锥虫属原虫动基体DNA分子生物学及其应用研究进展

<正> 近年来分子生物学及其技术在研究寄生性原虫方面的应用愈来愈广,目的在于确定寄生性原虫的特征、生产抗原、诊断、了解原虫与宿主之间的关系及疫苗制备等,主要手段如DNA重组技术、DNA酶谱分析及单克隆抗体技术等。锥虫属原虫为原生动物门结构最为简单的单细胞真核生物,主要包括引起非洲锥虫病(睡眠病)的布氏锥虫(T·brucei)、引起美洲锥虫病(恰加斯病)的枯氏锥虫(T·cruzi),在我国为引起动物伊氏锥虫病的伊氏锥虫(T·evansi),以及在全球范围内引     

α-辅肌动蛋白在IgG型抗双链DNA抗体与系膜细胞结合中的作用

目的探讨α-辅肌动蛋白在介导IgG型抗双链DNA(dsDNA)抗体与系膜细胞结合过程中的作用。方法将体外培养的大鼠系膜细胞株分成4组,其中3组分别与含有IgG型及IgM型抗dsDNA抗体(Ⅰ组)、含IgM型抗dsDNA抗体(Ⅱ组)以及正常(Ⅲ组)的大鼠血清共同孵育;Ⅳ组预加兔抗鼠α-辅肌动蛋白单抗[并分出少许细胞与辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗兔lgG孵育,二氨基联苯胺(DAB)显色],然后与Ⅰ组同样的血清进行孵育。4组都加入异硫氰酸荧光素(FJTC)标记羊抗大鼠IgG单抗,采用流式细胞仪测定细胞表面荧光指数值,同时检测各组系膜细胞的增殖率与活细胞比例。结果从Ⅳ组分出并与HRP-羊抗兔IgG孵育的系膜细胞经DAB显色呈阳性;Ⅰ-Ⅳ组系膜细胞的表面荧光指数分别为1.59±O.22、0.65±0.17、0.66±0.18及0.72±0.16,其中Ⅰ组较Ⅱ～Ⅳ组高(P<0.05),而各组细胞的增殖水平与活细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。结论IgG型抗dsDNA抗体可能通过α-辅肌动蛋白与系膜细胞发生交叉结合反应。     

抗核小体抗体、抗双链DNA抗体和抗超敏双链DNA抗体与系统性红斑狼疮的相关性研究

目的 通过检测系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中抗核小体抗体(AnuA)、抗双链DNA (dsDNA)抗体和抗超敏双链DNA (dsDNA-NcX)抗体的水平,分析其在SLE患者中的敏感性、特异性及与其他实验室指标的相关性.方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法分别检测91例SLE患者、45例非SLE疾病对照和46例健康对照组血清中AnuA、抗dsDNA抗体和抗dsDNA-NcX抗体的水平,比较3种抗体对SLE诊断的敏感性和特异性,评价其与其他实验室指标的关系.结果 SLE患者AnuA、抗dsDNA抗体和抗dsDNA-NcX抗体的阳性率分别为49.45％、56.04％和61.54％;特异性分别为94.51％、94.51％和100.00％.AnuA、抗dsDNA抗体和抗dsDNA-NcX抗体均与SLEDAI评分呈正相关(r=0.50,P=0.00;r =0.49,P=0.00;r =0.42,P=0.00).ANA的滴度与AnuA的浓度呈正相关(r=0.30,P=0.00),与抗dsDNA抗体的滴度无相关性(r=0.19,P=0.08),与抗dsDNA-NcX抗体的浓度呈正相关(r=0.50,P=0.00).红细胞沉降率在抗dsDNA-NcX抗体、抗dsDNA抗体阴性和阳性组间比较差异无统计学意义(x2=0.76,P=0.38;x2=0.13,P=0.18),而在AnuA阴性与阳性组间比较差异有统计学意义(x2 =20.31,P=0.00).CRP及24小时尿蛋白定量在三者阴性与阳性组间比较差异无统计学意义.补体C3、C4在AnuA、抗dsDNA抗体和抗dsDNA-NcX抗体的阴性与阳性组间比较差异有统计学意义(x2=9.84,P=0.00;x2=16.53,P=0.00;x2 =10.33,P=0.00;x2 =11.61,P=0.00;x2 =12.69,P=0.00;x2=8.77,P=0.00).胱抑素在抗dsDNA抗体和AnuA的阴性与阳性组间比较差异无统计学意义,而在抗dsDNA-NcX抗体阴性与阳性组间比较差异有统计学意义(x2 =4.04,P=0.04).结论 抗dsDNA-NcX抗体可作为SLE的特异性抗体之一,其敏感性和特异性均高于抗dsDNA抗体和AnuA,三者均与SLE的疾病活动相关,联合检测有助于评估病情.     

抗核抗体、抗双链DNA抗体研究与实验室检测的进展

随着自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AID）研究的深入，自身抗体愈来愈受到临床的重视。出现了以自身抗体命名的疾病，如抗磷脂综合征、抗Jo21综合征，还出现了以自身抗体作为诊断标准和分型依据的疾病，如自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化。这些自身抗体在AID中研究，均极大地加速了AID的诊疗进程。随着循证医学的发展，AID的实验室检查，     

抗dsDNA抗体抗原识别及致病性的分子基础

抗双链ＤＮＡ抗体 (ｄｓＤＮＡ)是系统性红斑狼疮 (ＳＬＥ)的特异性和致病性抗体 ,几乎存在于所有病人血清中 ,并与临床表现密切相关。目前 ,越来越多的证据表明它是特异性抗原驱动的结果。本文就近年来对于抗ｄｓＤＮＡ抗体本身的结构特点、识别的抗原结构以及其致病机制的研究进展作一综述。1　抗ｄｓＤＮＡ抗体的分子结构抗ｄｓＤＮＡ抗体具有许多对外来抗原再次应答的特征 ,如ＩｇＭ向ＩｇＧ的类型转换以及体细胞突变。在抗ｄｓＤＮＡ抗体中 ,Ｖ区基因突变积累的结果常使其产生ｄｓＤＮＡ特异性和 /或增强结合ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ的…     

外源性双链DNA诱导小鼠狼疮样肾损害的病理学特征

目的 观察马疫锥虫双链DNA(dsDNA)诱导的小鼠狼疮样肾脏损害的病理学特征.方法 将分离纯化的马疫锥虫动基体DNA(kDNA)与不完全弗氏佐剂乳化混合,以皮下途径对健康BALB/c小鼠进行免疫.8周后,检测相关生化与免疫学指标并观察其肾脏病理学表现;同时与BXSB小鼠和抗dsDNA抗体阳性狼疮肾炎(LN)患者进行比较.结果 经马疫锥虫kDNA免疫后小鼠的免疫学指标符合LN的特征,肾脏损害以肾病综合征为主要表现;与BXSB小鼠和LN患者相比较,其肾脏病理改变有一定相似性,但以Ⅱ型(系膜细胞增殖)与Ⅳ型(弥漫性增殖)等类型为主.结论 马疫锥虫dsDNA诱导的小鼠肾脏损害与抗dsDNA抗体阳性的LN损害相似,可以作为研究该类型LN的有效工具.     

抗核小体抗体与抗C1q抗体在狼疮肾炎血清的表达及其临床意义

目的探讨抗核小体抗体与抗C1q抗体在狼疮肾炎（lupus nephritis，LN）患者血清的表达及其临床意义。方法使用酶联免疫吸附试验（ELISA）对46例LN患者血清进行检测，并与31例无肾炎临床表现的SLE患者作对照。结果LN患者血清中抗核小体抗体与抗C1q抗体浓度及阳性率显著高于SLE对照组（P〈0．01）。抗双链DNA（dsDNA）抗体、抗Sm抗体、抗nRNP抗体、抗心磷脂（aCL）IgG抗体有较高的阳性率，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。将抗核小体抗体、抗C1q抗体、抗dsDNA抗体、抗Sm抗体、抗nRNP抗体和aCLIgG抗体分别引入Logistic回归进行统计分析，结果显示入选的自变量包括抗核小体抗体、抗C1q抗体、抗dsDNA抗体（P〈0．05）。结论在LN患者中，存在着抗核小体抗体、抗C1q抗体的高表达。抗核小体抗体及抗C1q抗体在LN发病中起重要的作用。抗核小体抗体、抗C1q抗体、抗dsDNA抗体是反映SLE患者并发肾脏损害的重要指标，在LN诊断和判定其活动性方面有重要作用。     

抗双链DNA抗体阳性肝功能异常患者临床及生化特征

目的 探讨抗双链DNA抗体阳性肝功异常患者的临床及生化特征.方法 收集肝功异常患者血清884例,采用免疫印迹法检测抗双链DNA抗体.结果 抗双链DNA抗体阳性患者16例(1.81%),女性患者14例,男性2例;平均年龄(48.94±17.57)岁(9岁～69岁).其中自身免疫性肝炎13例(81.25%).16例抗双链DNA阳性患者中肝硬化8例(50%),亚急型重型肝炎2例,急性重型肝炎1例.ALT平均值为(433.91±405.86)U/L,AST平均值为(535.05±513.92)U/L,TBil平均值(182.46±149.11)μmol/L,DB il平均值为(118.33±103.97)μmol/L,PTA平均值为(75.27±31.22)%,IgG平均值(23.48 ±13.26)g/L.16例患者ANA抗体均阳性,并伴有多种自身抗体.结论 在抗双链DNA抗体阳性的肝功异常患者中AIH发病率较高,且病情较重.对抗双链DNA抗体阳性的肝功异常患者临床应予以重视.     

狼疮肾炎肾小球微血栓形成及其与抗凝血相关因子抗体抗磷脂抗体的相关性研究

目的 评估肾小球微血栓(GMT)在狼疮肾炎(LN)中的发生率,并探讨针对某些凝血相关因子的抗体和抗磷脂抗体在LN患者GMT形成中的临床意义.方法 连续收集124例LN患者肾活检组织标本和血浆,观察组织标本中GMT的发生率.并分成LN-GMT组和LN-non-GMT组;比较两组患者的疾病活动度、相关实验室检查指标和肾组织活动,慢性指数;测定患者的狼疮抗凝物(LA)、抗心磷脂抗体(ACL)、抗β2糖蛋白I(抗β2GP I)抗体、抗凝血酶抗体、抗纤溶酶抗体、抗组织型纤溶酶原激活物(t-PA)抗体和抗膜联蛋白AⅡ(Annexin A II)抗体.结果 GMT在LN中的发生率约为20.2%;LN-GMT组系统性红斑狼疮疾病活动指数(SLEDAI)、肾组织病变活动指数、肾组织病变慢性指数、尿蛋白定量(24 h)、血清肌酐、血清尿素氮的水平和高血压的发生率都较LN-non-GMT组高(P＜0.01);LN-GMT组LA、IgG型抗B2GP I抗体和抗凝血酶抗体阳性率均显著高于LN-non-GMT组(P＜0.05);两组IgG型ACL抗体、抗纤溶酶抗体、抗t-PA抗体和抗Annexin A II抗体阳性率差异均无统计学意义(P＞0.05);两组各抗体IgM型差异无统计学意义(P＞0.05).结论 LN中伴有GMT形成的患者肾脏病变重于无GMT者;LA、IgG型抗β2GP I抗体和抗凝血酶抗体与LN患者GMT形成相关.     

放射免疫分析法测定抗双链DNA抗体在系统性红斑狼疮诊断中的应用

目的 探讨放免分析(RIA)法测定抗ds-DNA在系统性红斑狼疮(SLE)中的应用及临床意义.方法 分别用RIA法和间接免疫荧光法检测SLE活动期、缓解期患者及对照者血清中抗ds-DNA、ANA的水平并分析它们之间的关系.结果 在SLE活动期RIA法测定的抗ds-DNA水平较对照者显著增高(P<0.01),其阳性率为94%,间接免疫荧光法测定抗ds-DNA、ANA阳性率分别为62%、98%;在SLE缓解期三者阳性率分别为35.6%、30%、94%.结论 放免法测定抗ds-DNA提高了诊断的敏感性,对SLE的诊断和治疗有重要意义.     

活性DNA诱导抗核抗体及系统性红斑狼疮样综合征

目的 寻找系统性红斑狼疮真正的核成分免疫原。方法 从ＣｏｎＡ活化的脾淋巴细胞中提取ＤＮＡ,然后同系免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,用ＥＬＩＳＡ方法测定ＩｇＧ类抗ｄｓＤＮＡ,抗组蛋白抗体,用免疫荧光法检测抗核抗体核型和免疫复合物沉积,用免疫印迹法测定抗可溶性抗原抗体,用考马斯亮蓝法检测抗体阳性的动物尿蛋白含量。结果 活性ＤＮＡ能诱导抗ｄｓＤＮＡ、抗组蛋白等多种抗核抗体生成,且能诱发同系小鼠产生ＳＬＥ样综合征。     

Detection and chronology of parasitic kinetoplast DNA presence in hair of experimental Leishmania major infected BALB/c mice by Real Time PCR

Hair can accumulate foreign chemical or biological substances. Recently, it has been reported that parasite DNA can also be detected in the hair of Leishmania infantum infected dogs. The aim of this work has been to find out whether parasite DNA incorporates in the hair of Leishmania major experimentally infected animals. For this purpose, a group of 4 BALB/c mice, intradermally inoculated in both ears with 1000 L. major V1 strain promastigote forms, was monitored for parameters associated to the infection during 35 days. Weekly, ear swelling was measured, and hair samples from ears and leg were collected. Blood samples were obtained before challenge and at day 35 post infection, when parasite load was measured in ear, lymph node and spleen by limit dilution. Ear swelling and other parameters observed in the infected mice were consistent with those described for this model. The presence of parasite kinetoplast DNA (kDNA) was detected by Real Time PCR in all ear and leg hair samples at the final timepoint. These data suggests that hair is a specialized tissue in the sequestration and removal of foreign DNA. Detection of DNA in hair could be, therefore, a useful tool to chronologically record the infection process during experimental mice assays.     

乙型脑炎病毒prME、E蛋白基因表达与DNA免疫效率对比研究

目的研究乙型脑炎病毒prME、E蛋白表达特点,比较不同接种途径所致DNA免疫效率。方法脂质体法将质粒(pJME、pJE)转染于HepG2、COS-1及KN73细胞;免疫印迹法分析质粒表达及与转染剂量关系,鉴定DNA免疫鼠血清抗体性质;肌内(100μg/次)与基因枪(3μg/次)注射法将质粒免疫BALB/c鼠,腹腔注射乙型脑炎病毒(105PFU/100μl)进行病毒攻击。80%空斑减少中和试验法检测中和抗体滴度。结果pJME转染的细胞内可检测到相对分子质量约为72×103与11×103两种蛋白,pJE转染的细胞内检测到相对分子质量约为54×103蛋白。蛋白表达程度由高至低顺序为10μg/孔>5μg/孔>3μg/孔。pJME与JE灭活疫苗免疫的BALB/c鼠在病毒攻击后21 d全部存活,pJE免疫鼠部分存活。pJME所致中和抗体滴度高于pJE。肌内注射组所致的最终中和抗体滴度等同于基因枪注射组。pJME免疫鼠产生血清抗体仅与JEV E蛋白发生反应。结论pJME与pJE在不同转染细胞内表达效率不同;转染剂量和蛋白表达呈一定剂量依赖性;pJME免疫效果优于pJE,基因枪注射所致免疫效率高于肌内注射;DNA免疫所致的中和抗体效价水平与保护性免疫效果呈一致性;DNA免疫鼠血清中和抗体含针对JEV E蛋白的抗JEV-E抗体。     

HBcAg DNA疫苗诱导小鼠（H—2^b）特异性细胞和体液免疫应答

目的 观察ＨＢｃＡｇ ＤＮＡ疫苗（ｐＪＷ４３０３／ＨＢｃ）免疫Ｃ５７ＢＬ／６小鼠（Ｈ－２＾ｂ）的特异性细胞和体液免疫应答。方法 基因枪和肌肉注射两种方法接种ＤＮＡ疫苗;ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清抗－ＨＢｃ（ＩｇＧ）及ＩｇＧ亚类（ＩｇＧ１,ＩｇＧ２ａ）;＾５１铬释放法检测小鼠脾细胞ＨＢｃＡｇ特异性ＣＴＬ活性。结果 该ＤＮＡ疫苗体外可表达ＨＢｃＡｇ;小鼠经基因枪或肌肉注射接种该疫苗后血清抗－ＨＢｃ滴度分     

HBsAg DNA疫苗诱导小鼠体液免疫及抑制转基因鼠表面抗原的产生

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应用形态学及DNA条形码技术鉴别广西横县地区两种豆螺

目的 目的 应用形态与DNA条形码技术鉴别广西横县两种形态相似、 栖息生境相同的豆螺——硬豆螺 （Bithynia ro? busta） 与赤豆螺 （Bithynia fuchsiana）。方法 方法 在广西横县的河流、 沟渠和池塘等生境采集赤豆螺和硬豆螺, 观察两种豆 螺的外部形态并测量其主要参数, 比较螺的雄性生殖系统形态。此外, 应用基于COI基因的DNA条形码技术进行螺种鉴 别, 并构建系统树。结果 结果 共采获两种豆螺29个, 包括19个赤豆螺和10个硬豆螺。两种豆螺的个体外形基本一致, 其 壳高、 壳宽及形状相近, 雄性生殖系统形态相似。COI基因序列变异较小, 22条序列共有11个变异位点。经序列的整理 和剪切后, 22个个体的COI基因片段均为517 bp, 无插入、 缺失位点。基于COI基因序列构建的系统树表明两类群的个 体明显聚为一支。结论 结论 根据形态学和COI基因序列证据, 采自广西横县的赤豆螺与硬豆螺可能为同种异名。     

淋病奈瑟球菌表面蛋白A基因疫苗的构建及其诱导小鼠的免疫应答

目的构建淋病奈瑟球菌表面蛋白A（NspA）基因疫苗，并接种小鼠，评价其诱导的体液和细胞免疫应答。方法将NspA基因插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／NspA，并经PCR、双酶切及测序鉴定。反转录一聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组织化学法分别检测NspA基因转染细胞后mRNA和蛋白的表达。以pcDNA3．1（＋）／NspA重组质粒免疫45只雄性BALB／c小鼠，试管凝集法检测免疫小鼠抗体滴度，ELISA检测IFN-γ水平，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测脾淋巴细胞增殖。提取接种部位股四头肌总DNA，PCR检测BALB／c小鼠肌细胞内NspA基因。结果成功构建pcDNA3．1（＋）／NspA基因疫苗，能在真核细胞中转录和表达。pcDNA3．1（＋）／NspA免疫组的抗体滴度达1：640，pcDNA3．1（＋）和PBS免疫组均无特异性抗体检出。空载体pcDNA3．1（＋）组IFN-γ为（23．79±11．85）pg／mL，pcDNA3．1（＋）／NspA免疫组为（169．71±30．52）pg／mL（P〈0．01）；脾淋巴细胞增殖的刺激指数（SI）分别为1．05±0．30和1．94±0．74（P〈0．01）。并证实NspA基因可在小鼠肌细胞中稳定存在。结论构建淋病奈瑟球菌NspA基因疫苗，将其免疫BALB／c小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫应答，为进一步用于淋病预防奠定了基础。