抗白介素-13单克隆抗体生物学活性测定方法的建立

目的：建立抗白介素-13单克隆抗体(抗IL-13单抗)的生物学活性检测方法。方法：利用 L-BEAS-2B细胞系，通过荧光素酶检测系统进行抗IL-13单抗的生物学活性检测，通过抗IL-13单抗参比品与样品对比以平行线分析的方法计算样品相对百分效价，并对该方法的精密性和准确性进行验证。 结果：抗IL-13单抗在该方法中存在量效关系，在半对数坐标纸上呈平行的直线分布。6批抗IL-13单抗样品经3次测定，相对百分效价平均值在(91.10±1.10)%~(105.27±7.17)%之间，RSD均小于12%； 1批样品经9次测定平均相对百分效价为(110.77±7.01)%，板间和日间RSD均小于7%；2批回收率样品经3次测定，回收率分别为(96.17±8.50)%和(91.53±15.46)%。结论：研究建立的抗IL-13单抗生物学活性检测方法准确性高，精密度及重复性好，可作为抗IL-13单抗生物学活性的常规检测方法。     

注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白生物学活性检测方法学研究

目的通过对注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测方法进行研究,建立该药物的生物学活性检测方法。方法参考重组人干扰素生物学活性测定法,以人羊膜细胞(WISH)病变抑制法开展注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测方法研究。结果该方法的专属性好,精密度试验中生物学活性相对标准偏差(RSD)为10.6%,准确性试验平均回收率98.2%,RSD为9.0%,符合生物制品质量检验方法要求。结论本研究制定的实验方法准确、可靠,适用于注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测。     

重组人源中期因子生物活性测定方法的建立与验证

建立和优化重组人源中期因子(recombinant human midkine, rhMK)活性检测方法,并对其方法进行验证。本文采用细胞计数试剂盒-8 (cell counting kit-8, cck-8)法检测rhMK作用大鼠膝软骨细胞的促增殖活性,并对方法进行专属性、准确性、精密性、线性、耐用性验证。RhMK的缓冲液及重组人源白介素-1受体拮抗剂无明显活性效力,该方法专属性良好;相对活性为50%、75%、100%、125%、150%的样品效价回收率(n=6)统计在80.0%～124.0%之间,各相对效价的相对标准偏差均在20%以内,线性相关系数R²≥0.98,表明方法的准确性、精密性、线性均良好;耐用性相关系数R²≥0.92,量效曲线的最大值与最小值的比值≥1.5,方法的耐用性良好。研究建立的rhMK的生物学活性检测方法,其方法验证良好,为rhMK开发过程中常规样品的生物学活性分析提供了可靠的检测方法。本研究已获得上海南方模式生物科技股份有限公司动物看护与使用委员会批准(批准号:2019-0008-06)。     

In-cell Western法测定人胰岛素生物学活性

目的:利用in-cell Western(ICW)技术研究基于转基因细胞的人胰岛素生物学活性测定方法。方法:以CHO-INSR B1284为靶细胞，用不同浓度的人胰岛素刺激靶细胞，采用ICW技术检测人胰岛素受体酪氨酸磷酸化水平，进行人胰岛素的体外生物学活性测定；根据《中华人民共和国药典》2020年版通则9401“生物制品生物活性/效价测定方法”对该方法进行专属性、相对准确度、中间精密度、线性与范围等方法学验证；以重组人胰岛素国家标准品为参比品，采用本方法测定人胰岛素原料药及其他人胰岛素类似物的生物学活性相对效价。结果:不同浓度的人胰岛素作用于CHO-INSR B1284细胞后具有较好的剂量依赖性；5个效价浓度的待测品经8次测定，相对效价的几何均值分别为：(63.76±4.38)%,(78.01±5.97)%,(99.52±4.62)%,(122.84±7.4)%,(151.71±8.81)%,相对偏倚均在±5%范围内，对应的几何变异系数(GCV,%)均<11%,GCV的置信上限均<20%;采用该方法能有效检测人胰岛素及其胰岛素类似物的效价。结论:利用ICW技术的人胰岛素体外...     

AlphaLISA方法测定抗白介素-17受体单抗生物学活性

目的：利用AlphaLISA方法建立抗白介素-17受体单抗的生物学活性测定方法。方法：以人包皮成纤维细胞系作为靶细胞,通过AlphaLISA检测系统建立抗IL-17R单抗的生物学活性测定方法,根据四参数拟合分析计算抗IL-17R单抗的相对效价,并对该方法进行了验证。结果：抗IL-17R单抗在该方法中存在量效关系,并且符合四参数方程：y=（A-D）/[1+（x/C）^B]+D。6批抗IL-17R单抗经3次测定,相对效价平均值在（84.93±3.12）%~（107.51±1.66）%,相对标准偏差小于5%。2批回收率样品经3次测定,回收率分别为（100.66±13.65）%和（115.69±3.85）%。结论：本研究利用AlphaLISA方法在国内首次成功建立重复性好、准确性高的抗IL-17R单抗的生物学活性测定方法。     

抗白介素-13单克隆抗体生物学活性测定方法的建立

目的:建立抗白介素-13单克隆抗体(抗IL-13单抗)的生物学活性检测方法.方法:利用L-BEAS-2B细胞系,通过荧光素酶检测系统进行抗IL-13单抗的生物学活性检测,通过抗IL-13单抗参比品与样品对比以平行线分析的方法计算样品相对百分效价,并对该方法的精密性和准确性进行验证.结果:抗IL-13单-抗在该方法中存在...     

时间分辨荧光免疫分析法测定人胰岛素生物学活性

目的:利用时间分辨荧光免疫分析系统建立人胰岛素基于转基因细胞的生物学活性检测方法。方法:以CHO-INSRB1284转基因细胞2.5×10~5个·mL^-1作为靶细胞,以400 pmol·mL^-1作为初始浓度对人胰岛素进行3倍系列稀释,随后药物与靶细胞作用20 min,通过时间分辨荧光免疫分析系统,进行生物学活性检测,对该方法进行关键参数的优化,并依据2020年版《中华人民共和国药典》四部通则9401和ICH指导原则Q2(R1)、Q6B进行验证。结果:人胰岛素在本方法中存在良好的量效关系,符合四参数方程：y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D。本方法专属性强,5个效价水平(64%、80%、100%、125%及156%)的相对生物学活性(n=8)的几何平均值分别为(55.8±2.06)%、(82.1±5.52)%、(94.4±5.46)%、(121.4±5.94)%、(154.4±8.37)%,相对偏倚及其90%置信区间分别为-12.8%(-16.3%,-9.9%)、2.6%(-4.4%,9.5%)、-5.6%(-11.2%,-0.3%)、-2...     

ActR Ⅱ B-Fc融合蛋白生物学活性测定方法的建立

目的:建立ActR ⅡB-Fc融合蛋白的生物学活性检测方法.方法:利用A204-CAGA12-LUC细胞系,通过荧光素酶检测系统进行ActR ⅡB-Fc融合蛋白的生物学活性检测,根据四参数拟合分析计算样品相对效价,并对该方法的专属性、精密性和准确性进行验证.结果:ActR ⅡB-Fc融合蛋白在该方法中存在量效关系,且符...     

基于报告基因的抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性测定方法的建立

利用Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa转基因细胞系作为效应细胞,WIL2-S细胞系作为靶细胞,通过荧光素酶检测系统(Bio GloTM Luciferase Assay System)进行抗CD20单抗的ADCC生物学活性检测,并对实验条件进行优化及方法学验证。结果显示抗CD20单抗在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程式:y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D。方法经优化确定靶细胞为WIL2-S细胞,抗体稀释浓度为18 000 ng·m L-1,1∶5倍的稀释倍数,效靶比为6∶1,诱导时间为6 h。该方法具有良好的专属性,8次独立实验的回归分析、线性及平行性均通过统计学检验;4个不同稀释组回收率样本经3次测定,相对效价分别为(44.39±3.93)%、(72.74±2.78)%、(128.28±7.01)%和(168.19±2.70)%,变异系数均小于10%,对应回收率分别为(88.78±7.85)%、(96.99±3.70)%、(102.63±5.61)%和(112.12±1.80)%。本研究利用转基因细胞法成功建立抗CD20单抗ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强、重复性好,准确性高,可作为抗CD20单抗ADCC生物学活性的常规检测方法。     

重组人淋巴毒素α衍生物活性测定国家标准品的研制

目的:建立重组人淋巴毒素α衍生物(rhLT α)生物学活性测定用国家标准品.方法:标准品按WHO重组细胞因子要求制备、检测,采用L929细胞毒法测定rhLT α的生物学活性,并以NBSB提供的国际标准品为标准,由2家实验室对rhITα国家标准品的效价进行协作标定.结果:rhLT α国家标准品经检定各项指标均符合要求,效价协作标定结果经统计学分析,均数的95%可信区间为4.21×104～4.52×104IU/支,单次测定的95%标准值范围为3.07×104～6.19×104IU/支.这批国家标准品效价确定为4.40×104IU/支.加速热稳定性实验表明活性在-20℃,4℃,25℃条件下20个月保持稳定.结论:该批rhLTα经协作标定,质量可靠,效价稳定,可作国家标准品使用.     

活血化瘀类中药生物效价检测方法的建立

目的中药质量控制一直是中药现代化的重点和难点,随着中药国际化的进程,FDA也明确提出植物药申报时需提供适于质量一致性评价的生物效价(Bioassay)方法。目前,国际上获批的生物效价方法以均是以计算待测物与标准物质(同质物质)的相对效价值表示,由于中药成分复杂,很难找到同质物质作为标准物质使用,因此目前尚未有复方中药开发相对生物效价方法的报道。本课题组尝试选择适当的中药有效成分为标准物质,以效应曲线的斜率比为计算方法,建立相对生物效价检测方法,拟用于活血化瘀类中药质量生物控制。方法依据美国FDA最新颁布的《Botanical Drug Development Guidance for Industry》中对植物药生物效价研究提出的要求,针对活血化瘀药物多数具有的抗血小板聚集的作用机制,建立家兔体外抗血小板聚集检测方法,参照USP39中对方法学开发及方法学验证的要点要求,选择纯度高、来源稳定且具有较好的抗血小板聚集活性的中药活性成分丹酚酸B作为标准物质建立相对效价测定方法,并且从线性与范围、重复性、精密度及准确度四个方面对方法进行系统考察。同时开展了第三方实验室的验证研究,对方法的可推广性进行了评估。结果以LOG(剂量)为X轴,抑制率为Y轴,绘制标准物质丹酚酸B量效曲线,显示其呈现较好的线性关系。(y=0.8262x+0.0189,R2=0.9901),重复性考察RSD=11.9%,日内精密度为10.53%,日间精密度为10.58%,准确度考察,检测丹酚酸B的相对效价值,结果显示6次测定的效价值为1.083±0.129,测定准确度为8.3%,方法满足美国药典USP39以及CFDA颁布的《生物制品质量控制分析方法验证技术一般原则》中对离体效价实验方法对精密度的要求,方法通过验证。将方法推广应用,委托第三方实验室采用该方法对同一检测样本进行检测,检测结果实验室间无统计学差异,提示该方法具有较好的实验室间重现性。两家机构结果均显示加速过期样品效价值较提取物效价值有明显降低(P<0.01),证明方法有较好的区分性。结论经方法优化及方法学验证,所建立的抗血小板聚集生物效价检测方法与活血化瘀作用机制相关,与标准物质丹酚酸B计算出的相对效价值具有较好的精密度、准确度和重现性,可作为生物检测方法,用于活血化瘀类中药的质量控制。     

肝水解肽体外活性测定方法的探讨研究

目的:建立肝水解肽体外生物学活性测定方法。方法:将不同浓度肝水解肽作用于正常人肝L02细胞,WST-8比色法测定L02细胞增殖情况。同时对实验条件,包括稀释液、细胞接种密度、药物作用时间等进行探讨,建立肝水解肽体外活性测定方法,并用该方法对2个厂家生产的2批产品进行活性检测。结果:获得了比较稳定可靠的实验参数:稀释液为RPMI-1640培养液,细胞接种密度为4.0×104个.mL-1,药物作用时间为48～72 h,肝水解肽浓度为0.5,0.25,0.12,0.06,0.03,0.015 mg.mL-1。由这些实验参数建立了肝水解肽活性测定方法。用该方法检测的2批产品活性均合格,重复实验3次,每次实验结果均一致,RSD均低于10%。结论:该方法可用于肝水解肽体外生物学活性测定。     

缩宫素注射液效价测定的不确定度评定

目的:建立缩宫素注射液效价测定的不确定度评定方法。方法:建立评定缩宫素注射液效价测定的不确定度的数学模型,分析其测定不确定度的影响因素,并将由之引起的不确定度分量进行量化分析,计算扩展不确定度。结果:缩宫素注射液效价测定的扩展不确定度为0.20 u/ml,其效价可表示为(9.29±0.20)u/ml,包含因子K=2。结论:该方法适用于缩宫素注射液效价测定的不确定度评定。     

注射用尿促性素黄体生成素效价测定的不确定度评价

摘要：目的:建立注射用尿促性素黄体生成素效价测定的不确定度评定方法。方法:通过建立评定注射用尿促性素黄体生成素效价测定不确定度的数学模型,分析其测定不确定的影响因素,并将各不确定度的分量进行量化分析,计算扩展不确定度。结果:注射用尿促性素黄体生成素效价测定的扩展不确定度为10.56%,其效价可表示为105.79%±10.56%（k=2）。结论:该方法适用于注射用尿促性素黄体生成素效价测定的不确定度评定。     

微生物法测定威替米星原料药和注射液的效价

目的:建立测定威替米星效价的方法并用于其原料药及注射液的质量控制。方法:以短小芽孢杆菌作为试验菌种,采用二剂量法测定威替米星的效价,并对其原料药及2种规格的注射液各3批样品进行了测定。结果:按生物检定统计法进行可靠性测验,结果显示效价测定结果可信限率均小于5%。结论:本法可以用于威替米星原料药及注射液的效价测定。     

血凝酶效价测定新方法的方法学研究

目的：本研究提供了一种新的血凝酶效价测定的方法。方法:采用凝血质控血浆为底物,以凝血分析仪进行测定,利用血凝酶可以直接水解血浆中纤维蛋白原为纤维蛋白使血浆凝固,并且在一定血凝酶浓度范围内,血浆的凝固时间与血凝酶效价成反比的原理,测得血凝酶效价。结果:本方法对血凝酶的精密度的相对标准偏差为2.3%,准确度的相对标准偏差在4.1%～4.8%之间,定量线性范围为0.4U.mL-1～2.5 U.mL-1,并具有良好的专属性和耐用性,通过市售3个规格9批次注射用矛头蝮蛇血凝酶效价测定,能够较好的控制产品的效价。结论:本研究避免了检验人对凝固终点判定标准的不同和人-枸缘酸血浆存在的差异,所导致产品之间效价存在的差异,实现血凝酶高效、准确的测定。     

报告基因法测定重组人白细胞介素-2产品生物学活性的研究

目的:建立测定重组人白介素-2(recombinant human interleukin-2, rhIL-2)制品生物学活性的报告基因法(reporter gene assay, RGA)。方法:根据ICH Q2和《中华人民共和国药典》 2020年版指导原则,构建慢病毒转染表达荧光素酶(luciferase, Luc)的C8166细胞,进行rhIL-2生物学活性测定方法学优化与验证,优化内容包括孵育时间、细胞数量、待测样品的初始浓度和稀释比例;验证内容包括特异性、线性和准确性、精密度和耐用性。结果:优化后的检测条件为：孵育时间为24 h;细胞接种密度为1×10⁵细胞·孔^-1;待测样品以10 000 IU·mL^-1为起始浓度1∶3稀释10个梯度。荧光信号值强度与待测样品浓度拟合四参数曲线,计算相对效价。选用不同作用类型的细胞因子进行特异性验证均符合应用要求。采用50%,75%,100%,125%和150%的5个浓度点验证线性和部分准确性,实测与理论效价线性回归分析相关系数R²=0.993 1,各浓度...     

利用实验设计优化和建立抗CD38单克隆抗体ADCP生物学活性测定方法

利用实验设计(design of experiment,DoE)方法建立抗CD38单抗(monoclonal antibody,mAb)的抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis,ADCP)生物学活性检测方法。以Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ转基因细胞系作为效应细胞,Daudi细胞系作为靶细胞,通过荧光素酶检测系统(BrightGlo^TMLucifer‐ase Assay system)检测抗CD38单抗的ADCP生物学活性,并运用DoE方法进行实验参数优化。结果显示,抗CD38单抗在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)~B]+D,方法经统计学实验设计对多个实验参数进行筛选和优化,确定抗体工作浓度为800～20.81 ng·mL^-1,靶细胞和效应细胞的接种量分别为每孔7.5×10~4和2.5×10~4个,诱导时间为6 h。该方法具有良好的专属性;5个不同组回收率样本经3次检测,相对效价分别为(59.97±4.74)%...     

基于报告基因的重组人促卵泡激素Fc融合蛋白生物学活性测定方法研究

目的:利用转基因细胞法建立重组人促卵泡激素Fc融合蛋白(rhFSH-Fc)生物学活性检测方法。方法:利用CHO-K1-FSHR-CRE-Luc转基因细胞,按一定细胞密度种板,培养16～20 h后吸弃培养基,将rhFSH-Fc倍比稀释加入细胞板,药物作用一段时间后加入荧光素酶检测试剂,通过荧光素酶检测系统对rhFSH-Fc进行生物性活性检测,并对各试验条件参数优化及进行方法学验证。结果:rhFSH-Fc在该方法中存在量效关系且符合四参数曲线方程,R~2大于0.99;方法优化后确定细胞种板密度为5×10~5个·mL^-1,rhFSH-Fc稀释起始浓度为750 ng·mL^-1,1∶5倍的稀释倍数,诱导时间为4 h,样品稀释液为DMEM/F12K+10%FBS。该方法具有良好的专属性,9次独立日间、日内精密度检测RSD均小于5%,5个不同稀释组回收率样本经6次测定,相对效价分别为(51±2.00)%、(78±2.05)%、(94±2.23)%、(124±3.46)%、(141±4.45)%;对应回收率平均值分别为(101±3.94)%、(104±3.0...     

浊度法测定氯霉素注射液的效价

目的建立浊度法测定氯霉素注射液的效价。方法以金黄色葡萄球菌为实验菌,加菌量0.6%,37℃培养3～4h测定。结果抗生素线性浓度范围为5.0～15.3U/mL,r=0.9980,平均回收率为99.2%(n=9),RSD为1.8%。结论本方法具有简便,快速,精确的特点,测定氯霉素注射液效价优于管碟法。