HCV非结构蛋白NS5A人源单链抗体可变区基因的筛选与鉴定

非结构蛋白ＮＳ5Ａ是丙型肝炎病毒(ＨＣＶ)编码的一种蛋白分子。我们利用重组的ＨＣＶ非结构蛋白ＮＳ5Ａ为包被抗原 ,从噬菌体抗体库中筛选出了结合活性较强的ＨＣＶＮＳ5Ａ人源单链噬菌体抗体 ,并对其进行了ＤＮＡ序列测定。本研究所用的ＨＣＶＮＳ5Ａ抗原为大肠杆菌表达的重组纯化抗原蛋白 ,以聚丙烯酰胺凝胶电泳 (ＰＡＧＥ)证实纯度在95 %以上。人噬菌体抗体文库为轻链可变区和重链可变区经甘氨酸接头(Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ) 3 连接的半合成抗体文库。Ｍ13Ｋ0 7购于Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司 ,ＤＮＡ质粒提取纯化试剂盒购于Ｗｉｚａｒｄ公司。其…     

重组人G—CSF免疫小鼠全套单链抗体噬菌体表面展示文库？…

利用全套噬菌体抗体表面展示技术，绕过杂交瘤技术，从重组人Ｇ－ＣＳＦ免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ后，用抗体中变区ＰＣＲ混合引物进行全套抗体重，轻链可变区（ＶＨ和ＶＬ）基因的扩增，经重叠延伸反应，在体外随机装配成单链抗体（ＳｅＦｖ）将其克隆至噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中，电转化含ＳｕｐＥ的Ｅ．ｃｏｌｉ菌株，以辅助噬菌体Ｍ１３Ｋ０７超感染噬菌粒文库，构建成全套ＳｃＦｖ表面展示文     

从噬菌体抗体库克隆抗人RBC单链抗体基因

目的用噬菌体抗体库技术克隆抗人红细胞（ＲＢＣ）的单链抗体（ＳｃＦｖ）基因。方法以人ＲＢＣ免疫小鼠，取脾细胞，ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＶＨ和Ｖκ基因，组装到ＳｃＦｖ－噬菌体抗体表达载体中，构建了噬菌体抗体库，以人ＲＢＣ为固相抗原，对该库进行了四轮“吸附－洗脱－扩增”筛选，获得了抗人ＲＢＣ的ＳｃＦｖ基因。结果ＤＮＡ序列分析表明其可变区基因分别属于小鼠ＶＨⅢ亚群和ＶκⅤ亚群。结论所表达的ＳｃＦｖ可与不同人ＲＢＣ结合，与ＡＢＯ血型抗原无关，可用于构建快速血凝诊断的工程抗体     

HCV非结构蛋白NS5A人源单链可变区抗体基因的筛选与鉴定

目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5A的人源单链可变区抗体（ScFv)的编码基因,为HCV NS5A蛋白质生物学功能的研究及抗HCV的基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组纯化的HCV非结构蛋白NS5A为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性和特异性较强的HCVNS5A人源单链可变区抗体基因片段的阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定,结果 筛选得到的ScFv片段基因核苷酸序列为789nt,编码由262个氨基酸残基组成的多肽,具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点,基因编码产物具有HCV NS5A蛋白反应的免疫学活性和特异性。结论 利用噬菌体抗体库技术,成功获得了HCV NS5A人单链可变区抗本ScFv编码基因,并获得了可溶性单链抗体的表达。     

出血热恢复期患者全套噬菌体抗体库的构建

以３种方法从出血热恢复期患者外周血淋巴细胞成功地扩增出人抗体Ｖ区３种基因片段（ＶＨ，Ｖ，Ｖλ），通过桥拼接延伸反应（ＳＯＥ），以（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３为连接子，将重、轻链Ｖ区基因连接成为ＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｖｉｃ和ＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｖλ两种单链抗体基因。然后将ＳｃＦｖ基因与载体ｐＨＥＮ１重组，转染感染受态大肠杆菌ＴＧ１，通过辅助噬菌体Ｍ１３ＫＯ７的超感染，制备成两种“噬菌体展示人源性全套ＳｃＦｖ抗     

丙型肝炎病毒非结构蛋白3人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

目的筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 NS3的人单链可变区抗体 (Sc Fv) ,以解决人体内应用鼠单抗时的免疫原性问题 ,为进行抗 HCV的基因治疗研究开辟新途径。方法采用噬菌体表面展示技术 ,以重组的 HCV非结构蛋白 NS3为固相抗原 ,从噬菌体单链可变区抗体库中经过 5轮“吸附 -洗脱 -扩增”筛选过程 ,获得抗原结合活性较强的 HCVNS3人单链可变区抗体的阳性克隆 ,并对其进行免疫检测及序列测定。结果筛选出来的 Sc Fv片段具有抗 NS3的特异性。证实利用噬菌体抗体库技术 ,可以成功地获得 HCV NS3人单链抗体 Sc Fv的编码基因。结论筛选获得了 HCV非结构蛋白 NS3的特异性单链抗体的编码基因。     

从噬菌体抗体库分离抗NKAT4单链抗体

用一噬菌体抗体库分离人杀伤抑制受体特异性的单链抗体。经ＥＬＩＳＡ分析显示,５０个克隆中有１４个与ＮＫＡＴ４蛋白反应呈强阳性。这些克隆的重链可变区胚系为ＤＰ ４７。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｉｎｇ显示表达在上清中的单链抗体为单体。本研究结果表明,从一噬菌体抗体库可比较简便地分离到杀伤抑制受体的特异性单链抗体。     

乙酰胆碱受体单链噬菌体抗体的筛选与鉴定

筛选乙酰胆碱受体（ＡＣｈＲ）单链抗体（ＳｃＦｖ），制备可溶性ＡＣｈＲＳｃＦｖ以预防、治疗和诊断重症肌无力。采用电鳐电器官的ＡＣｈＲ（ｔＡＣｈＲ）以亲和吸附法，从鼠源性噬菌体ＳｃＦｖ抗体库中筛选出ＡＣｈＲ特异性抗体。以ＥＬＩＳＡ鉴定噬菌体抗体的特异性，以免疫荧光技术鉴定噬菌体抗体对人肌肉冰冻切片中ＡＣｈＲ的结合特异性。经４轮ＡＣｈＲ筛选后，获得了能与ＡＣｈＲ结合的噬菌体抗体，这种抗体也能与人肌肉冰冻切片中的ＡＣｈＲ结合。以ｔＡＣｈＲ为抗原对噬菌体抗体库进行亲和吸附筛选，可以得到ＡＣｈＲＳｃＦｖ，并且这种抗体也能与人肌肉冰冻切片中ＡＣｈＲ特异性结合。     

从人源单链抗体库中筛出具有抗原结合活性的重链可变区和更 …

目的：用噬菌体呈现技术结合体外致敏法构建了人源单链抗体库,并用大肠癌相关抗原ＣＡ－Ｈｂ３筛选出抗大肠癌噬菌体抗体克隆ＥＬ５Ｄ、ＥＬ６Ｄ和Ｃａｌ２,测定３个克隆的核苷酸序列,并研究其免疫活性。方法：采用抗体克隆扩增、测序分析、免疫组化法测定活性。结果：抗体基因插入片段分别为２２０、５００、５００ｂｐ。测序结果表明,ＥＬ６Ｄ和Ｃａ１２属ＶＨ５－Ｄ－ＪＨ４,仅为ＶＨ结构亚单位,而ＥＬ５Ｄ属Ｖｋ的Ｊｋ１,     

乙肝病毒核心蛋白人源单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的 获得可溶性的抗乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（core)的人源单链可变区抗体（ScFv)，为得到纯度高、活力强的HBc-ScFv和进一步的抗HBV治疗奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术，以重组的HBV核心蛋白为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得抗原结合活性较强的乙型肝炎核心蛋白人源单链可变区抗体ScFv片段克隆，并对其进行DNA序列及免疫活性测定。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化大肠杆菌HB2151，IPTG诱导表达乙型肝炎核心蛋白可溶性人源单链可变区抗体，ELISA和western blot检测其抗原结合特异性。结果 克隆了乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体基因；经DNA酶切和序列分析表明，该抗体基因由771个碱基组成；ELISA和western blot结果表明：在大肠杆菌HB2151中经IPTG诱导表达的可溶性乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体，具有结合乙型肝炎核心蛋白的特异性和免疫活性。结论 克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表达了可溶性的HBc-ScFv。     

抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的 研制抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3的人源噬菌体单链抗体,并探讨其在临床诊断中的应用价值。方法 以重组的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3为固相抗原,利用亲和筛选的原理,从噬菌体抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点免疫杂交试验和DNA序列分析,获得HCV NS3的人源单链抗体;用该抗体与不同来源的HCV NS3抗原进行反应;对10例石蜡包埋的丙型肝炎患者肝组织进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明,所制备的HCV NS3人源单链抗体能与不同来源的HCV NS3抗原特异性结合（吸光度A值为1.38）;免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别丙型肝炎患者肝组织HCV NS3抗原,与正常肝组织及乙型肝炎病毒（HBV)的表面抗原均无交叉反应。结论 此法制备的单链抗体亲和性好,特异性强,且制备方法简便,周期短,可用于HCV NS3病原的检测。     

HBsAg人源噬菌体单链抗体的筛选及其在临床诊断中的应用

目的 筛选乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)的人源噬菌体单链抗体，并探讨其在临床治疗和诊断中的应用价值。方法 以HBsAg阳性血清超速离心纯化的HBsAg为固相抗原，从噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过5轮“吸附—洗脱—扩增”筛选过程，获得特异性较强的HBsAg人源单链可变区抗体(ScFv)；用该抗体对10例石蜡包埋的乙型肝炎患者肝组织进行免疫组化鉴定。结果 酶联免疫吸附法(ELISA)结果表明，制备的HBV人源单链抗体能与HBsAg抗原特异性结合；免疫组化结果表明，该抗体能够特异性识别乙型肝炎患者肝组织中的HBsAg抗原，与正常肝组织及丙型肝炎病毒(HCV)的抗原均无交叉反应。结论 此法制备的单链抗体亲和性好，特异性强，且制备方法简便，周期短，为HBV病原的检测提供了新的有效试剂，为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定了基础。     

人源性抗HBc单链抗体的筛选、鉴定及基因序列测定

目的:筛选人源性抗乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)单链抗体(ScFv)并在体外原核表达、鉴定和基因序列测定, 为抗HBcScFv的进一步研究奠定基础。方法: 采用噬菌体表面展示技术, 以乙肝病毒核心抗原为包被抗原, 从人源性单链噬菌体抗体库中经过3轮"吸附-感染-扩增"的筛选过程, 获得抗原结合活性较强的人源性抗HBc单链抗体阳性克隆, 并在大肠杆菌HB2151中进行ScFv可溶性表达, 对其进行免疫学鉴定和序列测定。结果:筛选出的ScFv具有抗HBc的特异性, 并可在大肠杆菌中进行可溶性表达;基因序列测定表明, 该ScFv的重链段基因与人类免疫球蛋白重链可变区相符, 轻链段基因为人类免疫球蛋白κ轻链可变区。结论:利用噬菌体抗体库技术, 成功筛选出人源性抗HBcScFv并获得其基因序列。     

A phage-displayed single chain variable fragment that interacts with hepatitis B core antigen: library construction, selection and diagnosis.

BACKGROUND: Phage display is an alternative method for constructing and selecting antibodies with desired specificity towards an antigen. OBJECTIVES: To construct a library of single chain variable fragment (ScFv) towards hepatitis B core antigen (HBcAg). To isolate a ScFv phage clone that interacts with HBcAg and to develop a phage-ELISA for detecting the antigen. STUDY DESIGN: Mice were inoculated with HBcAg and RNA was extracted from their spleen cells. The genes encoding heavy (V(H)) and light (V(L)) chains were amplified, linked via PCR and cloned into a phagemid vector. Phage particles displaying ScFv were panned against HBcAg and a selected clone was characterized and employed as a diagnostic reagent for detecting HBcAg in serum samples. RESULTS: A phage clone that interacts with HBcAg was selected from the antibody library. The binding of the phage to HBcAg was inhibited by a cyclic peptide bearing the WSFFSNI sequence. A phage-ELISA was established using the recombinant phage and as low as 10ng of HBcAg can be detected by the assay. CONCLUSION: The ScFv displayed on the surface of filamentous phage is an alternative choice for diagnosis of HBcAg in serum samples.     

胃癌单抗MGd1的噬菌体呈现型ScFv的制备

目的 制备胃癌单抗MGd1的单链可变区片段（single chain variable fragment,ScFv),为胃癌体内诊疗研究提供候选靶向载体分子。方法 从MGd1杂交瘤分离mRNA,RT-PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因（VH和VLDNA）,二者经linkerDNA连接形成ScFvDNA,将ScFvDNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv,以高表达MGd1结合抗原的细胞株KATOⅢ对重组噬菌体抗体ScFv进行峡谷轮筛选后;随机挑取克隆经ELISA筛选MGd1ScFv单克隆,并对其结合抗原的能力进行鉴定。结果 VH、VL和ScFvDNA分别约为340、320和750bp,经两轮亲和筛选后,在随机筛检的30个克隆中得到12个噬菌体呈现型MGd1ScFv单克隆,其中结合抗原能力强的克隆有5个。结论 用噬菌体呈现技术成功地获得了单抗MGd1的ScFv,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。     

针对单克隆抗体MGb1的重组抗独特型抗体的筛选与鉴定

目的 利用噬菌体呈现技术筛选针对抗胃癌单克隆抗体（简称单抗）MGb1的重组抗独特型抗体（抗-Id）,为研制胃癌重组抗-Id瘤苗提供候选分子。方法 以单克隆抗体MGb1免疫Balb／c小鼠,取脾分离mRNA。RT-PCR分别扩增抗体VL和VH cDNA,经linker DNA连接形成ScFv DNA。将scFv DNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv文库。以单抗MGb1对文库进行4轮淘选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现抗-Id scFv的噬菌体单克隆,进而经竞争ELISA对其所属抗-Id类型进行初步鉴定。结果 VL和VH cDNA分别约为320和340bp,ScFv DNA约为750bp。抗体ScFv文库经四轮淘选后,在随机筛检的50个克隆中得到18个呈现抗-Id ScFv的噬菌体单克隆。在18个克隆中,有4个呈现β或γ型抗-Id ScFv。结论 经重组噬菌体抗体技术成功地筛选到了针对单抗MGb1的噬菌体呈现型抗-Id ScFv,从而为进一步获得能诱导抗胃癌免疫的抗-Id ScFv奠定了基础。     

从噬菌体抗体库筛选获得中和性人源抗甲型肝炎病毒Fab抗体

目的 研究人源抗甲型肝炎病毒基因工程抗体,为预防甲型肝炎病毒感染提供有效的方法。方法 采用噬菌体表面展示技术,从一名甲型肝炎恢复期病人的抗凝血中分离淋巴细胞,提取总ＲＮＡ逆转录后,用一组人ＩｇＧ Ｆａｂ特异性引物扩增。结果 克隆和表达了８株人源抗甲型肝炎病毒抗体Ｆａｂ段基因,经ＥＬＩＳＡ检测为特异性人抗甲型肝炎病毒Ｆａｂ段抗体。结论 该８株人源抗甲型肝炎病毒Ｆａｂ抗体都能与具有中和活性的鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应,选其中的２株做体外中和实验,证明都有中和甲型肝炎病毒的活性。     

人源抗狂犬病毒基因工程单链抗体的研究

目的 研制人源抗狂犬病毒基因工程抗体.方法 从具有高滴度狂犬病毒抗体的疫苗接种者采集外周血淋巴细胞,通过pHAL14载体和高效噬菌体系统构建人源抗狂犬病毒单链基因工程抗体库,经纯化的狂犬病毒aG株富集筛选,通过ELISA和IFA鉴定阳性抗体克隆并进行序列测定.利用IgG表达载体VH/VK双质粒系统瞬时转染293T细胞实现IgG抗体的分泌型表达,通过亲和力测定和中和试验鉴定IgG抗体功能.结果 成功地获得了6株抗狂犬病毒糖蛋白的人源单克隆抗体,非竞争ELISA显示6株抗体具有较高的亲和力,体外中和试验证实这6株人源单抗对狂犬病毒CVS株无中和活性,对aG株具有较强的中和活性.结论 从免疫库中获得了6株人源单克隆抗体,为狂犬病毒的鉴别诊断和治疗奠定了基础.