In-cell Western法测定人胰岛素生物学活性

目的:利用in-cell Western(ICW)技术研究基于转基因细胞的人胰岛素生物学活性测定方法。方法:以CHO-INSR B1284为靶细胞，用不同浓度的人胰岛素刺激靶细胞，采用ICW技术检测人胰岛素受体酪氨酸磷酸化水平，进行人胰岛素的体外生物学活性测定；根据《中华人民共和国药典》2020年版通则9401“生物制品生物活性/效价测定方法”对该方法进行专属性、相对准确度、中间精密度、线性与范围等方法学验证；以重组人胰岛素国家标准品为参比品，采用本方法测定人胰岛素原料药及其他人胰岛素类似物的生物学活性相对效价。结果:不同浓度的人胰岛素作用于CHO-INSR B1284细胞后具有较好的剂量依赖性；5个效价浓度的待测品经8次测定，相对效价的几何均值分别为：(63.76±4.38)%,(78.01±5.97)%,(99.52±4.62)%,(122.84±7.4)%,(151.71±8.81)%,相对偏倚均在±5%范围内，对应的几何变异系数(GCV,%)均<11%,GCV的置信上限均<20%;采用该方法能有效检测人胰岛素及其胰岛素类似物的效价。结论:利用ICW技术的人胰岛素体外...     

以EV71抗原检测方法验证浅析生物制品生物效价检测方法学验证

摘要 目的：本文以对生物制品生物效价检测进行规范的《中国药典》2020年版新增9401指导原则为标准进行EV71抗原检测方法的验证,进一步浅析生物制品生物活性/效价检测的方法学验证。方法： 依据《中国药典》2020年版9401指导原则,结合EV71抗原检测方法特点及验证目的对其进行专属性、相对准确度、精密度、线性和范围5个方面进行方法学验证。结果： EV71抗原检测方法专属性强,6个效价水平几何变异系数为4.7%~13.0%,均小于15%,相对偏倚为-6.05%~9.03%,均在±15%范围内,定量范围为225%~31%,线性回归相关系数为0.9995,5方面验证均符合要求,且适用于该检测方法的使用。结论：本原则可具体指导生物学检测方法验证,在对不同检测方法进行验证时,根据检测目的、方法的原理、方法的技术特点、被检物的成分等设计具体方案。     

利用Nb2-11细胞建立PEG化重组人生长激素生物学活性测定方法

本研究利用Nb2-11细胞,通过实验条件参数优化和方法学验证,成功建立了测定聚乙二醇化重组人生长激素(PEG-rhGH)体外生物学活性分析方法,并用该方法开展了PEG-rhGH注射液相对效价检测。研究表明, PEGrhGH与Nb2-11细胞增殖存在量效关系且符合四参数模型,用该方法检测PEG-rhGH的生物学活性准确度高、精密度好。以PEG-rhGH参比品为对照,对6批PEG-rhGH注射液进行相对效价测定,所得曲线线性、回归性和平行性均通过统计学检验,相对效价在95%～105%。本研究建立的PEG-rhGH生物学活性检测方法,可用于PEG-rhGH产品的质量控制。     

利巴韦林软胶囊处方的正交试验设计与质量控制方法研究

目的制备利巴韦林软胶囊并对其质量进行考察。方法以正交设计筛选合适处方;制定制备工艺;以高效液相色谱用于制剂溶出度、含量的测定。结果优化后处方制备的软胶囊沉降体积比为0.95,体外分析方法的方法学表明,标准曲线线性良好,日内、日间精密度、回收率的RSD值均<2%,批间、批内重现性良好,装量差异符合要求。结论制得符合中国药典要求的利巴韦林软胶囊。     

利巴韦林软胶囊制备及含量测定方法考察

目的制备利巴韦林软胶囊并对其含量测定方法进行考察。方法以正交设计筛选合适处方;制定制备工艺;以高效液相色谱用于制剂含量的测定。结果优化后处方制备的软胶囊沉降体积比为0．95,体外分析方法的方法学表明,标准曲线线性良好,日内、日间精密度、回收率的RSD值均〈2％,批间、批内重现性良好。结论用本工艺制备的利巴韦林软胶囊质量稳定,符合中国药典要求。     

利巴韦林软胶囊处方的正交试验设计与质量控制方法研究

目的制备利巴韦林软胶囊并对其质量进行考察.方法以正交设计筛选合适处方;制定制备工艺;以高效液相色谱用于制剂溶出度、含量的测定.结果优化后处方制备的软胶囊沉降体积比为0.95, 体外分析方法的方法学表明,标准曲线线性良好,日内、日间精密度、回收率的RSD值均<2%,批间、批内重现性良好,装量差异符合要求.结论制得符合中国药典要求的利巴韦林软胶囊.     

泮托拉唑钠肠溶片溶出度的研究

目的 建立的泮托拉唑钠肠溶片的溶出度测定方法。方法 参考《中国药典》2015年版四部通则溶出度与释放度测定法要求,建立HPLC法测定样品中泮托拉唑钠的溶出量 ,并进行方法学验证,同时将所建方法与国内现行标准方法的结果比较。结果 泮托拉唑钠浓度在3.57～89.33μg.mL_^-1范围内线性关系良好(r=0.9999),回收率在 98 %~101 %内,精密度RSD＜1.5%。仅有两个厂家产品体外溶出曲线与原研参比制剂相似。结论 该方法区分度高,专属性强,精密度好,结果准确,适用性好,可用于泮托拉唑钠肠溶片溶出度测定的质量控制。     

基于硼酸亲和色谱(BAC)测定单抗糖化比例方法的建立

目的：建立基于硼酸亲和色谱(BAC)测定单抗糖化比例分析方法并进行方法学验证。方法：对硼酸亲和色谱做方法优化和方法学验证,通过对流动相的盐组成、NaCl和Tris浓度的优化,建立能够有效定量单抗糖化比例的BAC分析方法,并对该方法进行方法学验证和应用评价。结果：NaCl和Tris浓度的变化会影响单抗糖化比例的检测,通过参数优化,最终确定在NaCl和Tris浓度分别为300 mmol·L^-1和25 mmol·L^-1时,可以对单抗糖化比例进行准确定量。根据ICH Q2和《中华人民共和国药典》2020年版对建立的方法进行了方法学验证,结果表明该方法具有良好的特异性、准确性、精密度和耐用性。单抗糖化比例在2%～90%有良好的线性,R²大于0.99,回收率在87.04%～115.29%;非糖化比例在10%～98%具有良好线性,R²大于0.99,回收率在99.69%～109.79%。精密度结果表明,该方法整体的RSD值小于18.26%。最后,利用建立的方法对利妥昔单抗原研药和生物类似药进行了糖化比例检测,发现同...     

注射剂无菌检查的方法学验证试验

目的建立适合于注射剂类无菌检查的操作方法,以实现对该类制剂进行有效的监督检测。方法依据中国药典2005年版规定,对注射剂进行无菌检查均应进行方法学验证。结果采用封闭式薄膜过滤法对180批注射剂类进行方法学验证,均符合中国药典2005年版无菌检查方法学验证标准。结论对注射剂类可采用封闭式薄膜过滤方法及相应类型的集菌器进行无菌检查。     

毛细管电泳结合激光诱导荧光检测分析单抗N糖谱的方法学联合验证

目的:对毛细管电泳结合激光诱导荧光(CE-LIF)检测单抗N糖谱方法进行多家实验室的联合验证。方法:依据国际人用药品注册技术协调会(ICH)Q2_R1指导原则和2015年版《中华人民共和国药典》通则9101,开展方法学验证。评价指标包括专属性、线性、准确度、精密度、定量限、范围和耐用性。结果:验证数据表明,该方法具有良好的特异性、准确性、精密性和耐用性。蛋白量在100～400μg范围内具有良好的线性,R~2大于0.97,且回收率在81%～109%范围内。精密性评价结果显示,G0F、Man5、G1F(1,6)、G1F(1,3)和G2F的校正峰面积百分比和迁移时间的RSD值均小于10%。该方法的定量下限为0.016%,可对在0.016%～77.233%范围内的单个色谱峰进行准确定量分析。同时多个条件下的耐用性评价结果表明该方法具有耐用性,峰面积百分比的RSD小于9%,迁移时间的RSD小于0.1%。结论:组织开展了基于CE-LIF的检测单抗N糖谱的方法学联合验证,结果表明方法可行,可用于单抗N糖谱的检测。     

活血化瘀类中药生物效价检测方法的建立

目的中药质量控制一直是中药现代化的重点和难点,随着中药国际化的进程,FDA也明确提出植物药申报时需提供适于质量一致性评价的生物效价(Bioassay)方法。目前,国际上获批的生物效价方法以均是以计算待测物与标准物质(同质物质)的相对效价值表示,由于中药成分复杂,很难找到同质物质作为标准物质使用,因此目前尚未有复方中药开发相对生物效价方法的报道。本课题组尝试选择适当的中药有效成分为标准物质,以效应曲线的斜率比为计算方法,建立相对生物效价检测方法,拟用于活血化瘀类中药质量生物控制。方法依据美国FDA最新颁布的《Botanical Drug Development Guidance for Industry》中对植物药生物效价研究提出的要求,针对活血化瘀药物多数具有的抗血小板聚集的作用机制,建立家兔体外抗血小板聚集检测方法,参照USP39中对方法学开发及方法学验证的要点要求,选择纯度高、来源稳定且具有较好的抗血小板聚集活性的中药活性成分丹酚酸B作为标准物质建立相对效价测定方法,并且从线性与范围、重复性、精密度及准确度四个方面对方法进行系统考察。同时开展了第三方实验室的验证研究,对方法的可推广性进行了评估。结果以LOG(剂量)为X轴,抑制率为Y轴,绘制标准物质丹酚酸B量效曲线,显示其呈现较好的线性关系。(y=0.8262x+0.0189,R2=0.9901),重复性考察RSD=11.9%,日内精密度为10.53%,日间精密度为10.58%,准确度考察,检测丹酚酸B的相对效价值,结果显示6次测定的效价值为1.083±0.129,测定准确度为8.3%,方法满足美国药典USP39以及CFDA颁布的《生物制品质量控制分析方法验证技术一般原则》中对离体效价实验方法对精密度的要求,方法通过验证。将方法推广应用,委托第三方实验室采用该方法对同一检测样本进行检测,检测结果实验室间无统计学差异,提示该方法具有较好的实验室间重现性。两家机构结果均显示加速过期样品效价值较提取物效价值有明显降低(P<0.01),证明方法有较好的区分性。结论经方法优化及方法学验证,所建立的抗血小板聚集生物效价检测方法与活血化瘀作用机制相关,与标准物质丹酚酸B计算出的相对效价值具有较好的精密度、准确度和重现性,可作为生物检测方法,用于活血化瘀类中药的质量控制。     

藿胆丸微生物限度检查方法学验证实验

目的探讨藿胆丸的微生物限度检查方法的验证实验。方法按《中华人民共和国药典》2010年版一部微生物限度检查方法进行验证实验。结果藿胆丸对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌具有很强的抑制作用,根据方法验证实验结果采用薄膜过滤法（200m/膜）进行本品的细菌计数,常规法进行霉菌及酵母菌计数,常规法进行控制菌检查。结论严格按照《中华人民共和国药典》要求,选择5株阳性菌株进行药品的微生物限度检查方法学验证实验极为必要。     

全省9个地市药检所对中成药香莲丸微生物限度检查结果的研讨

目的 对中成药香莲丸微生物限度检查方法学验证进行比对试验以确定并建立其检查方法.方法 采用常规法、培养基稀释法、薄膜过滤法对香莲丸试验菌回收率进行有效性评价,计算出试验菌的回收率,以确认所采用的方法是否适合于法制剂细菌、霉菌及酵母菌的测定.结果 按中国药典2005年版对中成药香莲丸测定细菌、霉菌及酵母茵细霉菌的回收率,结果全省9个地市药检所实验室均采用消除抑菌成分的处理方法测定细茵回收率高于70%.测定霉菌及酵母菌回收率高于70%是采用常规法有1个实验室.占总实验室的11.1%,采用其他方法有8个实验室,占总实验室的88.9%.结论 全省9个地市药检所对中成药香莲丸微生物限度检查方法验证比对实验,结果基本一致,建立的检查方法准确可靠,以保证检验结果的干确性.     

利巴韦林软胶囊处方的正交试验设计与质量控制方法研究

目的制备利巴韦林软胶囊并对其质量进行考察。方法以正交设计筛选合适处方；制定制备工艺；以高效液相色谱用于制剂溶出度、含量的测定。结果优化后处方制备的软胶囊沉降体积比为0．95，体外分析方法的方法学表明，标准曲线线性良好，日内、日间精密度、回收率的RSD值均〈2％，批间、批内重现性良好，装量差异符合要求。结论制得符合中国药典要求的利巴韦林软胶囊。     

人促红素注射液生物学活性体外法的ELISA验证

本研究用双抗体夹心ELISA(酶联免疫吸附试验)检测人促红素注射液(Human erythropoietin injection, EPO)中EPO效价，并对其进行方法学验证。研究从准确度、重复性、中间精密度、线性、耐用性等各方面，对ELISA检测EPO建立的体外生物活性测试方法进行方法学验证。在准确度验证中，不同浓度供试品测定的回收率在87.20%～118.40%之间，同一浓度的6份样品的加标回收率为93.5%～107.2%之间；将5个不同浓度的供试品分别为2.5,5,20,50,100 mIU/mL进行3次重复性试验，结果RSD均<20%;在中间精密度验证过程中，在不同时间由不同人员各操作测定，检测结果的RSD=0.019%,<20%,人员和时间对结果均无统计学意义影响(P>0.05,F=0.043);线性验证实验结果表明，人促红素国家标准品和EPO成品重复3次的R²分别为0.987 2,0.996 8,0.989 3,0.997 8,0.998 8,0.985 6,均>0.98;在试验加入终止液后，不同长度时间间隔内的生物学活性测定结...     

阿奇霉素胶囊新版药典微生物限度检查方法的建立

目的建立阿奇霉素胶囊微生物限度检查法并进行方法学验证。方法按《中国药典》2015年版四部制剂通则1105、1106、1107项下要求进行试验。霉菌和酵母菌检查采用平皿法,需氧菌总数检查采用薄膜过滤法,大肠埃希菌检查采用薄膜过滤法,采用上述方法对阿奇霉素胶囊各试验菌进行回收试验测试及对控制菌检查方法进行验证。结果需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数验证试验中各菌的回收比值均符合《中国药典》2015年版规定,控制菌检查方法可行。结论该方法适用于阿奇霉素胶囊的微生物限度检查。     

丙型肝炎病毒抗体测定方法学性能验证评价

目的对丙肝病毒抗体测定的方法学性能进行评价和分析。方法取卫生部临床检验中心指定生产的丙肝病毒抗体的弱阳性质控血清,对给定的临界值浓度进行＋20％、-20％的配制并检测,建立自己实验室的该项目临界值浓度;连续20d对丙肝抗体弱阳性质控血清检测,计算s／co值,统计分析13间不精密度CV;用EQA的质控物检测丙肝抗体,进行阴、阳性符合率计算。结果丙肝病毒抗体定性试验的临界值为：1NCU／ml;阴、阳性符合率为100％;日间不精密度CV是11．46％。结论丙肝病毒抗体测定的定性试验检测方法的分析性能能满足要求,评价方案简单易行,项目临界值水平与厂家提供的相同,说明厂家提供的方法学指标必须经过验证,各实验室应建立自己的丙肝病毒抗体方法学性能指标。     

缩宫素效价测定能力验证研究

摘要：目的:全面了解我国缩宫素效价测定的技术水平,并对参加能力验证实验室测定缩宫素效价的能力进行评价。方法:制备能力验证考核样品,并进行均匀性及稳定性考察。各实验室自愿报名参加,按照中国药典2015年版四部通则1210缩宫素生物测定法测定考核样品的效价,对参加实验室的反馈结果进行统计分析,采用z比分数法评价实验室检测能力。结果:能力验证考核样品经均匀性及稳定性考察合格,满足能力验证计划要求。本次能力验证24家实验室中20家实验室的检测结果评定为"满意",满意率为83.3%。结论:本次能力验证可真实地反映参加实验室的检测水平,大多数参加能力验证的实验室具备检测缩宫素效价的能力。     

报告基因法测定重组人白细胞介素-2产品生物学活性的研究

目的:建立测定重组人白介素-2(recombinant human interleukin-2, rhIL-2)制品生物学活性的报告基因法(reporter gene assay, RGA)。方法:根据ICH Q2和《中华人民共和国药典》 2020年版指导原则,构建慢病毒转染表达荧光素酶(luciferase, Luc)的C8166细胞,进行rhIL-2生物学活性测定方法学优化与验证,优化内容包括孵育时间、细胞数量、待测样品的初始浓度和稀释比例;验证内容包括特异性、线性和准确性、精密度和耐用性。结果:优化后的检测条件为：孵育时间为24 h;细胞接种密度为1×10⁵细胞·孔^-1;待测样品以10 000 IU·mL^-1为起始浓度1∶3稀释10个梯度。荧光信号值强度与待测样品浓度拟合四参数曲线,计算相对效价。选用不同作用类型的细胞因子进行特异性验证均符合应用要求。采用50%,75%,100%,125%和150%的5个浓度点验证线性和部分准确性,实测与理论效价线性回归分析相关系数R²=0.993 1,各浓度...     

哌拉西林原料药新版药典微生物限度检查方法的验证

目的：建立哌拉西林原料药微生物限度检查法并进行方法学验证。方法：按《中国药典》2015年版四部制剂通则1105、1106、1107项下要求进行试验。需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌检查采用薄膜过滤法（每筒冲洗量500 mL,150万单位青霉素酶）,大肠埃希菌检查采用薄膜过滤法（每筒冲洗量500 mL,150万单位青霉素酶）,采用上述方法对哌拉西林原料药各试验菌进行回收试验测试及对控制菌检查方法进行验证。结果：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数验证试验中各菌的回收比值均符合《中国药典》2015年版规定,控制菌检查方法可行。结论：该方法适用于哌拉西林原料药的微生物限度检查。