VP—16诱导前列腺癌细胞PC—3凋亡的研究

为研究ＶＰ－１６对雄激素非依赖性前列腺癌细胞ＰＣ－３凋亡的诱导作用,应用ＨＥ染色观察细胞的形态学改变,以ＤＮＡ凝胶电流和流式细胞术（ＦＣＭ）分析细胞凋亡和细胞周期分布,同时应用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法研究ＶＰ－１６对ＰＣ－３细胞ＤＮＡ合成的影响。结果表明,（１）凋亡的ＰＣ－３细胞呈明显的形态学改变;（２）ＤＮＡ断裂呈梯形变化;（３）ＰＣ－３细胞凋亡率随ＶＰ－１６作用浓度增加和时间延长逐渐增高;（４）Ｖ     

VP16诱导Raji肿瘤细胞凋亡的实验研究

目的 从细胞凋亡角度探讨ＶＰ１６抗肿瘤作用的机理。方法 用光学显微镜及电子显微镜观察了ＶＰ１６诱导Ｒａｊｉ细胞凋亡的形态学变化;用琼脂糖凝胶电泳观察了ＤＮＡ的梯形改变。结果 ＶＰ１６可明显诱导Ｒａｊｉ细胞调亡,５ｕｇ．ｍｌ＾－１ＶＰ１６作用４８ｈ时,凋亡指数为５８．３３％±３．０６％。与对照组相比有显性差异（Ｐ〈０．０１）。凋亡指数与药物浓度的对数呈正相关（ｒ＝０．９４０７,Ｐ〈０．０１）。结论 诱导凋亡是ＶＰ１６抗肿瘤作用的机理之一。     

VP—16诱导PC—3细胞凋亡和bcl—2及kc—myc基因表达的研究

目的 研究ＶＰ－１６诱导ＰＣ－３细胞凋亡和癌基因ｂｌｃ－２及Ｃ－ｍｙｃ表达的关系。方法 用末端标记法（ＴＵＮＥＬ）和流式细胞术（ＦＣＭ）研究ＰＣ－３细胞凋亡,以免疫组化方法研究ｂｃｌ－２及Ｃ－ｍｙｃ蛋白的表达。结果 ＴＵＮＥＬ和ＦＣＭ检测表明,ＰＣ－３细胞的凋亡率随ＶＰ－１６作用浓度增加和作用时间延长而升高;免疫组化结果显示：ｂｃｌ－２和ｃ－ｍｙｃ基因表达的阳性百分率随ＶＰ－１６作用浓度增加和作用     

VP—16诱导HL—60细胞凋亡的研究

探讨ｔｏｐｏⅡ抑制剂的抗瘤机制。方法：选择人急性早幼粒细胞白血病细胞株ＨＬ－６０为实验模型，以ＶＰ－１６为诱导剂，用形态学观察、ＤＮＡ电泳及流式细胞术（ＦＣＭ）等方法人凋亡情况进行了研究。结果：经ＶＰ－１７处理的ＨＬ－６０细胞呈典型凋亡形态学改变，出现梯状ＤＮＡ条带（ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ），ＦＣＭ ＤＮＡ直方图上Ｇ０／Ｇ１峰前是明显的亚二倍体凋亡峰。表明经ＶＰ－１６处理的ＨＬ－６０细胞的确发生了凋     

VP16对S-180和S-180-R细胞凋亡的作用

①目的探讨ＶＰ１６对细胞凋亡的作用。②方法用两种剂量（３．１２，６．２５μｍｏｌ）的ＶＰ１６处理腹腔接种Ｓ－１８０瘤细胞和抗阿霉素瘤细胞（Ｓ－１８０－Ｒ）的ＢＡＢＬ／Ｃ鼠。０，６，９ｈ分别取腹水，用流式细胞仪测定细胞相对ＤＮＡ含量。③结果ＶＰ１６在３．１２，６．２５μｍｏｌ剂量时，均可诱导Ｓ－１８０细胞凋亡，而剂量效应并不明显。在６．２５μｍｏｌ时，也可诱导Ｓ－１８０－Ｒ细胞凋亡，且ＶＰ１６诱导Ｓ－１８０和Ｓ－１８０－Ｒ两种细胞凋亡差别不明显。④结论ＶＰ１６是Ｓ－１８０和Ｓ－１８０－Ｒ细胞凋亡的诱导剂。ＶＰ１６诱导的凋亡与其抗药表型关系不大，但与免疫机制似乎有一定的关系。     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

足叶乙甙诱导HL－60急性早幼粒白血病细胞程序化死亡的实验研究

目的：用不同剂量的ＶＰ－１６诱导急性早幼粒白血病细胞程序化死亡（ＰＣＤ）。方法：通过细胞培养技术获取ＰＣＤ细胞，以ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳确定细胞ＰＣＤ的发生，苔盼蓝拒染法检测细胞活力。结果：不同浓度的ＶＰ－１６在试验条件下于４ｈ内均能诱导ＨＬ－６０细胞发生ＰＣＤ。结论：本实验建立的研究细胞ＰＣＤ的方法可靠，ＶＰ－１６具有良好的诱导细胞产生ＰＣＤ的作用     

5-氟尿嘧啶诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡及其机制研究

目的 研究５－氟尿嘧啶（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ,５－ＦＵ）体外诱导胃癌ＳＧＣ－７９０１细胞凋亡作用,及细胞凋亡与Ｋｉ－６７抗原、核增殖抗原（ＰＣＮＡ）、Ｐ５３蛋白、Ｂａｘ蛋白、死亡受体Ｆａｓ表达的关系。探讨５－ＦＵ诱导胃癌细胞凋亡作用的机制。方法 应用流式细胞仪和３’－ＯＨ末端标记法（ＴＵＮＥＬ）检测凋亡细胞,电镜观察凋亡细胞的形态改变,免疫组织化学法检测细胞Ｋｉ－６７、ＰＣＮＡ、Ｐ５３、Ｂ     

VP16对S—180和S—180—R细胞凋亡的作用

目的 探讨ＶＰ１６对细胞凋亡的作用。方法 用两种剂量的Ｖ这６处理腹腔接种Ｓ－１８０瘤细胞和抗阿霉素瘤细胞（Ｓ－１８０－Ｒ）的ＢＡＢＬ／Ｃ鼠。０，６，９ｈ分别取腹水，用流式细胞仪测定细胞相对ＤＮＡ含量。结果 ＶＰ１６在３．１２，６．２５μｍｏｌ剂量时，均可诱导Ｓ－１８０－Ｒ细胞凋亡，且Ｖ这６导Ｓ－１８和Ｓ１８０－Ｒ两种细胞凋亡差别不明显。结论ＶＰ１６是Ｓ－１８０－和Ｓ－１８０－Ｒ细胞亡的诱导剂。Ｖ这     

宫颈鳞状上皮癌蜡块中 HPV16 感染检测方法的比较研究

分别用原位杂交（ＩＳＨ）、多聚酶链反应（ＰＣＲ）和原位多聚酶链反应（ＩＳ－ＰＣＲ）方法，检测３９例宫颈鳞状上皮癌石蜡切片中ＨＰＶ的感染。ＩＳＨ的检出率为４６．２％（１７／３９），明显低于ＩＳ－ＰＣＲ的６６．７％（２６／３９，Ｐ＜０．０１）和ＰＣＲ的８４．６％（３３／３９，Ｐ＜０．０１）。用常规ＩＳＨ和地高辛标记探针能检出宫颈鳞状上皮癌ＨＰＶ１６感染的表皮细胞，而用ＩＳ－ＰＣＲ方法在同样标本中可显示出更多的ＨＰＶ１６阳性表皮细胞，并且着色更深。ＰＣＲ方法敏感性最高，但它不能用于组织细胞内的ＨＰＶ１６ＤＮＡ精确定位。     

c-myc反义核苷酸对淋巴瘤细胞系CA46凋亡的作用

目的 研究c—myc反义核苷酸对体外培养的淋巴瘤细胞系CA46基因表达及诱导凋亡的作用。方法 c—myc反义核苷酸(ASPO)为人工合成的针对c—myc基因的一段外源性基因片段，以无义的寡核苷酸作为对照，导入CA46细胞后观察其基因表达及诱导凋亡的作用。流式细胞仪检测c—myc基因产物表达，荧光染色观察CA46细胞的凋亡形态，流式细胞仪定量检测凋亡百分率，TUNEL检测加用VP16后的CA46原位凋亡。结果 c—myc反义核苷酸(ASPO)作用CA46细胞后，RT—PCR示c—myc mRNA表达降低。荧光染色ASPO组细胞胞体缩小，胞膜完整，核质浓缩，出现黄绿色不规则或局部致密荧光，凋亡细胞约占23．3％，而SPO组及空白组未见明显凋亡细胞，细胞呈均匀绿色荧光。流式细胞仪检测仅用VP16 10mg／L 3d，ASPO作用2d后加VP16 10mg／L 1d及ASPO作用3d均出现凋亡峰，凋亡率分别为16％，72％及52％，而SPO组及空白但均未见凋亡峰。流式细胞仪检测CA46细胞c—myc蛋白为95．3％，经ASPO作用后降为23．7％，同时SPO组c—myc表达率为90．6％，TUNEL检测ASPO组凋亡细胞为25．5％，加用VP16后的CA46凋亡率为36．7％。结论 体外实验中CA46特异地被c—myc反义核酸抑制生长，细胞出现凋亡表现，c—myc mRNA癌基因表达降低。     

Aβ25-35诱导PC12细胞周期变化与凋亡的关系

目的探讨β-淀粉样肽25-35(βamyloid peptide-25-35,Aβ25-35)诱导体外去血清培养的PC12细胞周期变化与凋亡的关系。方法用常规的去血清培养使细胞同步于G0期,采用终浓度为0~45μmol/L Aβ25-35处理PC12细胞24h,用MTT比色法分析细胞存活率;Hoechst33258荧光染色观察细胞核凋亡的形态学改变;DNA电泳观察细胞凋亡时特异性梯状条带(DNA-Ladder);流式细胞仪检测分析细胞周期的改变与凋亡的时间关系。结果随着Aβ25-35剂量的增加,PC12细胞存活率降低(P<0.01);用25μmol/L Aβ25-35处理PC12细胞12、24h,荧光染色结果显示24h出现典型的凋亡,表现为核固缩、核碎裂;DNA电泳结果显示凋亡特异性梯状条带;流式细胞仪分析表明去血清培养24h可使约90%PC12细胞停滞于G0/G1期,25μmol/L Aβ25-35诱导组8、16、24h与对照组比较,S期细胞比例增加(P<0.01),16h后细胞凋亡率增加(P<0.01),可见明显的亚二倍体峰(Ap峰)。结论Aβ25-35降低去血清培养的PC12细胞存活率,诱导同步化于G0/G1的PC12细胞重新进入细胞周期并随之出现凋亡,提示Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡可能与细胞周期紊乱有关。     

白藜芦醇抑制食管癌Eca109细胞增殖的初步研究

目的观察白藜芦醇对人食管癌Eca109细胞增殖影响及凋亡诱导作用。方法噻唑蓝法测定细胞生长抑制率,倒置显微镜、透射电镜和HE染色法观察细胞的形态变化,流式细胞术用于检测白藜芦醇培养Eca109细胞前后的细胞凋亡情况。结果白藜芦醇对Eca109细胞生长有抑制作用,抑制率达76.42%,并呈剂量、时间效应关系。倒置显微镜下可见细胞生长明显被抑制,胞浆内颗粒增多增粗,部分细胞变圆悬浮在培养基中;HE染色和透射电镜观察发现白藜芦醇能诱导Eca109细胞呈现典型的细胞凋亡特征,如细胞体积变小,染色质浓缩等。流式细胞术检测结果显示,40 mg/L白藜芦醇培养Eca109细胞72 h后细胞凋亡率达19.52%,在DNA直方图上有明显的亚二倍体凋亡峰。结论白藜芦醇能明显抑制Eca109细胞增殖,并进一步诱导食管癌细胞凋亡。     

VP-16诱导PC-3细胞凋亡和bcl-2及c-myc基因表达的研究

目的　研究 VP- 1 6诱导 PC- 3细胞凋亡和癌基因 bcl- 2及 C- myc表达的关系。方法　用末端标记法(TUNEL )和流式细胞术 (FCM)研究 PC- 3细胞凋亡 ,以免疫组化方法研究 bcl- 2及 C- myc蛋白的表达。结果　 TUNEL和FCM检测表明 ,PC- 3细胞的凋亡率随 VP- 1 6作用浓度增加和作用时间延长而升高 ;免疫组化结果显示 :bcl- 2和 c- myc基因表达的阳性百分率随 VP- 1 6作用浓度增加和作用时间延长而降低。结论　VP- 1 6能够诱导 PC- 3细胞凋亡和抑制其bcl- 2和 c- myc基因的表达 ,且具有作用浓度和作用时间依赖性。     

甲型流感病毒H3N2诱导狗肾传代细胞凋亡的研究

目的探讨甲型流感病毒对体外培养的狗肾传代细胞系(MDCK)的凋亡诱导作用.方法用不同血凝单位的甲型流感病毒感染MDCK细胞,经HE染色、琼脂糖凝胶电泳以及流式细胞术等方法检测凋亡情况.结果甲型流感病毒感染MDCK后,在细胞形态上呈现凋亡特有变化;电泳出现典型梯状条带;Annexin-V染色流式细胞仪检测出在一定范围内,细胞凋亡率与病毒的浓度呈正相关.结论甲型流感病毒能够诱导体外培养的MD-CK细胞凋亡,且在一定范围内,细胞凋亡率与病毒的浓度呈正相关.     

人质膜型唾液酸酶对丁酸钠诱导细胞凋亡的影响及其机制

目的：研究人质膜型唾液酸酶(hmSD)对丁酸钠(NaBT)诱导人雄激素非依赖型前列腺癌细胞(PC3细胞)凋亡的影响及其可能机制。方法：以前列腺癌细胞PC3和稳定转染hmSD的前列腺癌细胞(PC3-hmSD)为靶细胞,分别设对照组、NaBT 2.5 mmol•L^-1组、NaBT 5.0 mmol•L^-1组、NaBT 10.0 mmol•L^-1组,采用MTT法检测细胞存活率,吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色方法检测细胞凋亡情况,DCFH-DA激光共聚焦法检测细胞内ROS,Western blotting方法检测Bcl-XL、P65和Caspase 9蛋白表达。结果：① NaBT作用48和72 h时,PC3-hmSD细胞的生存率明显高于PC3细胞（P<0.05）;② NaBT 5.0 mmol•L^-1作用4 h,PC3-hmSD组细胞凋亡数明显少于PC3细胞（P<0.05）;③ NaBT诱导细胞内活性氧产生,PC3-hmSD细胞与PC3细胞比较差异无显著性;④ NaBT作用下,与PC3细胞比较,PC3-hmSD细胞Bcl-XL、P65蛋白表达水平增强,而 Caspase 9蛋白表达水平减低（P<0.05）。结论：① hmSD具有抵抗NaBT诱导细胞凋亡的作用;② hmSD对NaBT诱 导活性氧产生无抑制作用;③ hmSD抗凋亡作用可能与Bcl-XL和P65表达上调、Caspase 9表达下调有关。     

吡唑衍生物体外抗肿瘤活性研究

目的：研究吡唑衍生物对PC3、Bcap37、BGC8233种肿瘤细胞株生长的影响及其作用机制。方法：采用MTT比色法测定吡唑衍生物对3种肿瘤细胞生长的影响;AO／EB双染色,荧光显微镜观察细胞凋亡形态;利用Western Blot检测化合物对蛋白激酶磷酸化的影响。结果：吡唑衍生物对3种肿瘤细胞生长有一定的抑制作用,且具有浓度依赖性;吖啶橙／溴化乙锭（AO／EB）双染色可见吡唑衍生物F分别使PC3细胞变小、变圆,核染色质凝集,Bcap37细胞周围呈现亮绿色的荧光凋亡小体;Western Blot检测可知吡唑衍生物对EGF诱导的Erk1／2磷酸化没有抑制效果。结论：吡唑衍生物对3种肿瘤细胞生长有抑制作用,化合物F诱导PC3和Bcap37细胞凋亡,吡唑衍生物不能通过阻断Erk1／2磷酸化来抑制细胞增殖。     

蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导PC12细胞凋亡以及半胱氨酸蛋白水解酶3活化的实验研究

目的探讨蛋白酶体功能缺陷是否能诱导多巴胺能细胞发生凋亡及其可能的作用机理。方法应用高选择性的蛋白酶体抑制剂lactacystin(0、1μmol/L、5μmol/l或10μmol/L)处理大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞株24h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力的改变。10μmol/Llactacystin作用24h后,Hoechst荧光染色观察凋亡细胞的核形态学改变,流式细胞仪测定细胞凋亡百分率。用Western印迹法检测10μmol/Llactacystin作用0、24或48h时PC12细胞内半胱氨酸蛋白水解酶3活化片段的动态变化。结果5μmol/L或10μmol/Llactacystin作用24h后,PC12细胞的活力(87%±6%和26%±6%)显著低于对照组(P<0.05)。Hoechst荧光染色显示10μmol/Llactacystin作用24h后部分细胞呈现凋亡细胞核形态学改变;流式细胞仪证实31.4%±4.0%的PC12细胞发生了凋亡,与对照组(7.5%±0.8%)比较差异有统计学意义(P<0.01)。Western印迹法显示对照组细胞内仅有极少量的半胱氨酸蛋白水解酶3活化片段表达;10μmol/Llactacystin作用48h的PC12细胞内半胱氨酸蛋白水解酶3活化片段的表达明显较多。结论蛋白酶体抑制剂lactacystin能诱导多巴胺能细胞PC12发生凋亡,半胱氨酸蛋白水解酶3蛋白酶的激活可能参与lactacystin诱导的PC12细胞凋亡过程;蛋白酶体的功能缺陷在帕金森病发病机制中可能发挥重要作用。     

亚砷酸和STI571单用及联用对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的研究亚砷酸(As2O3)、STI571单用及联用对K562细胞增殖和凋亡的影响,为As2O3和STI571联合应用于临床提供理论依据.方法细胞增殖采用细胞生长及活力测定;细胞凋亡采用细胞形态、Annexin-V/PI双染实验、DNA的PI染色及DNA电泳等方法测定.结果在As2O3和(或)STI571作用下K562细胞生长受抑伴随活力下降,流式细胞仪检测出凋亡细胞百分率呈时间剂量依赖关系,基因组DNA电泳出现““梯““状条带.结论 As2O3和STI571均有抑制K562细胞增殖和诱导该细胞凋亡的作用,两药联用效果更佳.     

己烯雌酚诱导人T细胞肿瘤Jurkat细胞系凋亡中转录因子Oct-1的表达

建立丙型肝炎病毒包膜区基因的真核表达载体,并通过对其序列分析阐明其作为基因接种的可能性。方法：经常规 ＲＴ－ＰＣＲ法从 ＨＣＶ ＲＮＡ阳性病人的血清中扩增出 ＨＣＶ Ｅ１区的基因片段,经 ＥｃｏＲ Ⅰ和Ｘｂａ Ⅰ双酶切后将其克隆到真核表达载体 ＰｃＤＮＡ３中,阳性克隆经 Ｓｍａ Ⅰ和 Ｘｂａ Ⅰ双酶切鉴定;用双脱氧终止法测序,同时利用计算机软件对其推定的氨基酸序列进行分析。结果：ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物经酶切过夜后与经过同样双酶切的真核表达载体 ＰｃＤＮＡ３连接,阳性克隆经 Ｓｍａ Ⅰ和 Ｘｂａ Ⅰ酶切后产生了预期大小的 １４４ ｂｐ的片段。测序后其核苷酸序列与已经报道的ＨＣＶⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的同源性分别为７２．８％、９３．２５％、６１．９６％和５６．４４％;其推定的氨基酸序列的同源性分别为 ７７． ３％、９５． ７％、５４ ６％和 ５１． ３５％;与已经报道的中国株的同源性为 ９５． ０６％和９３． ２５％;属 ＨＣＶ Ⅱ型;经计算机辅助分析表明该片段内含有４个可能的糖基化位点, ｌ个跨膜区,其氨基端为信号肽序列,在跨膜区的两端分别含有２个和１个抗原决定簇,而每一个抗原决定簇内均含有１个糖基化位点,该片段内还含有 ２个 Ｔ细胞识别位点。 结论：