质粒介导RNA干扰抑制视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮生长因子表达

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）短发夹RNA（shRNA）表达质粒稳定转染对视网膜母细胞瘤（RB）细胞中VEGF表达的作用。方法构建VEGF shRNA表达质粒p4．1CMV—VEGF shRNA,以脂质体介导其转染两种RB细胞系SO—RB50和HXO—RB44,新霉素筛选结合梯度稀释法获得p4．1CMV—VEGF shRNA阳性RB细胞单克隆,继续培养扩增建立p4．1CMV—VEGF shRNA阳性RB细胞,用荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测RB细胞中VEGF基因的表达,并用酶联免疫吸附（ELISA）法检测RB细胞上清中VEGF蛋白的表达;以与哺乳动物基因组无同源性的shRNA表达质粒p4．1CMV—Neg shRNA作为阴性对照,同时以未做任何处理组作为空白对照。结果成功构建p4．1CMV—VEGF shRNA并获得其表达阳性的RB细胞克隆。阴性对照组和空白对照组SO-RB50细胞的VEGF基因表达量分别为实验组的5．02倍和6．32倍;阴性对照组和空白对照组HXO—RB44细胞分别为实验组的5．70倍和4．86倍。实验组SO—RB50细胞上清中,VEGF蛋白浓度为（187．69±83．89）μg/L,显著低于阴性对照组（822．98±187．98）μg/L和空白对照组（865．76±170．33）μg／L,差异有统计学意义（均P〈0．01）;实验组HXO—RB44细胞上清中,VEGF蛋白浓度为（162．20±66．33）μg／L,与阴性对照组（764．33±164．79）μg／L和空白对照组（828．22±145．94）μg／L比较,差异也有统计学意义（均P〈0．01）。结论VEGF shRNA表达质粒稳定转染可高效抑制RB细胞中VEGF的表达,靶向VEGF的RNA干扰可作为拮抗VEGF并治疗RB的有效手段。（中华服科杂志,2007,43：493-498）     

视网膜母细胞瘤中血管内皮生长因子的免疫组织化学研究

目的 研究视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达与RB组织学分裂和浸润能力的关系。 方法 应用链霉亲和素蛋白 生物素酶标免疫组织化学方法(labell streptavidin biotin method,LSAB法),对40例RB组织中VEGF的表达进行分析。 结果 分化型RB(13例)组织VEGF表达低于未分化型(27例)(P＜0.05); 视神经浸润组(14例)VEGF表达明显高于视神经未浸润组(26例)(P＜0.05)。 结论 VEGF表达与RB组织学分型及浸润能力相关。 (中华眼底病杂志, 1999, 15: 238-240)     

RNA干扰抑制视网膜母细胞瘤血管内皮生长因子基因的表达

目的利用RNA干扰技术在视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)细胞内诱导RNA干扰(RNAi),抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达,在体外细胞水平探讨RNAi对视网膜母细胞瘤治疗的可行性。方法构建靶向VEGF基因的siRNA(VEGF-siRNA),转导入RB细胞,在瘤细胞内诱导RNAi,采用RT-PCR、细胞增殖抑制实验、Northern杂交等技术检测siRNA处理前后RB细胞增殖及VEGF基因表达变化。结果成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,RT-PCR发现VEGF-siRNA在RB细胞系中,能明显抑制VEGF基因的表达,抑制率为72%;对RB细胞生长抑制率达47%;VEGF基因的mRNA表达降低了78%。结论VEGF-siRNA在体外能明显抑制了视网膜母细胞瘤细胞增殖和VEGF基因的表达。     

综合治疗前后视网膜母细胞瘤微血管密度和血管内皮生长因子表达研究

目的 观察视网膜母细胞瘤(RB)未行综合治疗和行综合治疗后微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)表达以及与RB肿瘤视神经浸润和综合治疗后复发的关系.方法 61例RB石蜡标本纳入研究.分为未行综合治疗直接摘除眼球(未治疗)组、综合治疗前计划眼球摘除(计划眼摘)组、综合治疗后肿瘤复发(复发)组,3组分别为52、...     

视网膜母细胞瘤综合治疗后临床组织病理学特点及VEGF和Ki-67蛋白表达研究

目的 探讨视网膜母细胞瘤(RB)综合治疗后组织病理学和临床特点,以及综合治疗后RB的血管内皮细胞生长因子(VEGF)、Ki-67蛋白的表达情况。方法 对9例综合治疗后行眼球摘除术的病例的组织病理学和临床资料进行回顾性分析。使用免疫组织化学和实时多聚合酶链反应方法测量VEGF的表达,用免疫组织化学法测Ki-67的表达。结果 在9例眼球中,6例为RB国际分期D期的肿瘤,3例为E期。眼球摘除的原因为：肿瘤广泛玻璃体种植8例,肿瘤复发3例,大量视网膜下积液,肿瘤视网膜下种植3例,玻璃体出血2例,完全的牵引性视网膜脱离3例。在综合治疗期间肿瘤都表现为缩小,基底部宽度平均缩小43.7％,厚度平均缩小57.9％。3例表现为奶酪-芝士状消退模式,1例表现为鱼肉状消退模式,5例表现为混合型消退模式。计划性眼球摘除病例的VEGF表达低于复发性RB。结论 综合治疗后眼球摘除的最主要原因为广泛玻璃体种植。混合型消退模式是较常见的消退模式。综合治疗过程中行计划性眼球摘除病例VEGF表达降低。VEGF表达增高在综合治疗后RB的复发中可能起到一定的作用。     

内皮抑素基因转移抑制视网膜新生血管的实验研究

目的评价脂质体介导的内皮抑素(ES)基因转移抑制缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管的效果。探讨基因转移抑制视网膜新生血管的可行性。方法制备阳离子脂质体及PCDNA3ES复合物。选1周龄C57Bl/6N小鼠置于氧浓度为(75±2)%的氧箱中5d。回到正常环境中诱导视网膜新生血管模型。在小鼠离开氧箱的当日,向ES注射组鼠玻璃体腔注射2μl脂质体PCDNA3ES复合物;载体对照组注射等量脂质体空白载体复合物;空白对照组小鼠注射等量PBS。采用ES抗体免疫组化方法检测ES蛋白在视网膜的表达;回到正常环境中后5d,采用荧光标记的右旋糖酐血管灌注下视网膜铺片方法观察视网膜新生血管的分布;组织学切片观察比较突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数量;透射电镜观察ES转移对视网膜超微结构的影响。结果免疫组化检查发现ES注射组小鼠玻璃体腔注射ES后24h开始有ES表达,主要位于视网膜神经纤维层细胞中,维持至少2周仍见表达;视网膜铺片观察可见空白对照组在无灌注区边缘均可见新生血管芽及荧光渗漏。ES注射组见新生血管芽明显减少;组织学检查ES注射组较其他两组突破视网膜内界膜的细胞数量减少,差异有统计学意义;ES转移后电镜下视网膜各层超微结构未见明显改变。结论采用玻璃体腔注射方法行脂质体介导的内皮抑素基因转移可以一定程度抑制缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管生长,对视网膜无明显的毒副作用。应进一步优化转移条件以提高治疗效果。     

视网膜母细胞瘤抑制基因分子生物学研究进展

视网膜母细胞瘤（ＲＢ）由于仅发生在婴幼儿，又有遗传与非遗传二种形式，一直被认为是研究肿瘤遗传学及肿瘤发病机理的理想模式。有关肿瘤发生的“二次突变论”、“隐形调节基因假说”及“抗癌基因理论”都是在研究ＲＢ的基础上建立并完善的。目前Ｒｂ基因研究是当今国际上肿瘤学、细胞生物学及分子生物学的前沿课题，因为Ｒｂ基因除参与ＲＢ肿瘤的形成外，在正常细胞周期的调控及多种不同组织学来源的恶性肿瘤发生发展中也起重要作     

视网膜母细胞瘤的DNA含量研究

目的 :研究不同类型视网膜母细胞瘤 (Retinoblastoma ,Rb)标本中的DNA含量及细胞周期各时相分布 ;探讨影响Rb增殖和分化的因素。方法 :应用流式细胞学技术检测 2 0例Rb标本的DNA含量及细胞周期各时相分布 ,定量分析其增殖指数 ,并将各指标进行比较。结果 :正常视网膜组织细胞与不同分化类型Rb的DNA组方图明显不同。Rb的DNA指数 (DI)及S期细胞百分比 (SPF)在不同的Rb视神经侵犯程度、分化类型中具有显著的统计学差异 :Rb累及视神经筛板后的Rb组的DI和SPF值均高于未累及筛板组 (P <0 0 5 ) ;分化型Rb的DI明显低于未分化型组 (P <0 0 1) ,而SPF明显高于未分化组 (P<0 0 1)。结论 :视网膜母细胞瘤DNA含量的研究有助于认识Rb的发生、发展规律 ,具有一定的理论价值与应用前景     

血管内皮细胞生长因子受体嵌合蛋白抑制视网膜新生血管化的实验研究

目的观察血管内皮细胞生长因子受体嵌合蛋白对缺血性视网膜病变小鼠模型的视网膜新生血管化的抑制作用。方法以高浓度氧诱导C57BL/6J小鼠建立视网膜缺血性病变动物模型,应用不同浓度VEGF受体嵌合蛋白进行玻璃体腔内注射,在组织切片上计数和比较正常和实验条件下以及不同浓度药物注射后视网膜新生血管芽细胞核数。结果视网膜新生血管芽细胞核数:正常对照组(1.06±2.08)个;高氧对照组(128·69±46.07)个,flt-1小剂量治疗组(85.31±35.46)个,flt-1大剂量治疗组(63.13±24.40)个,flk-1小剂量治疗组(90·50±38.03)个,flk-1大剂量治疗组(67.13±23.13)个,flt-1 flk-1治疗组(42.69±17.75)个。各用药组与高氧对照组间均有显著性差异,P<0.05。结论血管内皮细胞生长因子受体嵌合蛋白能有效抑制视网膜新生血管的增生。     

血管内皮生长因子受体KDR基因胞外段1-3区基因转染抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的研究

目的 评价脂质体介导的血管内皮生长因子受体KDR基因胞外段1-3区(KDRn3)基因转染抑制氧诱导的视网膜新生血管的效果.方法 选1周龄C57Bl/6N小鼠置于氧浓度为75%±2%的氧箱中5 d.回到正常环境中诱导视网膜新生血管模型.在小鼠离开氧箱的当日,向转染组小鼠玻璃体腔注射脂质体pEGFP-N1/KDRn3复合物1 μl;脂质体对照组注射等量脂质体;空白对照组小鼠注射等量PBS.回到正常环境中后5 d,采用视网膜铺片及视网膜冰冻切片在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白在视网膜的表达;采用荧光标记的右旋糖酐血管灌注下视网膜铺片方法观察视网膜新生血管的分布并测量无灌注区面积;组织学切片观察比较突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数量.多组比较采用方差分析,有统计意义后进行两两比较的q检验.结果 转染组视网膜铺片见视网膜局部散在点状绿色荧光信号,空白对照组与脂质体对照组未见绿色荧光信号;视网膜冰冻切片见转染组视网膜神经节细胞层、内核层部分细胞胞质内见绿色荧光表达,空白对照组与脂质体对照组视网膜各层未见绿色荧光表达;视网膜铺片观察可见空白对照组与脂质体对照组在无灌注区边缘均可见新生血管芽及荧光渗漏,转染组见新生血管芽明显减少,生后第17天A、B、C 3组新生血管模型小鼠各组视网膜无灌注区面积分别为(1.33±0.49)、(2.75±0.70)、(2.12±0.35)mm2,组间比较差异有统计学意义(F=17.61,P＜0.01＝.正常对照组及A、B、C组视网膜表面突破内界膜的血管内皮细胞核计数分别为0.20±0.51、13.58±2.48、23.05±3.40及21.70±2.89,组间比较差异有统计学意义(F=1085.25,P＜0.05＝.结论 pEGFP-N1/KDRn3基因转染可不同程度抑制氧诱导C57,Bl/6J小鼠视网膜新生血管的生长.

Abstract：

Objective To evaluate the effect of liposome mediated plasmids KDRn3 injected into the vitreous to inhibit experimental retinal neovascularization. Methods One-week-old C57BL/6N mice were exposed to 75% ± 2% oxygen for 5 days, then returned to the room air to induce retinal neovascularization. Cationic liposome mediated KDRn3 comp-lex (1 μl) was injected into the vitreous in the treatment group. PBS 1 μl or liposome were injected in the control group. The pEGFP-N1/ KDRn3 expression was observed by using fluorescence microscope. Retinal neovascularization was evaluated by counting the number of vascular endothelial cell nuclei on the vitreal side of the inner limiting membrane of the retina and measuring the areas of non-perfusionsin in central retina. Results KDRn3 protein was expressed both in the ganglion layer and in the inner layer. Retinal wholemount preparation of retinal neovascular animal model showed that prominent neovascular tuft and fluorescein leakage and large areas of non-perfusionsin in central retina. Fewer neovascular tufts and fewer areas of non-perfusionsin could be seen after pEGFP-N1/KDRn3 injection. There were statistic differences between control group and pEGFP-N1/ KDRn3 injecting group with the number of vascular endothelial cell nuclei on the vitreal side of the inner limiting membrane of the retina(0. 20 ±0. 51, 13. 58 ±2. 48,23. 05 ±3. 40,21. 70 ± 2. 89;F = 1085. 25, P ＜ 0. 05 ) and the areas of non-perfusionsin in central retina [(1. 33 ± 0. 49 ) , ( 2. 75 ± 0. 70 ) , ( 2. 12 ± 0. 35) mm2; F = 17. 61 , P ＜ 0. 01] . Conclusion pEGFP-N1/KDRn3 gene transfer can inhibit retinal neovascularisation in C57Bl/6J mice of ischaemia-induced retinal neovascularisation on some extent.     

羧甲基葡聚糖磁性纳米颗粒与脂质体介导人可溶性fms-样酪氨酸激酶受体-1的转染比较

目的 比较羧甲基化葡聚糖(CMD)磁性纳米颗粒与脂质体LipofectamineTM2000对人可溶性fms-样酪氨酸激酶受体-1(sFlt-1)第2～4区基因片段的转染率.方法 构建真核表达质粒编码增强型绿色荧光蛋白质粒(pcDNA3.1-EGFP)/sFlt-1(2～4),采用酶切、电泳及基因测序鉴定.将实验分为磁颗粒组、脂质体组和未转染对照组进行.转染后24、48 h,倒置相差荧光显微镜下观察细胞绿色荧光分布;流式细胞仪检测细胞绿色荧光表达率;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫蛋白印迹(Western blot)法检测sFlt-1(2-4)mRNA和蛋白表达;噻唑蓝(MTT)比色法观测细胞生长情况,计算各组细胞相对增长率(RGR);Hoeehst细胞核染色法观察各组细胞凋亡情况.结果 重组质粒pcDNA3.1/sFlt-1(2～4)酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时出现大小为915碱基对的条带.流式细胞仪检测发现,磁颗粒组平均转染率为45%,脂质体组平均转染率21%;二者比较,差异有统计学意义(t=2.541,P<0.05).RT-PCR和Western blot观察发现,转染后48 h磁颗粒组细胞sFlt-1(2～4)mRNA和蛋白表达均明显高于脂质体组(t=2.454,2.398;P值均<0.05).转染后24、48 h,磁颗粒组RGR与未转染对照组间差异无统计学意义(t=1.436,P>0.05),脂质体组RGR与未转染对照组及磁颗粒组间差异均有统计学意义(t=2.412,2.545,P值均<0.05);磁颗粒组细胞凋亡率与未转染对照组间差异无统计学意义(t=1.436,P>0.05),与脂质体组间差异有统计学意义(t=2.236,P<0.05).结论 CMD磁性颗粒较脂质体LipofeetamineTM2000可获得更高的sFlt-1(2～4)基因片段转染率.     

视网膜母细胞瘤基因治疗研究进展

视网膜母细胞瘤（RB）是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤,传统的治疗方法主要采取眼球或眼眶内容物摘除术、放射疗法及化学疗法,但均不能明显改善预后,而RB的远期影响往往带来局部的破坏性后果。基因疗法为RB的治疗及预后的改善带来了契机,具有传统方法不可比拟的优势。就基因转染载体、基因导人方式、常用的基因技术（如RNA干扰技术）和治疗靶点等方面对RB基因治疗的研究进展进行综述。     

视网膜母细胞瘤血管生成拟态与临床病理学特征关系的研究

目的 探讨视网膜母细胞瘤(Rb)标本中是否存在血管生成拟态(VM),并分析VM与Rb临床病理特征及其与缺氧诱导因子-1αa(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的关系,进一步阐述VM的临床意义.方法 实验研究.收集60例Rb患者、10例正常人视网膜组织石蜡标本及相关临床病理资料,应用过碘酸-雪夫(PAS)与CD34双重染色以及免疫组织化学染色法检测60例Rb中是否存在VM和分布,观察与临床病理学特征的关系特点;检测HIF-1α、VEGF蛋白表达,分析Rb瘤组织中VM与HIF-1α、VEGF表达的关系;用CD34抗体进行肿瘤血管内皮染色,并计数肿瘤微血管密度(MVD).Rb和正常视网膜组织中的VM、HIF-1α、VEGF蛋白阳性表达的比较采用χ2检验;VM阳性组和VM阴性组的MVD值的比较采用q检验.结果 HE染色法观察到Rb中存在VM,其为Rb细胞构成的管腔样结构,无内皮细胞衬覆,腔内可见红细胞.CD34和PAS双重染色结合CD34、神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色进一步证明Rb中存在VM,60例Rb中VM阳性率为18.33%(11/60),其中随着R-E分级的增高,VM阳性表达率明显增加,差别具有统计学意义(χ2=8.861,P<0.05);分化型Rb中VM阳性率(4.34%)低于未分化型中VM阳性率(22.02%)(χ2=4.872,P<0.05);此外,HIF-1α、VEGF在Rb的VM形成过程中的阳性表达率依次为VM阳性组大于VM阴性组大于正常组;微血管密度计数高低与VM的表达有关,VM阴性组的MVD值(49.77±2.05)高于VM阳性组MVD值(36.53±1.15).结论 Rb中存在VM,且肿瘤恶性程度越高,形成VM能力越强.存在VM的Rb组织HIF-1α、VEGF高表达,提示HIF-1α、VEGF在VM的形成中可能起促进作用.     

基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9和血管内皮生长因子在视网膜母细胞瘤中的表达

　　目的　观察基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9和血管内皮生长因子(VEGF)在视网膜母细胞瘤(RB)中的表达及其与RB分化程度和视神经浸润的关系。方法　经病理检查确诊的40例RB眼球石蜡标本纳入研究。按照RB细胞中有无菊形团排列以及RB肿瘤细胞是否浸润视神经分为分化型、未分化型以及视神经浸润、视神经无浸润组。其中,分化型15例,未分化型25例;视神经浸润13例,视神经无浸润27例。采用免疫组织化学方法检测其MMP-2、MMP-9和VEGF的表达,对比分析MMP-2、MMP-9和VEGF表达与肿瘤病理组织分型和视神经是否侵润之间的关系。结果　40例RB中,MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性表达率分别为52.5%、57.5% 和72.5% 。未分化型RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性表达均高于分化型RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性表达,差异有统计学意义(χ²=9.037,9.253,8.095;P＜0.05);有视神经浸润的RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性水平均高于无视神经浸润RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的阳性水平,差异有统计学意义(χ²=11.045,10.243,8.956;P＜0.05)。RB中MMP-2、MMP-9和VEGF的表达呈正相关关系(r=0.126,0.314;P＜0.05)。结论　RB细胞内有MMP-2、MMP-9和VEGF的表达。MMP-2、MMP-9表达与VEGF表达存在相关性。MMP-2、MMP-9和VEGF的表达水平与视神经浸润存在密切的关系。       

米诺环素对缺氧猴脉络膜视网膜血管内皮细胞表达血管内皮生长因子受体的影响

目的 观察缺氧状态下猴脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A）血管内皮生长因子受体（VEGFR）-1和VEGFR-2的表达情况及米诺环素的干预效果。方法 培养RF/6A并将细胞分为正常对照组、缺氧对照组、米诺环素低剂量组(0.5 μmol/L）、米诺环素中剂量组（5.0 μmol/L）、米诺环素高剂量组（50.0 μmol/L）。实时定量聚合酶链反应（PCR）和免疫组织化学染色检测VEGFR-1、VEGFR 2的mRNA表达和蛋白表达。结果 实时定量PCR检测结果显示,各组细胞中VEGFR-1 mRNA的表达水平在24（F=0.17）、48（F=1.53）、72 h（F=2.04）各时间点未发生显著变化,差异无统计学意义（P＞0.05）。72 h后,米诺环素低(t=469)、中(t=20.16)、高(t=17.12)剂量组VEGFR 2 mRNA表达水平与缺氧对照组比较,差异均有统计学意义（P＜0.001）。免疫组织化学检测结果显示,各组均可见表达VEGFR-1、VEGFR-2蛋白的阳性细胞。VEGFR-1蛋白表达水平偏低,染色浅或中度棕色,主要位于内皮细胞胞膜和细胞质中,各组细胞中VEGFR-1蛋白的表达水平在各时间点比较,差异无统计学意义（F _{24 h}=0.251,F _{48 h}=0.340,F_{72 h}=0.589;P＞0.05）;VEGFR-2蛋白表达水平较高,各组内皮细胞胞膜上均可见棕黄色染色物质,细胞质中也见少量表达,缺氧对照组染色强度明显比正常对照组强,并且与米诺环素处理各组间VEGFR-2蛋白表达比较,差异有统计学意义（F_{24 h}=19.147, F_{48 h}=14.893,F _{72 h}=11.984;P＜0.05）。结论 缺氧RF/6A VEGFR-2表达上调,米诺环素对其有一定抑制作用。     

血管内皮生长因子及其受体在实验性脉络膜新生血管中的表达

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)及其FLK1受体在氪激光诱导的棕色挪威(BN)大鼠脉络膜新生血管(CNV)中的表达。方法 应用氪激光对30只雄性BN大鼠实验眼进行视网膜光凝,创建CNV模型,分别于光凝后3、7、14、21、28及56 d行荧光素眼底血管造影(FFA),处死大鼠后摘除眼球,制作组织病理学标本观察,原位杂交检测VEGFmRNA,免疫组化检测VEGF和FLK1受体。结果 正常BN大鼠视网膜神经节细胞层、内核层、色素上皮层、视网膜及脉络膜血管内皮细胞中均表达VEGFmRNA。实验眼光凝后3 d,光凝区视网膜神经节细胞层、内核层、外核层缺损区、视网膜及脉络膜血管内皮细胞均表达VEGFmRNA,此时视网膜下未形成CNV;3-21 d视网膜内VEGFmRNA表达水平逐渐下降(P<0.01);21 d与28 d和56 d比较,VEGFmRNA表达水平差异无显著意义(P>0.05)。光凝后7 d,FFA检查可见光凝区有圆盘状荧光素渗漏。病理切片可见视网膜下形成CNV,CNV中VEGFmRNA表达阳性;7～21 d,CNV中VEGFmRNA阳性染色面积及吸光度(A)值逐渐增加(P<0.01);21 d后VEGFmRNA表达水平差异无显著意义(P>0.05)。正常视网膜和脉络膜血管内皮细胞及视网膜神经节细胞层FLK1受体表达阳性;光凝后7 d,CNV中FLK1受体表达阳性;随CNV的增生,FLK1受体阳性染色面积及A值逐渐增加(P<0.01);21 d与28 d和5