交联温度对京尼平交联胶原／壳聚糖组织工程支架的影响

[目的]通过研究材料的孔径、交联度、溶胀率、降解率、细胞毒性及组织相容性的变化,探讨交联温度对京尼平交联胶原/壳聚糖支架的影响.[方法]采用冷冻干燥法制备胶原/壳聚糖复合多孔支架,分别于4℃、20℃、36℃条件下,在0.5%京尼平水溶液中交联24 h.以未交联的胶原/壳聚糖复合多孔支架作为对照,评价所得支架的孔径、交联度、溶胀率、降解率、细胞毒性及组织相容性特点.[结果]随交联温度升高,支架的交联度明显增大,溶胀率和降解率逐渐减小.4℃组支架交联度47.88%土6.4%,溶胀率为721%±46%,4周后降解3.95%±6.4%;20℃组支架交联度67.69%±3.6%,溶胀率为662%±72%,4周降解0.91%±5.9%;36℃组支架交联度70.32%±5.7%,溶胀率为635%±27%,4周降解0.66%±7.3%,三组上述观察指标均优于未交联组(P/0.01).[结论]京尼平交联可以显著降低胶原/壳聚糖支架的降解率和溶胀率,且对支架结构和生物相容性无明显影响.交联温度增加可以提高支架的交联度和抗降解能力,较快获得具有良好生物相容性和降解率的组织工程支架.     

经碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺交联的Ⅱ型胶原海绵的制备

[目的]用碳化二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethyl ami-nopropyl)carbodiimide,EDC]/N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)对Ⅱ型胶原海绵进行交联,评价了交联前后材料理化性能的改变,探讨其在软骨组织工程方面应用的可行性。[方法]提取Ⅱ型胶原后,通过真空冷冻干燥法冻干成多孔海绵材料后,室温下交联24h,再次冻干成为Ⅱ型胶原海绵支架材料。采用激光共聚焦显微镜、扫描电镜、拉力测试机等手段对海绵材料的结构及性能进行分析。将绿色荧光蛋白(GFP)标记的兔软骨细胞种植到交联后的Ⅱ型胶原支架材料后,观察细胞生长状况。[结果](1)交联后的海绵材料的力学性能与未交联组相比明显提高,达到(2.18±0.47)MPa;(2)交联组材料的抗胶原酶降解能力显著提高,4h后仅降解了8.28%。交联后孔径大小约为90μm,孔隙率和平衡含水率平均为93.39%和97.78%;(3)软骨细胞在Ⅱ型胶原海绵上生长状况良好。[结论]交联后的Ⅱ型胶原海绵保持其优良的理化特性和生物相容性,同时又有效地提高了力学性能和抗降解能力。     

戊二醛交联提高胶原/壳聚糖真皮支架抗细胞收缩能力的研究

目的 应用交联处理的胶原支架,来减缓其降解过多、易收缩变形、机械性能不足等缺点.方法 采用冷冻-冻干法构建胶原/壳聚糖多孔支架,并通过戊二醛交联构建具有良好抗细胞收缩稳定性和细胞相容性的胶原支架.通过测定不同培养时间各类支架的尺寸变化,研究了戊二醛交联对支架抗细胞收缩能力的影响.结果 戊二醛交联后的胶原/壳聚糖支架未见明显收缩,其细胞活性也始终高于干热交联支架.结论 戊二醛能有效地提高胶原基支架的抗细胞收缩能力,并保持其良好的生物相容性.     

从皮肤的细胞外基质（NECM）中制取可注射胶原

常规制取注射性胶原的方法是用酶降解法，经反复酸提、盐析、离心、交联等步骤，进行纯化，该法将胶原降解，酶提取分子片断，用交联剂组成可注射胶原。本法是从ＮＥＣＭ开始制取，ＮＥＣＭ已为胶原框架，因此步骤简化很多，仅需解裂胶原网状结构，酶解末端蛋白以消除特异性，最后降解成３００ｎｍ左右胶原。本法不用交联剂和稳定剂。生物原材料来源广泛，有利临床推广应用。经半年动物实验证明，本法制取的可注射胶原无排斥反应和炎     

从皮肤的细胞外基质(NECM)中制取可注射胶原

常规制取注射性胶原的方法是用酶降解法，经反复酸提、盐析、离心、交联等步骤，进行纯化，该法将胶原降解，酸提取分子片断，用交联剂组成可注射胶原。本法是从ＮＥＣＭ开始制取，ＮＥＣＭ已为胶原框架，因此步骤简化很多，仅需解裂胶原网状结构，酶解末端蛋白以消除特异性，最后降解成３００ｎｍ左右胶原。本法不用交联剂和稳定剂。生物原材料来源广泛，有利临床推广应用。经半年动物实验证明，本法制取的可注射胶原无排斥反应和炎性反应，也无包裹现象，半年时仍残留有部分胶原     

壳聚糖与型胶原复合制作组织工程软骨支架及其性能研究

目的　探讨采用壳聚糖与 型胶原复合制作新型组织工程软骨三维多孔支架的方法,并对其理化性能进行检测。　方法　将精制88%脱乙酰度壳聚糖溶于0 .2 mol/ L 醋酸溶液制成2 %溶液,高纯度猪 型胶原溶于0 .5 m ol/ L醋酸溶液制成1%溶液,两者按4∶1(重量比)充分搅拌混合,采用冷冻干燥法制成壳聚糖与 型胶原复合支架。采用碳化二亚胺/ N-羟基琥珀酰亚胺对支架进行交联,力学测定比较支架交联前后的强度变化,扫描电镜观察其超微结构,于2、4、6和8周经溶菌酶体外降解实验测定其体外降解性。　结果　制备的复合支架成形良好,交联后其力学强度明显增加。扫描电镜显示壳聚糖与 型胶原成分在支架内分布均匀,支架内孔洞相互连通似海绵状,孔径10 0～2 5 0 μm。各时间段复合支架体外降解较单纯壳聚糖支架快。　结论　壳聚糖与 型胶原复合成功地制作成了三维多孔复合支架。其理化性能及体外降解测定,可以作为支架载体,应用于组织工程软骨的构建。     

壳聚糖与Ⅱ型胶原复合制作组织工程软骨支架及其性能研究

目的探讨采用壳聚糖与Ⅱ型胶原复合制作新型组织工程软骨三维多孔支架的方法,并对其理化性能进行检测. 方法将精制88%脱乙酰度壳聚糖溶于0.2 mol/L醋酸溶液制成2%溶液,高纯度猪Ⅱ型胶原溶于0.5 mol/L醋酸溶液制成1%溶液,两者按4∶1(重量比)充分搅拌混合,采用冷冻干燥法制成壳聚糖与Ⅱ型胶原复合支架.采用碳化二亚胺/ N-羟基琥珀酰亚胺对支架进行交联,力学测定比较支架交联前后的强度变化,扫描电镜观察其超微结构,于2、4、6和8周经溶菌酶体外降解实验测定其体外降解性. 结果制备的复合支架成形良好,交联后其力学强度明显增加.扫描电镜显示壳聚糖与Ⅱ型胶原成分在支架内分布均匀,支架内孔洞相互连通似海绵状,孔径100～250 μm.各时间段复合支架体外降解较单纯壳聚糖支架快. 结论壳聚糖与Ⅱ型胶原复合成功地制作成了三维多孔复合支架.其理化性能及体外降解测定,可以作为支架载体,应用于组织工程软骨的构建.     

骨质疏松与I型胶原的代谢

型胶原的代谢１１　Ｉ型胶原的合成　Ｉ型胶原基因在成骨细胞内转录、剪接成前α链ｍＲＮＡ,转译出前α肽链,三条前α肽链组成前胶原。前胶原Ｎ端、Ｃ端的多余肽链被切下,为ＰＩＮＰ（Ｉ型胶原前胶原氨端肽原）和ＰＩＣＰ,进入血液,余下部分成为原胶原。原胶原被分泌到细胞外,相互聚集形成排列规律紧密的胶原纤维。各分子间逐渐形成共价键连接,成为成熟的胶原纤维［１,２］。１２　Ｉ型胶原的降解破骨细胞分泌一组Ｉ型胶原水解酶,水解Ｉ型胶原,释放出Ｉ型胶原羧端交联肽原（ＩＣＴＰ,含三条肽链各一部分）,及其他肽段,进入…     

改良脱细胞异种真皮的制备与动物埋藏实验

目的:研制一种新型异种人工真皮。方法:应用鼠尾胶原和异种(猪)脱细胞真皮复合制备成新型复合真皮,将复合真皮与交联型脱细胞真皮分别埋藏于Balb/C小白鼠皮下,观察新型材料的组织相容性及促胶原代谢能力。结果:所有试验小鼠在早期均有毛发脱失现象,交联型真皮组持续时间长并伴有肉芽组织形成。4周后,新型复合真皮显示组织结构致密有序,降解时间更长;组织相容性及促自体胶原代谢能力均较交联型真皮更为优越。结论:新型材料具有更好的组织相容性和更强的促胶原代谢能力,是良好的皮肤组织工程支架材料。     

紫外线与戊二醛双重交联法构建真皮支架的研究

目的 比较不同预冻温度及交联方法对胶原膜内部超微结构及成纤维细胞增殖的影响. 方法 将牛Ⅰ型胶原溶液(10 g/L)分别在-20℃和-80℃预冻12 h后,放入-70℃冻干机内冷冻干燥48 h.利用扫描电镜测量2种预冻温度下胶原膜的内部孔径,比较戊二醛交联法及紫外线+戊二醛双重交联法对胶原孔径的影响,通过噻唑蓝(MTT)法检测人成纤维细胞在不同交联法制备的胶原膜中的增殖情况. 结果 -20℃预冻胶原膜的孔径为(172±37)μm,-80℃预冻胶原膜孔径为(99±24)μm,选择后者进行后续实验.经戊二醛交联后胶原膜孔径缩小,种植后第8天,成纤维细胞的吸光度值为1.534±0.013;紫外线联合戊二醛双重交联后胶原膜原有孔径不变,种植后第8天成纤维细胞的吸光度值为3.778±0.010,与前者比较,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 -80℃预冻后经紫外线+戊二醛双重交联法构建的胶原膜,可作为体外真皮支架替代物.     

重组胶原肌腱假体植入的初步实验研究

本研究旨在比较经戊二醛或碳化二亚胺交联的Ⅰ型胶原人工肌腱和自体肌腱移植的结果。人工腱采用新鲜牛真皮,经粉碎、酸浸、离心、低温、胃蛋白酶降解、热变性等处理提取Ⅰ型胶原氨基酸,再重组成胶原纤维,然后分别将戊二醛及碳化二亚胺交联于此胶原纤维上。人工腱含200～250束独立的胶原纤维。     

脱细胞牛心包膜材料与胶原膜引导骨再生的对照研究

目的 比较碳化二亚胺[1-ethyl-3（3-diaminopropyol）-carbodiimide，EDAC]交联脱细胞牛心包（acellular bovine pericardium，ABP）与胶原膜引导骨再生的作用和膜材料植入动物体内的转归。方法 健康雄性成年新西兰白兔24只，体重2．6～3．5kg，平均3．1kg。制备兔双侧下颌体7mm×7mm×5mm骨缺损模型，一侧骨缺损覆盖EDAC交联ABP（EDAC交联ABP组），另一侧覆盖胶原膜（胶原膜组）。术后4、8、16及24周各处死6只动物行大体、组织学观察及图像分析检测新生骨面积百分比及膜材料吸收替代百分比。结果 大体观察：术后4、8周EDAC交联ABP组膜材料完整，与缺损区正常骨粘连紧密；胶原膜组膜材料形态消失，骨缺损区轮廓欠清晰。术后16、24周EDAC交联ABP组骨缺损区创面平坦；而胶原膜组凹凸不平。组织学观察：术后4、8周EDAC交联ABP组胶原纤维排列规则，缺损区中央大量新生骨小梁；胶原膜组胶原纤维断裂，缺损区见大量新生骨小梁。术后16、24周，EDAc交联ABP组骨缺损区形成完整的骨桥，而胶原膜组骨缺损内局部长入纤维结缔组织。术后4、8周，两组新生骨面积百分比相近，16周EDAC交联ABP组为81．99％±3．92％，胶原膜组为76．35％±4．29％，组间差异有统计学意义（P〈0．05）。术后4、8、16及24周，EDAC交联ABP组膜材料平均吸收替代百分比分别为16．57％、27．94％、65．61％和85．72％；胶原膜组4周降解超过50％，8周已完全降解吸收。结论 EDAC交联脱细胞牛心包膜材料引导成骨的效率优于胶原膜。     

增生性瘢痕胶原降解与形态学的观察

目的　探讨胶原降解和瘢痕形态结构在增生性瘢痕形成中的作用。方法　应用SDS 聚丙烯酰胺凝胶加胶原底物电泳、氨基酸分析法和复合染色法 ,观测增生性瘢痕组织中胶原酶活性、胶原降解和瘢痕的组织形态。　结果　增生性瘢痕组织胶原纤维排列紊乱 ,胶原纤维间有大量的酸性粘多糖 ,紧密包绕胶原纤维 ,胶原酶活性明显下降 ,胶原降解减少。　结论　胶原酶活性降低 ,酸性粘多糖阻止胶原酶对胶原的降解可能是胶原降解减少和瘢痕形成的重要原因     

聚乳酸-羟基乙酸胶原膜生物相容性的实验研究

目的　评价海绵状聚乳酸 羟基乙酸 (PLGA)胶原膜作为真皮支架材料的生物相容性。　方法　利用SD大鼠和培养的人表皮细胞、成纤维细胞 ,观察PLGA胶原膜在体内的降解过程和在体外的细胞毒性、溶血性以及与人体细胞的亲和性。　结果　PLGA胶原膜在体内具有适当的降解速率 ,9周可完全降解 ;置入皮下 3周后可见血管化 ,新生组织不断长入 ,未见明显的炎症反应。浸泡液对培养细胞没有明显的毒性作用 ,不发生溶血反应。成纤维细胞和表皮细胞在PLGA胶原膜上可快速黏附、增殖。　结论　PLGA胶原膜具有良好的生物相容性和细胞亲和性 ,具有适当的降解速率 ,符合作为组织工程支架材料的要求     

封闭负压引流技术对人慢性创面中胶原酶活性的影响

目的研究人慢性创面经封闭负压引流（vacuum—assisted closure，VAC）治疗前后，创面渗出液中胶原酶活性的变化，以部分阐明VAC促进慢性创面愈合的机理。方法取4例急性创面在术后1、2、3d的创面引流液（乳癌术后），同时收集6例慢性创面（4例静脉性溃疡，2例压力性溃疡）在VAC治疗前以及治疗后2、4、6d的创面渗出液，利用酶谱分析的方法，观察各时间点的渗出液对可溶性Ⅲ型胶原的降解情况，同时应用强力霉素抑制实验来分析渗出液中胶原酶的类型。结果急性创面引流液可以部分降解Ⅲ型胶原，随时间推移变化较小，慢性创面渗出液中的胶原酶活性较高，VAC治疗前基本将Ⅲ型胶原全部降解，随时间推移、降解减少，胶原酶活性下降，强力霉素抑制实验证明在100μmol／L浓度时无抑制，在600μmol／L浓度时出现部分抑制。结论在慢性创面渗出液中胶原酶活性增高，VAC的应用可以降低胶原酶的活性，阻止胶原蛋白大量降解，利于创面愈合，在慢性创面渗出液中胶原酶应主要是MMP-1型（成纤维细胞型）。     

原发性骨质疏松症患者骨密度和骨代谢指标的对比研究

目的探讨骨密度（BMD）和骨代谢指标在原发性骨质疏松症的诊治过程中的临床意义.方法采用XR-36型双能X线骨密度仪和放射免疫方法,对252例中老年志愿者不同部位的BMD及血清骨钙素（BGP）、Ⅰ型前胶原氨基端前肽、Ⅰ型胶原交联羧基末端肽的含量进行测定.结果①无论是对照组还是骨质疏松组（OP）,老年男性BMD均明显高于老年女性BMD,其差异具有非常显著性（P＜0.01）;②OP组的BGP值明显低于对照组,其差异具有显著性（P＜0.05）;OP组的血清Ⅰ型前胶原氨基端前肽（PINP）值均明显低于对照组,而血清Ⅰ型胶原交联羧基末端肽（ICTP）值均明显高于对照组,其差异具有显著性（P＜0.05）.结论联合检测BGP、HNP和ICTP水平可直接反映骨胶原合成和降解状态,对于判断老年OP的进程以及指导OP的用药有着重要的意义.     

生物支架材料胶原膜交联前后的特性分析

目的 比较胶原膜交联前后的生物特性,为胶原膜的应用奠定基础. 方法 取市售新鲜牛尾,分离肌腱,制备胶原蛋白,以紫外分光光度计测定胶原蛋白含量;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyaerylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)波长扫描,氨基酸含量检测分析胶原蛋白特性.将制备的胶原蛋白,真空冷冻干燥,制备胶原膜,采用戊二醛交联.大体观察及扫描电镜观察交联前后胶原膜形态,并测定胶原酶溶解时间、pH值、吸水性能及抗撕强度.取自愿捐赠的骨髓制备BMSCs,按2×103/100 μL浓度接种于交联前后胶原膜上培养7 d,测量细胞吸光度(A)值及扫描电镜观察. 结果 制备的胶原蛋白含量约为2 mg/mL,最大吸收波长约为230 nm.胶原蛋白氨基酸分析显示,甘氨酸含量约为21.47%,脯氨酸12.04%,羟脯氨酸10.18%,未检出色氨酸.交联前胶原膜为白色海绵状,孔径较大且不均匀,pH值为4.5～5.0;扫描电镜观察为孔网状结构,孔径大;吸水力为其重量的61倍,抗撕强度为210 g/cm3,胶原酶溶解时间为30 min.交联后胶原膜变薄,无色,半透明,致密,柔韧性好;镜下可见致密排列的胶原纤维成网状;pH值为6.5～7.0,吸水力降低,抗撕强度约为3 400 g/cm3,胶原酶溶解时间为90 min.细胞增殖实验表明,细胞在交联前后的胶原膜上均能良好生长,A值差异无统计学意义(P＞0.05).扫描电镜见BMSCs在交联后的胶原膜上生长良好. 结论 从牛肌腱中成功提取胶原蛋白,并制备胶原蛋白膜.经化学交联剂交联后,胶原膜仍具有良好的生物学特性,且理化性质优于交联前,可作为生物支架材料,用于皮肤创伤修复等研究领域.     

胶原酶对裸鼠移植肥厚性瘢痕的治疗作用

目的 观察胶原地肥厚性瘢痕（ＨＴＳ）胶原降解的影响,探讨它对ＨＴＳ的治疗作用。方法 建立ＨＴＳ裸鼠移植模型,局部注射胶原酶于瘢痕组织。治疗后取材行光、电镜观察和分析。结果 ＨＴＳ组织胶原纤维被降解,真皮层变薄,瘢痕缩小,质地变软,与对照组差异十分明显。结论 胶原酶的局部注射可能是治疗ＨＴＳ的较好方法。     

海绵状胶原膜真皮替代物的研制及实验研究

目的　探讨海绵状胶原膜作为真皮替代物的可行性。　方法　提取猪皮胶原 ,与 6 硫酸软骨素混合沉淀后冻干成膜。将胶原膜包埋于SD大鼠皮下 ,定期取材检测其组织相容性、血管化能力及降解速度。　结果　制备的胶原膜具有密集的相互贯通的微孔结构 ,且具有一定的强度与韧性 ,适于手术操作。SD大鼠皮下埋藏试验表明组织相容性较好 ,无明显急性炎症反应 ,血管化能力较强 ,降解速度慢 ,真皮构架稳定性好。　结论　海绵状胶原膜可作为真皮替代物移植于创面。     

不同组织来源生物补片降解性能的比较研究

目的比较3种不同组织来源生物补片的体内外降解性能。方法采用Ⅰ型胶原酶对来源于基底膜(BM)与小肠黏膜下层(SIS)复合细胞外基质、单纯小肠黏膜下层、戊二醛化学交联心包(PC)三种生物补片进行体外降解试验,确定各材料的降解率;采用各材料修补大鼠腹壁肌部分层次缺损评估3种补片的降解和组织修复情况。结果体外降解试验中,酶溶液作用120 h后,非交联的BM/SIS复合补片和SIS补片完全降解,PC补片的降解率仅为4.3%±1.9%。体内降解试验中,术后2个月,大体观和组织病理切片染色结果证实BM/SIS复合补片完全降解,组织重塑,再生胶原有序;SIS补片完全降解,再生胶原有序性较差;术后12个月,PC补片未见明显降解,未见细胞长入补片中央区。结论虽然BM/SIS复合补片的体内外完全降解时间均较短,但其可以实现组织的良好快速重塑,提示BM/SIS复合补片是一种降解与再生同步的组织修复材料。