HCV准种的结构蛋白在真核表达系统中的表达

本实验从 1份HCV持续性感染者血标本中随机筛选的 8个C E1 E2克隆序列亚克隆入真核表达载体pCI neo ,并转染大肠杆菌DH5α ,经氨苄青霉筛选、酶切鉴定及DNA测序 ,构建为插入C E1 E2的重组质粒。将 1μg重组质粒、0 .36mCi mlH3 亮氨酸加入TNT T7Cou pleReticulocyteLysateSystems (含有 2 5 μlTNTLysate、4UT7RNA聚合酶、2 0 μmol L不含亮氨酸的氨基酸混合物、4 0URNA酶抑制剂 ) ,总反应体积 5 0 μl。取 5 μl反应液进行 12 %SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,抽干凝胶 , 70℃放射自显影 3d。构建后的重组表达载体pCI neo HCV…     

丙型肝炎病毒核心及E2蛋白在转基因鼠中的表达

［英］ＰａｓｑｕｉｎｅｌｉＣ，ｅｔａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１９９７；２５：７１９～７２７本实验建立了能在肝内表达ＨＣＶ核蛋白的转基因小鼠动物模型，这种转基因小鼠在鼠的主要尿蛋白启动子（ＭＵＰ）的转录控制下于肝细胞浆中表达相当于自然感染患者同等水...     

铁转运相关蛋白在肌萎缩性侧索硬化症转基因鼠脊髓中的表达变化

目的探讨肌萎缩性侧索硬化症(ALS)转基因鼠脊髓内铁转运相关蛋白表达变化与铁稳态失衡的关联。方法选取h SOD1G93A转基因鼠(ALS鼠)和同窝野生型鼠(WT鼠),分别于生后70、95和122 d分离脊髓,每时间点每组各9只实验动物。Western blotting检测脊髓组织内铁转运蛋白二价金属转运蛋白-1(DMT1)、铁转运蛋白-1(FPN1)及调节蛋白铁调节蛋白-1(IRP1)的表达;免疫荧光双重标记检测脊髓腰段前角内细胞共定位情况。结果 Western blotting显示,与WT鼠比较,各时间点ALS鼠脊髓内DMT1表达均显著降低(P<0.05,P<0.01);70 d FPN1表达升高(P<0.05),95 d和122 d表达下降(P<0.01); 95 d、122 d IRP1表达降低(P<0.01)。免疫荧光双重标记显示,在70 d WT鼠和ALS鼠腰段脊髓中DMT1主要与β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)共表达。与WT组相比,95 d ALS鼠脊髓腰段前角神经元内DMT1免疫反应强,而FPN1荧光强度减弱。随疾病进展,DMT1、FP...     

HCV CE2融合蛋白在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

HCV的E2蛋白能刺激机体产生具有中和活性的抗体，其C蛋白序列在不同的型和株间具有高度保守性，是细胞免疫的主要识别位点。本研究利用家蚕杆状病毒为载体，在家蚕培养细胞和幼虫中高效表达了具有生物活性的HCV CE2融合蛋白，为今后该蛋白免疫学特性及疫苗的研究、临床诊断试剂的开发提供了参考资料。     

HCV核心蛋白在HepG2细胞中对COX-2表达的影响

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白是否影响环氧化酶-2(COX-2)的表达。方法用PCR从含HCVH77株全长基因组序列质粒中扩增HCV核心蛋白基因,并克隆至pcDNA3.1载体中,构建HCV核心蛋白基因的真核表达载体HCV-C/pcDNA3.1。用HCV-C/pcDNA3.1和含COX-2启动子的荧光素酶报告载体COX2pro1.5kb/luc瞬时共转染HepG2细胞,测定萤火虫荧光素酶的活性,并用Westernblot检测COX-2蛋白的表达水平。结果成功地构建了HCV-C/pcD-NA3.1重组质粒。瞬时转染后的HepG2细胞中,COX2启动子荧光素酶的活性显著增强。Westernblot检测,发现COX-2的表达明显升高。结论HCV核心蛋白在HepG2细胞中激活COX-2启动子,并且明显诱导COX-2的表达,为进一步研究COX-2与HCV致病性的关系提供了新的实验依据。     

HCV非结构蛋白NS5A基因的斑马鱼肝脏表达模型

目的建立HCV非结构蛋白NS5A基因在斑马鱼肝脏特异表达的模型,研究HCVNS5A的体内作用机制并初步探讨HCVNS5A对肝病理标志基因表达的影响。方法克隆肝基因表达调控序列——斑马鱼脂肪酸结合蛋白基因增强子序列（eFABP）和HCV非结构蛋白基因NS5A序列,利用CMV启动子序列,构建HCVNS5A基因和报告基因绿色荧光蛋白基因eGFP在肝脏共表达的基因构件pFC-5AiR。经细胞转染实验验证所建构件的报告基因DsRed表达红色荧光蛋白后,将该基因构件线性化并经显微注射导入斑马鱼胚胎;通过荧光显微镜观察和整体原位杂交技术对目的基因NS5A的表达进行定位,验证其肝脏特异性表达。采用RT-PCR方法和westernblot方法对HCVNS5A基因的转录和翻译水平进行检测;并检测肝脏病理相关的标志基因的转录水平变化。结果细胞转染实验证明基因构件pFC一5AiR的报告基因DsRed能够在肝癌细胞Huh7中表达;斑马鱼胚胎注射该基因构件后在肝脏能够观察到红色荧光蛋白基因DsRed的表达;RT-PCR和westemblot结果显示HCV基因NS5A能够在斑马鱼体内正确表达;原位杂交结果进一步证明了NS5A的表达集中在斑马鱼肝脏内。进一步RT-PCR检测表明HCVNS5A在斑马鱼体内的表达可导致一些肝代谢和纤维化相关基因的上调,如Adiponectin、LDLR、Argsyn、TGF-β和HMGR等,推测NS5A在肝脏脂肪病变和纤维化中具有一定作用。结论成功建立了斑马鱼肝脏表达HCVNS5A的模型;初步数据表明HCVNS5A在斑马鱼体内的表达与部分肝代谢和纤维化标志基因的异常表达相关;该模型可以用于HCVNS5A的体内病理机制的研究。     

HCV核心蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学特性研究

目的 研究HCV核心蛋白在大肠杆菌中的非融合表达及重组蛋白的免疫学特性。方法 用DNA重组技术在两种表达质粒（pQE3O和pTrcHisA）、4种宿主菌（DH5a,TOP10,BL21和M15）中表达HCV全长及羟基端部分缺失的核心蛋白（aal～191,aal～154和aal～69）,表达蛋白经SDSF-PAGE检测,免疫印亦分析,亲和层析法纯化后免疫BALB/C小鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HCV抗体水平。结果 HCV核心蛋白C154,C191在pQE30/M15中获得了表达,表达量分别占菌体总蛋白的18.2%和9.3%。免疫印迹分析的结果显示在C154和C191相应位置处出现杂交条带。ELISA结果显示C154和C191诱导小鼠产生了抗HCV抗体。结论 表达的重组蛋白具有抗原特异性和免疫原性。“截断”型HCV核心蛋白的抗原性和免疫原性并未因羧端的部分缺失而减弱。     

分泌型卷曲相关蛋白4在肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓中的表达变化

目的 探讨分泌型卷曲相关蛋白4(sFRP4)在成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内的表达变化,及sFRP4在ALS发病中的作用.方法 选取ALS转基因鼠和同窝野生型鼠各30只,分别于鼠95d、108d和122d取材,部分鼠经4%多聚甲醛心脏灌注固定,分离脊髓和制备冷冻切片,部分鼠分离脊髓,提取RNA和蛋白.分别应用免疫组织化学染色技术、RT-PCR和Western blotting检测sFRP4 mRNA和蛋白水平在不同时间点的变化情况.结果 与同窝野生型鼠比较,ALS转基因鼠sFRP4 mRNA和蛋白表达在95d、108d和122d均升高(P< 0.05).免疫组织化学结果 显示,sFRP4阳性细胞主要分布在脊髓灰质前角,白质轴突呈阳性反应,与同窝野生型鼠比较,ALS转基因鼠sFRP4阳性细胞明显增多.免疫荧光双标结果 显示,sFRP4标记的阳性细胞共表达胶质纤维酸性蛋白和β-tubulin Ⅲ,ALS转基因鼠sFRP4/GFAP双阳性细胞增多.结论 在ALS转基因鼠发病脊髓中sFRP4阳性细胞明显增多,sFRP4 mRNA和蛋白表达升高,表明sFRP4与肌萎缩脊髓侧索硬化症的发生密切相关.     

肌萎缩侧索硬化症的动物模型:表达鼠超氧化物歧化酶基因的转基因鼠

肌萎缩侧索硬化症是一种进行性神经变性疾病,主要侵及运动神经元。有家族性常染色体显性疾病的个体发生铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD,SOD-1)基因突变,该基因编码一种广泛表达的酶,该酶在氧自由基的清除过程中起着关键作用。本观察提示SOD-1活性的改变或降低可能在神经变性过程中起作用。为进一步探讨这种可能性,作者使鼠的SOD-1基因发生突变,使其与在人类家族性肌萎     

HCV核心蛋白核酸疫苗转化的减毒鼠伤寒沙门菌在小鼠的免疫原性

目的：观察以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的丙型肝炎病毒(HCV)口服型核酸疫苗在BALB／C小鼠的免疫原性，探讨用该免疫方法预防丙型肝炎的可行性。方法：将HCV核心蛋白真核表达质粒pcDNA3．1core(核酸疫苗)转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL7207，将重组沙门菌和pcDNA3．1core分别口服或肌注接种BALB／C小鼠，检测小鼠的体液和细胞免疫应答及观察其安全性。结果：口服重组沙门菌或肌注接种核酸疫苗均在小鼠诱导相似水平的抗HCV核心蛋白IgG，但口服重组沙门菌诱导的细胞免疫应答明显强于肌注接种核酸疫苗，未见小鼠出现明显毒副反应。结论：减毒沙门菌作为HCV核酸疫苗的载体能增强其诱导的细胞免疫应答，这为研制高效免疫、成本低廉、接种方便的HCV疫苗提供了一个新的可行途径。     

外源基因在转基因蚊虫中表达的研究进展

利用转基因技术对蚊虫进行遗传修饰使其密度下降或降低其传播疾病的能力是控制蚊媒传染病的一个新策略。其核心问题是外源基因在转基因蚊虫体内的表达。本文从转基因蚊虫的表达载体、外源基因表达特性及效应、转基因蚊虫研究存在的问题及发展前景等方面对该领域的研究进展进行了综述。     

HCV非结构基因NS4的基因工程表达

用基因工程法在大肠杆菌中表达丙肝病毒(HCV)的部分非结构NS4基因,经分子杂交分析,表达产物可特异地与抗-HCV非结构区抗体反应。在SDS-PAGE中,表达产物呈现一条约49kD的融合蛋白带,约为菌体总蛋白的20％。用部分纯化的表达产物制备的ELISA试剂,可检测出国家丙肝诊断试剂参考品全部10个阳性样品中的8个,而对全部10个阴性样品均未出现假阳性反应,其检出率和P/C值均高于目前国内所用的5—1—1合成肽。显示了该表达产物用于丙肝诊断试剂及确证试剂的可能性。     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.