPA、DHA及最佳组合改善认知障碍及神经炎症的机制。方法 Al³⁺诱导斑马鱼AD模型,饲予EPA、DHA或EPA+DHA(1∶2),评估新物体识别和T迷宫奖赏的记忆,GC-MS检测躯体PUFAs浓度变化,qPCR检测脑内AChE、Axl、APP、Bace1、IL-6、TNF-α、CD11b、CD206、VDAC1、Caspase-3、Caspase-9和Bax的变化,ELISA试剂盒检测脑内Aβ的浓度。结果 与模型组相比,EPA仅明显改善了斑马鱼的新物体识别能力,而DHA与EPA+DHA均恢复了新物体识别和T迷宫中的记忆。给予EPA、DHA和EPA+DHA均明显抑制了...     

基于分子对接技术筛选二至丸治疗骨质疏松的活性成分及验证

本研究借助分子对接技术和体外验证实验筛选中药复方二至丸治疗骨质疏松的活性成分。首先采用分子对接技术将二至丸中的化合物与4个骨质疏松相关靶点进行对接,初步挑选得到红景天苷、特女贞苷、酪醇、槲皮素和蟛蜞菊内酯等5个活性成分。然后采用含有不同浓度化合物的α-Mem培养基培养小鼠MC3T3-E1成骨细胞,检测细胞增殖率和矿化结节,细胞验证结果表明,红景天苷、特女贞苷和槲皮素对MC3T3-E1细胞增殖较为明显,红景天苷对MC3T3-E1细胞矿化作用较特女贞苷和酪醇效果更好。本文采用的分子对接技术及体外验证研究可以用于二至丸抗骨质疏松活性成分的筛选,同时可为中药药效活性成分的研究提供方法借鉴。