膝关节腔内培养骨髓间充质干细胞复合脱钙骨的组织工程软骨

背景：如何更好地以组织工程学方法修复关节软骨缺损并达到良好的远期疗效目前尚无公识。 目的：创新性地在膝关节腔内培养兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨的组织工程软骨。  方法：采用全骨髓贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞,DMEM/F12完全培养基培养,成软骨诱导条件培养基诱导分化。取同种异体兔的髂骨和椎体骨制作成脱钙骨支架,诱导后的骨髓间充质干细胞种植于脱钙骨支架上,培养1 d后将细胞-支架复合物用筋膜包裹置于兔左膝关节腔内培养,单纯脱钙骨支架筋膜包裹置入右膝关节腔。于培养第4,8,12周分别取材,行大体观察并制成石蜡切片,采用苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色,Ⅱ型胶原免疫组化染色方法进行组织学观察。 结果与结论：培养4,8周,细胞-支架组标本Ⅱ型胶原免疫组化的平均吸光度值(A)分别为0.263±0.031,0.340±0.052,单纯支架组标本分别为0.147±0.027,0.165±0.030,两组比较差异有显著性意义(P < 0.05);培养12周细胞-支架组标本Ⅱ型胶原免疫组化A值平均为0.362±0.037,标本类似正常软骨外观,Ⅱ型胶原免疫组化反应呈阳性;而单纯支架组脱钙骨支架降解。培养12周细胞-支架组苏木精-伊红染色结果显示细胞数量多,脱钙骨支架基本被吸收;而甲苯胺蓝染色结果显示有被染成紫红色的异染性基质形成。结果提示兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨可在兔膝关节腔内培养出组织工程软骨。     

力学刺激提高生物3D打印软骨构建物基质的形成

背景：基质分泌不均匀、力学强度不足是影响组织工程构建物在体内形成效果的重要因素,力学刺激是促进细胞外基质分泌的有效手段。目的：探索3D生物打印复合支架在力学加压环境下的生物学表现。方法：采用3D生物打印技术制备软骨细胞-甲基丙烯酰胺基明胶复合支架,活死染色观察细胞存活情况。将复合支架置于力学加压生物反应器中进行加压培养,以6孔板中不加压培养的复合支架为对照,活死染色观察细胞存活情况,组织学染色观察复合支架体外软骨形成情况,qRT-PCR检测成软骨相关基因mRNA的相对表达量。将加压与不加压复合支架分别植入裸鼠皮下,5周后取材,组织学观察软骨形成情况。结果与结论：(1)复合支架外观呈现清晰的网格状结构,体外培养1,4,7 d时,支架形态稳定、结构清晰,细胞存活率均在90%以上;(2)培养2周后,加压组复合支架中的细胞存活率低于不加压组(P <0.05);苏木精-伊红染色显示两组复合支架均有明显的软骨陷窝结构,细胞在材料中分布较均匀,加压组复合支架的材料间空隙内有更多新生软骨组织形成;番红O染色显示两组均可见红色软骨基质形成,加压组细胞周基质染色更深;Ⅰ型胶原免疫组织化学染色显示,加...     

同种异体气管软骨脱细胞基质构建组织工程化气管的初步研究

目的 初步探寻同种异体气管软骨脱细胞基质与向软骨诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)共同构建组织工程化气管的可行性.方法 分离并诱导宿主犬MSCs向软骨细胞分化,通过内蛋白多糖含量测量及Ⅱ型胶原免疫组化染色观察初步诱导效果.使用曲拉通化学消化法对供体犬气管软骨进行脱细胞处理,根据消化时间分组,观察气管软骨脱细胞基质制备效果.将诱导后MSCs与同种异体气管软骨脱细胞基质分别进行体外与体内复合培养,组织学及电镜下观察诱导细胞的生长情况,以进行构建组织工程化气管可行性初步分析.结果 宿主犬MSCs软骨方向诱导后诱导组细胞培养液内蛋白多糖含量为(42.48±2.32)μg/ml,较未诱导组(19.62±1.30)μg/ml明显增高(p<0.01),诱导组细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.HE染色及扫描电镜均可见120小时组供体犬气管组织黏膜细胞及软骨细胞完全消失,软骨基质结构完整.体外联合培养7天内可见诱导后MSCs在脱细胞软骨基质表面生长,14天时细胞逐渐凋亡;体内联合培养可见诱导细胞在软骨基质浅层生长,但基质内部未见细胞成分生长,并无新生软骨形成.结论 使用曲拉通化学消化法可成功制备结构完整的同种异体气管软骨脱细胞基质,但作为构建组织工程化气管的支架材料,其空隙率和贯通性仍需进一步改进.     

组织工程软骨与柚皮苷联合修复兔膝关节软骨缺损的组织学证实

背景：目前临床上虽有多种方法用于治疗软骨缺损,但没有从根本上解决关节软骨缺损修复问题。 目的：通过组织学研究进一步评价柚皮苷结合组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的效果。 方法：取兔骨髓间充质干细胞体外增殖后,复合于改建后的脱细胞真皮基质载体上,制成组织工程软骨,植入到兔膝关节软骨缺损,并以柚皮苷汤灌胃,于 4,8周后分别对修复组织进行苏木精-伊红、Masson三色染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原染色、Ⅹ型胶原染色等组织学检查。 结果与结论：术后8周, 柚皮苷结合干细胞复合体组缺损处修复组织变成乳白色,半透明光滑组织,缺损修复组织与周围正常软骨已基本难区分,表面光滑。组织学检查发现修复缺损处基本为新生软骨填充。结果证实,柚皮苷结合组织工程软骨能提高家兔膝关节软骨缺损的修复质量。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

三维支架中骨髓间充质干细胞及软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞的成软骨效应

背景:软骨修复的关键是种子细胞在三维支架中的定向分化,但细胞放入三维支架中很难有透明软骨表现。目的:考察3种种子骨髓间充质干细胞,软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞在支架中的成软骨特性。方法:抽取羊骨髓,胰酶消化后获得原代骨髓间充质干细胞细胞、软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞,单层培养扩增。取P1骨髓间充质干细胞,P3软骨细胞和P3脂肪源性成熟基质细胞种植入不同比例(10%,20%,50%,80%,100%)的胶原/透明质酸支架中,在无血清培养液中三维培养。2周后,用SO染色和免疫组织化学染色分析,观察硫酸软骨素和Ⅱ型胶原合成情况。结果与结论:种子细胞在三维支架中特定条件下有成软骨效应,骨髓间充质干细胞在含20%透明质酸的胶原/透明质酸支架扩增少于3代有成软骨效应,软骨细胞传代数更高仍然有成软骨效应,但脂肪源性成熟基质细胞成软骨效应能力较弱。结果提示,在同样条件下骨髓间充质干细胞、软骨细胞较脂肪源性成熟基质细胞有更好的成软骨性能。     

同种异体脱钙骨与骨髓间充质干细胞关节腔内共培养:与同腔软骨性状的对比

背景:临床发现膝关节内游离体能长期存在于关节腔内并能保持一定的软骨组织学特性和生理学特性,因此大胆提出假设:关节腔环境可能是软骨细胞生长、发育的较佳环境并提出"腔内培养,腔内移植"的理念。目的:观察兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨基质体外培养或关节腔内培养组织工程软骨与同腔软骨的性状差异。方法:实验分3组进行,体外培养组将经成软骨诱导的乳兔骨髓间充质干细胞与成年兔脱钙骨基质体外复合培养;腔内培养组将经成软骨诱导的乳兔骨髓间充质干细胞与成年兔脱钙骨基质以筋膜包裹,复合培养于成年新西兰兔膝关节腔内,以同腔内正常软骨为对照。结果与结论:培养12周后:①体外培养组苏木精-伊红染色见软骨细胞少量增生,胞核蓝染;甲苯胺蓝染色见软骨细胞排列无序,少量周围基质包绕;Masson染色阳性区域小,细胞排列无序;Ⅱ型胶原免疫组织化学见软骨细胞胞浆及胞外基质少量黄色颗粒。②腔内培养组苏木精-伊红染色见软骨细胞增生,胞核蓝染;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,软骨陷窝形成,周围基质包绕;Masson染色阳性,软骨细胞多,基质蓝染,按一定应力方向排列;Ⅱ型胶原免疫组织化学见细胞外基质中出现较多棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色阳性。说明骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质复合物可在体外及膝关节腔内培养出组织工程软骨,关节腔内培养的软骨比体外培养的软骨更接近正常软骨。     

兔骨髓间充质干细胞与异体脱细胞耳软骨支架的体外复合*

背景：耳软骨作为脱细胞基质可选择的支架,进行脱细胞处理可去除了软骨细胞的抗原性,从而与种子细胞具有良好的相容性。 目的：体外提取、培养兔骨髓基质干细胞,并与异体脱细胞耳软骨支架复合,观察其生物相容性。 方法：提取兔骨髓间充质干细胞行体外培养,诱导为软骨细胞,以胰蛋白酶-曲拉通联合法获得脱细胞软骨支架,将两者于体外复合,10 d后复合支架固定行组织学染色及扫描电镜观察。 结果与结论：兔骨髓间充质干细胞体外诱导14 d可形成软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞化学示胞浆呈棕黄色;兔耳软骨脱细胞基质呈乳白色,组织学染色及扫描电镜观察示经脱细胞后支架孔隙均匀,结构完整,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分。其孔径长度(33.70±4.33) μm,孔隙率(65.23±7.35)%。 复合支架组织学染色及扫描电镜示两者黏附良好,并伴有多量基质分泌。说明兔骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞与异体脱细胞耳软骨有良好的生物相容性。     

脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化骨软骨支架的制备及其生物相容性的研究

目的成功制备脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化骨软骨支架,并进行理化性质、生物力学与生物相容性评估,为骨软骨缺损修复提供理论依据。方法以物理和化学方法制备牛源脱细胞真皮基质,利用磷酸三钙和胶原,按照不同比例混合,利用自组装和冻干技术,制备以脱细胞真皮基质支架为软骨层,生物矿化胶原为骨层的骨软骨一体化双相支架。通过大体观察、扫描电镜观察、生物力学等检测,对骨软骨一体化支架进行理化性质和力学性能评价。原代培养小鼠软骨细胞和成骨细胞,并分别种植在脱细胞真皮基质和生物矿化胶原双相支架上,利用细胞毒、死/活细胞染色和增殖实验等观察细胞生长情况,测定骨软骨一体化支架的生物相容性。结果大体观察表明支架各层间结合紧密,未出现明显不连续和相互分离。扫描电镜各层内的孔隙结构相互连通且均具有立体多维性,其中脱细胞真皮基质、生物矿化胶原和双相支架的孔径分别为(121.6±8.65)、(98.40±5.56)和(103.2±3.94)μm。同时三组支架的压缩模量分别为(41.05±11.69)、(108.0±12.71)和(84.98±8.51)k Pa,弹性模量分别为(17.24±3.93)、(28.98±3.31)和(21.74±2.92)k Pa。MTT法表明骨软骨一体化支架无细胞毒性。荧光显微镜观察显示,纵切的支架薄片上细胞生长分布均匀,表明支架生物相容性较好,CCK8实验表明支架可以维持良好的细胞活性。结论脱细胞真皮基质/生物矿化胶原骨双相支架中上下层间的理化性能展示了骨软骨组织结构和力学方面的双重仿生,为动物体内实验奠定了基础,有望成为治疗骨软骨缺损修复的一种新手段。     

脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养关节腔内的成软骨活性

背景：将骨髓间充质干细胞附着到支架材料上再植入关节软骨缺损处,细胞不但不消失,而且可形成新的软骨。 目的：观察同种异体脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养在关节内的成软骨活性。 方法：在54只青紫蓝兔单侧膝关节制作关节软骨全层缺损模型,随机分组：实验组在缺损处植入自体骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质复合物,对照组缺损处仅植入同种异体脱钙骨基质,空白对照组未植入任何物质。 结果与结论：植入后12周,实验组缺损处修复组织呈软骨样,表面光滑平坦,与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟,修复组织与软骨下骨结合牢固;修复组织的细胞为透明软骨样细胞,柱状排列,Ⅱ型胶原染色阳性,与周围软骨及软骨下骨整合良好,且实验组组织学评分优于对照组和空白对照组 (P < 0.01)。对照组缺损处修复组织呈纤维样,与周围软骨未结合,空白对照组缺损区无修复组织,两组均无Ⅱ型胶原染色阳性表达。表明同种异体脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养后植入膝关节可形成软骨样组织,有效修复关节软骨缺损。     

骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化

背景：用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论。鉴于此,课题组提出“同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨”的实验设技。 目的：同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组：实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子。比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况。制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养。分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析。 结果与结论：实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组(u=3.326,P < 0.01)。实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞。组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性。提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨。同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求。     

基质金属蛋白酶和胶原在创伤关节软骨组织中的表达

背景：研究发现,基质金属蛋白酶和胶原参与关节软骨组织机体生理重建及病理破坏。 目的：观察膝关节骨软骨缺损及表面软骨缺损动物模型关节软骨组织中胶原及基质金属蛋白酶的表达变化。 方法：雌性SD大鼠48只随机分为3组：骨软骨缺损组在双膝关节制作骨软骨缺损模型,表面缺损组在双膝关节制作表面软骨缺损,对照组双膝关节制作关节囊切开。分别于术后4、8、12周取股骨髁标本,行苏木精-伊红染色,免疫组化检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶3的表达。 结果与结论：骨软骨缺损组术后4周缺损中有少量新生组织生成,8及12周可见到纤维组织填充,修复组织细胞外基质Ⅰ型胶原免疫组化染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阴性,关节软骨组织中基质金属蛋白酶3表达增高。表面缺损组表面软骨缺损4及8周未见修复迹象,12周可见微量纤维组织填充,细胞外基质Ⅰ型胶原免疫组化染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阴性,术后表面缺损组关节软骨组织基质金属蛋白酶3表达增高。对照组关节软骨组织Ⅰ型胶原免疫组化染色阴性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,基质金属蛋白酶3低表达,无形态学异常改变。说明机械性损伤可以导致关节软骨细胞外基质成分发生改变,丧失其原有的生物学特性而退变,基质金属蛋白酶3在损伤后的软骨组织中表达增高,使细胞外基质的降解增加,是导致关节软骨退变的重要因素。     

人脱细胞软骨细胞外基质对异种软骨种子细胞的影响

目的观察人脱细胞软骨细胞外基质(hACAM)对异种兔软骨种子细胞增殖和表型的影响。方法将差速梯度离心法制作的人脱细胞软骨细胞外基质,配制成0.5%的浆料,分别铺于6孔细胞培养板和96孔细胞培养板,形成1 mm厚的薄膜,以此培养板为实验组。空白对照组培养板仅使用单纯培养液培养。在培养板上培养兔关节软骨细胞。通过hochest33258染色验证人软骨细胞外基质脱细胞完全与否;分别在第5、15天两个时间点,通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色观察两种培养方法的兔软骨细胞的生长形态、细胞表型和增殖情况,用CCK-8细胞增殖实验比较两种培养方法在第1、3、7、10天的增殖情况。结果通过hochest33258染色发现差速梯度离心的人软骨细胞外基质脱细胞完全。通过倒置显微镜观察第5和15天的实验组细胞增殖情况优于空白对照组,甲苯胺蓝染色的结果也证明这个观点;CCK-8细胞增殖试验显示第7天hACAM组在细胞增殖方面明显地优于单纯培养液的对照组(P=0.0298),hACAM组的软骨细胞与空白组的软骨细胞在第10天的增殖情况相比没有统计学差异。结论 hACAM免疫原性低,无细胞毒性,能够很好地促进异种软骨细胞的增殖。     

基底膜基质/壳聚糖诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化

背景：课题组前期研究发现基底膜基质能够定向诱导骨髓间充质干细胞向软骨方向分化,但其力学性能与实际应用有较大差距,还需要进一步研究。 目的：制备兼具适宜力学性能和优异生物相容性的壳聚糖/基底膜基质水凝胶支架用于软骨修复。 方法：以京尼平为交联剂,将壳聚糖溶液与基底膜基质按2︰1,1︰1,1︰3比例混合制成水凝胶,接种大鼠骨髓间充质干细胞,培养14 d。经材料力学测试、细胞增殖、活细胞染色、酶联免疫吸附测试以及阿尔新蓝染色等方法评价材料诱导细胞成软骨分化能力。 结果与结论：在基底膜基质内添加壳聚糖后,材料力学性能从0.48 kPa上升到1.78 kPa。标志性蛋白分泌结果显示,纯壳聚糖组早期诱导成软骨活性高于其他组,但后期诱导能力减弱,而含基底膜基质各组在后期能够保持较好的诱导活性,其中壳聚糖/基底膜基质=1︰1组材料具有一定的力学强度,且Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原的表达量在14 d较其他组高。结果表明实验制备的壳聚糖/基底膜基质水凝胶具有良好的力学性能,并能够促进骨髓间充质干细胞向软骨方向分化,可用于软骨组织工程研究。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

大鼠来源滑膜间充质干细胞的成软骨分化

背景:相比其他组织来源的间充质干细胞,滑膜间充质干细胞有着较强的成软骨特性和克隆能力,因此将是软骨组织工程中最有前景的种子细胞之一。目的:培养及体外扩增SD大鼠滑膜间充质干细胞,鉴定其多向分化潜能及在添加生长因子后三维立体培养条件下的成软骨能力。方法:无菌条件下获取SD大鼠滑膜组织,Ⅰ型胶原酶消化法分离大鼠滑膜间充质干细胞。体外扩增、培养,取第3代滑膜间充质干细胞进行吉姆萨、生长曲线测定、成脂诱导、成骨诱导和三维条件下成软骨诱导,成软骨诱导21 d后通过甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色及RT-PCR对成软骨诱导后产物进行检测。结果与结论:获取的大鼠滑膜细胞具有间充质干细胞的特性,滑膜间充质干细胞在体外培养呈成纤维样形态,并维持着多向分化的能力。使用生长因子诱导软骨细胞21 d后,可见软骨样组织,蛋白聚糖和Ⅱ型胶原可以在甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色后被检测到。RT-PCR检测结果显示软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA呈阳性表达。提示大鼠来源的滑膜间充质干细胞具有成软骨能力。     

脱细胞基质软骨支架的制备

背景：脱细胞基质材料去除了天然材料中的细胞成分,保留了基质成分,有效降低了天然材料的免疫原性,同时能够保持材料的机械强度。 目的：拟利用洗脱方法去除兔肋软骨中的细胞基质,制备天然生物支架材料。 方法：取新西兰大白兔肋软骨,清除周围组织后随机分组处理,以未经处理的肋软骨作为正常对照组;48 h处理组以去污剂-酶化学消化48 h;96 h处理组以去污剂-酶化学消化96 h,3组均通过苏木精-伊红染色及电镜观察脱细胞效果。同时收集诱导第7天的兔骨髓间充质干细胞3×109 L-1,与同种异体肋软骨脱细胞基质体外复合培养,于第3,7天取复合物行电镜观察细胞在脱细胞基质表面的黏附生长情况。 结果与结论：新鲜肋软骨标本每个软骨陷窝内均有排列紧密的二三个软骨细胞,去污剂-酶化学消化后软骨陷窝内的细胞逐渐脱失,至消化处理96 h后,软骨陷窝内的细胞完全脱失。共培养第3天时,脱细胞基质表面有大量骨髓间充质干细胞分布,细胞为多角形,有伪足伸出,锚定在基质表面,部分区域可见细胞在基质表面增殖分裂;第7天时,脱细胞基质表面大部分均为细胞覆盖,细胞呈扁平状,有多个足突充分伸展,细胞之间互相连接,分泌大量细胞外基质沉积在基质表面,呈冰霜样改变,表明制备的脱细胞基质具有良好的细胞相容性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程全文链接：     

鹿茸多肽诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨表型的分化

背景：实验证实鹿茸多肽可以促进体外培养软骨细胞的增殖和细胞外基质糖胺多糖、Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白的表达。 目的：通过对体外培养的兔骨髓间充质干细胞在特定培养液作用下向软骨细胞表型分化的研究,探讨鹿茸多肽对其软骨分化的影响。 方法：将第3代兔骨髓间充质干细胞随机分为空白对照组、诱导组、鹿茸多肽组,分别采用普通培养液、诱导培养液、含10 mg/L鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养;并取兔的关节软骨细胞作为关节软骨组。分别于1,2,3周后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的观察。 结果与结论：空白对照组培养2周后,细胞团块逐渐崩解,无法进行苏木精-伊红染色。诱导组、鹿茸多肽组细胞团块除有轻度收缩外,呈白色半透明状;苏木精-伊红染色发现部分细胞为圆形或卵圆形,表层细胞密度大;诱导组、鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达随培养时间延长而增多,各时间点诱导组、鹿茸多肽组含量均高于空白对照组(P < 0.05);各时间点鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达均高于诱导组,但低于关节软骨组 (P< 0.05)。提示骨髓间充质干细胞在特定培养条件下能向软骨细胞表型分化,且鹿茸多肽对其定向软骨分化有明显促进作用。虽然在体外可以构建出软骨组织,但其与关节软骨质量相比仍有很大差距。     

软骨脱细胞细胞外基质多孔支架与山羊髓核细胞生物相容性研究

目的 制备软骨脱细胞细胞外基质多孔支架,并探讨其与山羊髓核细胞的生物相容性.方法 猪关节软骨经研磨、脱细胞、冷冻干燥技术等处理制成三维多孔支架;从山羊腰椎间盘中分离出髓核细胞,培养后获取P1代细胞;四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测支架浸提液毒性;将髓核细胞以5×106/ml的密度接种在支架上体外培养48 h,通过倒置显微镜、HE染色、死活细胞染色(LIVE/DEAD染色)、扫描电镜观察细胞在支架上的黏附及活性.结果 软骨脱细胞基质多孔支架在敷水状态下光滑透明,分离的髓核细胞呈典型的软骨细胞样形态;MTT检测各组间增殖,其差异不具有统计学意义(P＞0.05);倒置显微镜、电镜观察髓核细胞呈球状或短梭形均匀地贴附在支架内部,HE染色观察可见髓核细胞均匀分布在支架内部,LIVE/DEAD染色显示全部为绿色荧光(活细胞),未见红色荧光(死细胞).结论 软骨脱细胞基质多孔支架在组成上与髓核组织相似,与山羊髓核细胞具有良好的生物相容性,可以作为髓核组织工程的支架材料.     

三维培养诱导人脂肪间充质干细胞微球的成软骨分化能力

背景：关节软骨损伤后修复结果不满意,需要新的手段,而脂肪间充质干细胞较适宜做种子细胞诱导软骨,然而怎么能够使诱导的软骨具有功能需要研究。 目的：采用三维培养体系诱导人脂肪间充质干细胞微球向软骨分化。 方法：无菌切取吸脂术后脂肪组织,分离培养人脂肪间充质干细胞,传至第3代进行流式细胞术分析,成骨成脂肪诱导等鉴定,同时也给予合适的培养条件用三维培养的方式向软骨细胞诱导,并行阿利辛蓝染色鉴定糖胺多糖的合成,苏木精-伊红染色进行组织学分析,免疫荧光检测Ⅱ型胶原表达,称质量测量软骨硬度。 结果与结论：分离的人脂肪间充质干细胞CD105,CD44,CD29均高表达,而 CD45,CD34低表达,并且成骨成脂诱导后细胞茜素红染色和油红O染色均为阳性。三维培养法诱导的软骨细胞可表达大量糖胺多糖及Ⅱ型胶原。结果证实,三维培养法诱导人脂肪间充质细胞向软骨分化后,具有软骨细胞的特性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

低氧对脂肪干细胞和关节软骨细胞三维共培养成软骨能力的影响

背景：多项体内外研究表明低氧和共培养均促进干细胞向软骨细胞方向分化。目的：观察低氧对脂肪干细胞和关节软骨细胞三维共培养成软骨能力的影响。方法：脂肪干细胞和关节软骨细胞二者按3∶1比例混合,以5×10¹⁰ L^-1接种于聚乳酸-羟基乙酸共聚物/明胶支架上,分别在常氧(体积分数为20% O₂)、低氧(体积分数为5% O₂)环境下培养6周。苏木精-伊红染色进行组织学分析,阿尔新蓝染色鉴定糖胺多糖的合成,免疫组化鉴定Ⅱ型胶原的表达,并测定各组支架-细胞复合物的DNA、糖胺聚糖、羟脯氨酸含量。结果与结论：低氧组苏木精-伊红染色显示大量细胞及细胞外基质生成,阿尔新蓝染色显示有大量糖胺多糖生成,免疫组化显示Ⅱ型胶原表达强阳性,且DNA、糖胺聚糖、羟脯氨酸等各项指标均高于常氧组。表明低氧促进脂肪干细胞和关节软骨细胞共培养成软骨分化。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

人脐带间充质干细胞复合脱细胞软骨细胞外基质取向支架修复山羊膝关节全层软骨缺损的实验研究

目的探索人脐带间充质干细胞复合脱细胞软骨细胞外基质取向支架构建组织工程软骨,用于修复山羊膝关节负重区全层软骨缺损的可行性。方法从人脐带中分离、扩增培养人脐带间充质干细胞,并进行鉴定;以猪源脱细胞软骨细胞外基质取向支架为组织工程软骨支架载体;在成年山羊膝关节负重区股骨髁处造全层软骨模型;实验分为两组,以人脐带间充质干细胞复合脱细胞软骨细胞外基质取向支架修复组为实验组,单纯全层软骨缺损造模作为对照组,每组3只山羊。术后7 d、14 d分别抽取关节液涂片行HE染色,观察炎症反应。在术后3、6个月后分别处死两组实验动物,取材进行大体形态学观察及评分、组织学染色及评分、软骨特异性基质成分定量检测。结果①关节液涂片HE染色结果显示,术后两组膝关节炎症反应未见明显差异。②大体形态学观察及组织学染色结果均证实,实验组修复区再生的关节软骨更加接近天然软骨,且与周边整合良好,获得更好的修复效果。大体形态学及组织学评分均证实,实验组的评分均要明显高于对照组(P0.05);③糖胺多糖定量检测结果显示实验组明显高于对照组(P0.05)。结论人脐带间充质干细胞复合脱细胞软骨细胞外基质取向支架构建组织工程软骨,可用于修复山羊膝关节负重区全层软骨缺损,是未来治疗软骨损伤较有应用前景的方法之一。