PI3K/Akt与染料木黄酮增敏阿霉素体外化疗人乳腺癌 MDA-MB-453 细胞的关系研究

目的 观察染料木黄酮(GEN)对HER2/neu高表达人乳腺癌MDA-MB-453细胞PI3K/Akt信号途径的抑制作用,探讨其在GEN增敏阿霉素(DOX)体外化疗乳腺癌MDA-MB-453细胞中的作用.方法 GEN、PI3K特异性抑制剂渥曼青霉素(WT)和DOX单独或联合处理体外培养的MDA-MB-453细胞,免疫细胞化学法检测HER-2/neu蛋白表达,免疫印迹法检测总Akt和磷酸化Akt蛋白(p-Akt)表达.结果 GEN对MDA-MB-453细胞HER2/neu和总Akt蛋白没有明显影响,但可明显降低p-Akt蛋白水平;同时WT也能明显降低p-Akt蛋白,并显著增强DOX抑制MDA-MB-453细胞生长的作用.结论 GEN增敏DOX体外化疗乳腺癌MDA-MB-453细胞株可能与其抑制PI3K/Akt信号途径有关.     

乳腺癌细胞过表达HER2/neu时经PI3K和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路下调野生型p53蛋白含量

目的 研究HER2/neu基因过表达对乳腺癌细胞野生型p53蛋白含量的影响并探讨其分子机制。方法 脂质体介导的HER2/neu基因转染MCF7细胞,G418筛选阳性克隆。Western印迹法鉴定HER2/neu蛋白表达,并同时检测p53及信号转导分子Akt,p-Akt,p-Raf,p-MEK,p-ERK蛋白含量,以及P13K信号通路抑制剂LY294002和MEK抑制剂U0126处理对p53蛋白含量的影响。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测p53 mRNA水平。结果 成功建立稳定过表达HER2/neu的MCF7细胞(MCF7-neu3),其HER2/neu蛋白表达量是对照组MCF7细胞的13倍。MCF7-neu3中p-Akt,p-Raf,p-MEK,P-ERK蛋白含量分别较MCF7细胞升高了2.5倍、2倍、1.6倍和1.6倍(P<0.01),p53蛋白含量仅为对照组细胞的40％(P<0.01),但p53mRNA表达无明显差异。在经PI3K信号通路抑制剂LY294002及MEK抑制剂U0126处理24 h后,MCF7-neu3细胞p53蛋白含量分别上升了1.7和1.5倍(P<0.01),在LY294002和U0126处理48 h后,p53蛋白含量分别升高了4.7倍和5.3倍(P<0.01)。LY294002和U0126处理对MDA-MB-453细胞突变型p53蛋白含量不产生影响。结论 乳腺癌细胞中HER2/neu基因的过表达能够通过激活P13K和Ras/Raf/MEK/ERK通路导致野生型p53蛋白含量减少,可能是HER2/neu过表达乳腺癌患者预后不良及对治疗产生抗性的分子机制。     

Herceptin联合9-顺式视黄酸对ErbB2阳性乳腺癌细胞的抑制作用及其相关分子机制的研究

目的 探讨Herceptin联合9-顺式视黄酸对ErbB2阳性乳腺癌细胞的协同增殖抑制效应及其分子机制.方法 利用MTT法检测经Herceptin、9-顺式视黄酸单独和联合作用后HER2/neu阳性的MDA-MB-453乳腺癌细胞的增殖活性的变化,在此基础上,利用免疫印记和半定量PCR法对HER2/neu、RXR以及COX-2的表达进行检测,同时利用ELISA法检测细胞培养上清内PGE-2的水平变化.结果 一定剂量的Herceptin和9-顺式视黄酸能够有效协同抑制MDA-MB-453细胞的增殖活性.经二者联合作用后,磷酸化、非磷酸化的ErbB2以及COX-2的表达较对照组均显著下降,而RXRα的表达则无明显变化.同时,二者联合作用还能有效降低细胞PGE-2的分泌水平.结论 Herceptin和9-顺式视黄酸可在体外分别通过抑制HER2/neu 和COX-2的表达和活性来达到协同抑制HER2/neu阳性乳腺癌的作用.     

下调晚期糖基化终末产物受体对乳腺癌细胞 增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响*

目的：研究下调晚期糖基化终末产物受体（RAGE）对乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响。 方法：培养乳腺癌BT474 细胞,分为对照组（ 不做任何处理的乳腺癌BT474 细胞）、上调组（ 乳腺癌BT474 细 胞+RAGE阴性对照）、下调组（ 乳腺癌BT474 细胞+RAGE siRNA）。用四甲基偶氮唑盐法检测乳腺癌细胞增 殖、凋亡水平;用Transwell 法检测乳腺癌细胞迁移、侵袭水平;用免疫印迹法检测细胞PI3K/Akt 信号通路蛋白 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、caspase 3、Bcl-2、Bax 表达量。结果：下调组细胞不同时间点增殖率均显著低于 上调组、对照组。下调组细胞不同时间点凋亡率均显著高于上调组、对照组。下调组细胞迁移、侵袭数均显著 低于上调组、对照组。下调组p-PI3K、PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2 蛋白表达量低于上调组、对照组,caspase 3、 Bax 蛋白表达量高于上调组、对照组。结论：经下调RAGE作用于PI3K/Akt 信号通路,其可抑制p-PI3K、PI3K、 Akt、p-Akt、Bcl-2 表达,促进caspase 3、Bax 表达,致乳腺癌细胞凋亡,抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移。     

癌基因DEK和转录因子AP-2α协同促进乳腺癌中HER2的高表达

目的探讨癌基因DEK与转录因子AP-2α在乳腺癌变中的相互作用及在HER2过量表达、乳腺癌变中的病理学意义。方法用Western blot检测组织中DEK、AP-2α和HER2蛋白水平之间的相关性;免疫共沉淀检测DEK和AP-2α在MDA-MB-453乳腺癌细胞中的相互作用;通过siRNA抑制MDA-MB-453细胞中DEK和AP-2α的表达,用半定量RT-PCR和Western blot检测HER2的表达。结果乳腺癌组织中DEK、AP-2α和HER2的蛋白水平之间显示一定的相关性,DEK和AP-2α在MDA-MB-453细胞内有相互作用,siRNA抑制DEK和AP-2α的表达可协同抑制MDA-MB-453细胞中HER2mRNA和蛋白的表达。结论癌基因DEK和转录因子AP-2α协同促进乳腺癌中HER2的高表达。     

P13K抑制剂对胶质瘤Akt2、p-Akt表达影响的研究

目的探讨P13K抑制剂LY294002对胶质瘤Akt2、p-Akt表达的影响。方法试验分组：取对数生长期的胶质瘤U251细胞,调整细胞浓度为1&#215;104个/ml,24 h后换液,LY294002组中DMEM高糖培养基含LY294002的浓度设四个梯度,其终浓度分别为5、10、20、40μmol/L 对照组为含等量含有机溶剂DMSO（浓度为0.4%）的DMEM高糖培养基。分别用免疫细胞化学法和Western blot法检测Akt2、p-Akt蛋白的表达。结果胶质瘤细胞株U251细胞中存在Akt2和p-Akt蛋白的高表达,应用P13K抑制剂LY294002可抑制该细胞株细胞中Akt2和p-Akt蛋白的表达,而且其表达呈浓度依赖型降低。结论LY294002可通过抑制P13K活性,抑制Akt的表达及活化,使Akt2和p-Akt蛋白的表达降低,提示抑制P13K/Akt途径可能是LY294002发挥抗肿瘤作用的重要机制,P13K/Akt可能成为胶质瘤治疗的靶点。     

靶向趋化因子受体CCR7的反义肽核酸对树突状细胞凋亡的影响

目的研究靶向趋化因子受体CCR7的反义肽核酸（PNA）对树突状细胞（DC）CCR7蛋白表达及凋亡的影响，并探讨其凋亡机制。方法体外培养大鼠骨髓来源的Dc，脂多糖（LPS）诱导成熟。设计靶向CCR7mRNA翻译起始区的反义PNA，以随机PNA和空白组为对照处理体外培养7d的未成熟Dc，脂多糖诱导48h后收集成熟Dc，免疫细胞化学染色法检测CCR7蛋白表达，流式细胞术检测细胞凋亡率，Westernblot检测磷酸化Akt和Akt蛋白表达。应用渥曼青霉素（wortmannin）抑制磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，P13K）／Akt信号通路进一步观察磷酸化Akt蛋白表达和细胞凋亡率的变化。结果反义PNA组DCCCR7蛋白表达明显低于随机PNA组和空白组，而细胞凋亡率却明显增高，差异有统计学意义（P〈0．05），Westernblot检测显示反义PNA组Akt蛋白磷酸化水平明显低于随机PNA组和空白组，差异有统计学意义（P〈0．05）。DC经P13K抑制剂预处理后，CCR7介导的Akt蛋白磷酸化及抗凋亡作用被阻断。结论CCR7反义PNA能够有效抑制体外培养的大鼠DC趋化因子受体CCR7的表达并导致其发生凋亡，其机制可能是阻断了CCR7介导P13K／Akt信号转导通路的活化。     

羽扇豆醇增强对沉默ST3GalⅢ基因的MDA-MB-231细胞侵袭转移的抑制作用

目的 探索羽扇豆醇（Lupeol）增强对沉默ST3GalⅢ基因的人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭转移的抑制作用。方法 体外培养沉默ST3GalⅢ基因的MDA-MB-231细胞。采用细胞黏附实验,Transwell侵袭实验,细胞划痕实验检测羽扇豆醇对ST3GalⅢ沉默的MDA-MB-231细胞侵袭转移能力的作用。Western blotting检测各组细胞转移相关基质金属蛋白酶（MMP）-2、9和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/核因子κB（PI3K/Akt/NF-κB）信号通路蛋白的表达情况。结果 ST3GalⅢ基因沉默及低浓度（5 μmol/L）羽扇豆醇对MDA-MB-231细胞的增殖及凋亡无明显影响。羽扇豆醇对ST3GalⅢ沉默的MDA-MB-231细胞黏附、迁移和侵袭有明显的抑制作用,且相关蛋白MMP-2、-9和PI3K/Akt/NF-κB信号通路蛋白表达均下调。结论 羽扇豆醇体外能增强对沉默ST3GalⅢ基因的人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭和转移的抑制作用,其机制可能与抑制MMP-2、-9的蛋白表达及影响了PI3K/Akt/NF-κB信号通路有关。     

syk基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞侵袭性抑制作用的体外研究

目的：构建非受体型蛋白酪氨酸激酶Syk的真核表达载体，转染人乳腺癌细胞，使其在乳腺癌细胞中稳定表达，为进一步探讨Syk抑制肿瘤细胞侵袭转移的具体机制奠定基础。方法：构建syk基因的真核表达载体pcDNA3．1D／V5．His-TOPO／syk，以脂质体介导法转染Syk表达缺失的MDA-MB-231细胞，经G418筛选，获得syk基因稳定表达的MDA-MB-231／syk细胞。通过流式细胞术和RT-PCR技术检测转染细胞MMP-9的表达变化，用体外迁移和侵袭力实验测定转染细胞的迁移和侵袭能力。结果：构建了syk基因的真核表达载体pcDNA3．1D／V5．His．TOPO／syk，并在MDA-MB-231细胞中获得稳定表达。与野生型MDA．MB-231细胞相比，MDA-MB-231／syk细胞表达MMP-9的水平明显降低（P〈0．01），并且该细胞的迁移和侵袭能力也明显降低（P〈0．01）。结论：候选抑癌基因syk通过脂质体可有效转染MDA-MB-231细胞，MDA-MB-231／syk细胞迁移和侵袭能力明显降低，这为进一步研究Syk在体内的抑瘤作用和乳腺癌基因治疗奠定了基础。     

miR-504靶向CHD1L抑制乳腺癌细胞侵袭的分子机制

目的探讨miR-504靶向染色质解旋酶DNA结合蛋白(chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein 1-like gene,CHD1L)抑制乳腺癌细胞侵袭的分子机制。方法 qRT-PCR检测人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)与乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MCF-7)中miR-504的表达量,同时检测miR-504在MDA-MB-231细胞中的转染效率;双荧光素酶实验检测miR-504与CHD1L是否存在结合靶点;qRT-PCR及Western blot法检测CHD1L mRNA和蛋白的表达水平;Transwell侵袭实验检测MDAMB-231细胞的侵袭能力;Western blot法检测p-Akt、MMP-2和MMP-9的表达情况。结果乳腺癌细胞中miR-504的表达量明显低于人正常乳腺上皮细胞(P 0. 05);miR-504在MDA-MB-231/miR-504组中的表达水平明显增高(P 0. 05);双荧光素酶实验检测显示miR-504能与CHD1L mRNA的3'-UTR结合;此外,过表达miR-504后CHD1L mRNA的表达水平无显著变化,但CHD1L蛋白表达水平显著降低(P 0. 05);与MDA-MB-231/NC组相比,MDA-MB-231/miR-504组侵袭能力明显降低,而MDA-MB-231/miR-504+CHD1L组侵袭能力比MDA-MB-231/miR-504+Con组明显增加;用表皮生长因子分别刺激转染不同质粒的MDA-MB-231细胞,与MDA-MB-231/NC组相比,MDA-MB-231/miR-504组中p-Akt、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显降低(P 0. 05),而MDA-MB-231/miR-504+CHD1L组中p-Akt、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平与MDA-MB-231/miR-504+Con组相比明显增加(P 0. 05)。结论 miR-504靶向CHD1L通过PI3K/Akt/MMP信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭。     

P13K/Akt信号通路在白蛋白诱导肾小管上皮细胞转化生长因子β1表达中的作用

目的 研究白蛋白对人肾小管上皮细胞(HK-2)分泌转化生长因子β1(TGF-β1)的影响,以及P13K/Akt信号通路在这一过程中的作用.方法 体外培养HK-2细胞,分为对照组、白蛋白(BSA)组和白蛋白加抑制剂(BSA+Ly294002)组.分别于培养12、24、48 h后,用MTT法检测HK-2细胞的增殖;RT-PCR检测HK-2细胞TGF-β1 mRNA的表达;Western印迹测定HK-2细胞TGF-β1和磷酸化的PI3K(p-PI3K)、Akt(p-Akt)蛋白分泌.结果 白蛋白可明显诱导HK-2细胞增殖(P<0.05),诱导后12 hBSA组与对照组比较,TGF-β1 mRNA表达明显上调(0.472±0.025比0.233±0.021,P<0.05);TGF-β1蛋白明显上调(296±20.1比100±13.2,P<0.05);p-PI3K、p-Akt蛋白表达显著增加(P<0.05).加Ly294002 12 h时HK-2增殖受抑制;48 h时TGF-β1 mRNA、蛋白和p-PI3K、P-Akt蛋白的表达也受到抑制(均为P<0.05).结论 白蛋白通过活化PI3-K/Akt信号转导通路诱导肾小管上皮细胞产生TGF-β1.     

S100A6通过PI3K/Akt信号通路促进人骨肉瘤细胞143B增殖和迁移

 目的：研究PI3K/Akt信号通路在S100A6介导的人骨肉瘤细胞143B的增殖和迁移中的作用。方法：首先制备重组的人S100A6蛋白（recombinant human S100A6, rhS100A6）;rhS100A6与PI3K抑制剂（LY294002和wortmannin）单独或同时处理143B细胞,其中rhS100A6的终浓度为30 mg/L,LY294002和wortmannin的终浓度分别为10 μmol/L和05 μmol/L;采用Western blotting分析143B细胞中PI3K/Akt信号通路相关分子总Akt（total Akt, t-Akt）及磷酸化Akt（phosphorylation of Akt, p-Akt）蛋白的表达变化,MTT检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移。 结果：（1）成功制备rhS100A6蛋白,rhS100A6显著增强143B细胞的增殖和迁移能力（P<005）;（2）rhS100A6上调143B细胞中Akt的磷酸化;（3）与rhS100A6组相比,rhS100A6与LY294002或wortmannin联合处理组143B细胞的p-Akt减少（P<005）,细胞的增殖和迁移能力降低,在不同时点细胞的增殖率下降103%～697%,细胞迁移率下降379%～416%,差异均有统计学意义（P<005）。 结论：S100A6促进人骨肉瘤细胞143B增殖和迁移的作用至少部分是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。     

Propofol pretreatment attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats by activating the phosphoinositide-3-kinase/Akt pathway

The aim of this study was to investigate the effect of propofol pretreatment on lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI) and the role of the phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) pathway in this procedure. Survival was determined 48 h after LPS injection. At 1 h after LPS challenge, the lung wet- to dry-weight ratio was examined, and concentrations of protein, tumor necrosis factor-α (TNF-α), and interleukin-6 (IL-6) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were determined using the bicinchoninic acid method or ELISA. Lung injury was assayed via lung histological examination. PI3K and p-Akt expression levels in the lung tissue were determined by Western blotting. Propofol pretreatment prolonged survival, decreased the concentrations of protein, TNF-α, and IL-6 in BALF, attenuated ALI, and increased PI3K and p-Akt expression in the lung tissue of LPS-challenged rats, whereas treatment with wortmannin, a PI3K/Akt pathway specific inhibitor, blunted this effect. Our study indicates that propofol pretreatment attenuated LPS-induced ALI, partly by activation of the PI3K/Akt pathway.     

Predicting tumour response to anti-HER1 therapy using medical imaging: a literature review and in vitro study of [18F]-FDG incorporation by breast cancer cells responding to cetuximab

Cetuximab, an anti-HER1 (EGFR) antibody, is currently under trial for the treatment of breast cancer. HER1 expression is not necessarily a predictor of response to cetuximab as mutant components of the pathways activated by HER1 which include PI3K/Akt can lead to resistance. Techniques that monitor events downstream of HER1 are more likely to provide an accurate measure of the efficacy of an anti-HER1 treatment. Glucose metabolism has been shown to be strongly influenced by the state of activation of PI3K/Akt. Here, the association between [18F]-FDG incorporation in breast cancer cells during response to cetuximab is investigated. The study also reviews the development of medical imaging probes that target HER1 The sensitivity to cetuximab of three breast tumour cell lines, SKBr3, MDA-MB-453 and MDA-MB-468, expressing HER1 at low and high levels, are determined using an MTT assay over a six-day period and a clonogenic assay carried out after seven- and 10-day exposures. Incorporation of FDG by cells treated with growth inhibitory doses of cetuximab were carried out after 4 hand two, four and six days of treatment. Glucose transport (rate of uptake of the non-metabolisable analogue [3H]o-methyl-D-glucose), hexokinase activity and lactate production were measured on cells treated with inhibitory doses of cetuximab for six days. The IC50, dose for MDA-MB-468 cells and the IC10 (maximum achievable inhibition) doses for MDA-MB-543 and SKBr3 treated with cetuximab for six days were 2.6, 5 and 148 microg/mL, respectively. Incorporation of FDG by SKBr3 and MDA-MB-453 cells was found to be decreased by MDA-MB468 cells using IC50, and IC20, doses of cetuximab for six days. Lactate production was found to be increased by MDA-MB-468 cells responding to cetuximab. Incorporation of FDG at the tumour cell level is modulated by treatment with growth inhibitory doses of cetuximab in cells sensitive to cetuximab due to modulation of HK activity.     

Knockdown of Aurora-B inhibits osteosarcoma cell invasion and migration via modulating PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway

Increasing evidences reveal that Aurora-B may be involved in metastasis of malignant tumor. In this study, we investigated the inhibitory effect of Aurora-B on invasion and migration of OS cells and the activity of PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway in vitro. The expression of Aurora-B and p-Akt (Ser473) proteins was detected by immunohistochemistry in OS tissues from 24 patients with pulmonary metastatic disease, and the relationship between Aurora-B and p-Akt was investigated. The results showed that there was a positive correlation between Aurora-B and p-Akt protein expression. Furthermore, we down-regulated the expression of Aurora-B through a recombinant lentivirus (Lv-shAURKB). Migration and invasion of cells were investigated by wound healing and transwell invasion assays. Results showed that silencing Aurora-B inhibited cell migratory and invasive ability of OS cells in vitro. Finally, knockdown of Aurora-B suppresses the activity of PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway in OS cells. Our results indicated that knockdown of Aurora-B suppresses OS cells migratory and invasive ability via modulating the “PI3K/Akt/NF-κB” signaling pathway in vitro. The Aurora-B blocker may be a new therapeutic strategy in OS management.