恒河猴骨髓基质干细胞与新型可吸收羟基磷灰石及β-磷酸三钙体外相容性的观察

目的观察恒河猴骨髓基质干细胞(rBMSC)与新型可吸收羟基磷灰石(HA)及AO人工骨β-磷酸三钙(β-TCP)的体外相容性．为在灵长类动物体内构建组织工程化骨作材料方面的准备，方法取第三代恒河猴骨髓基质细胞与材料复合培养。实验分3组：A组将rBMSC与HA复合培养；B组rBMSC与β-TCP复合培养：C组为对照，只有细胞不加材料。倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及增殖情况．MTT法半定量检测细胞增殖。结果倒置显微镜下见HA组细胞生长良好，与对照组无显著差异。β-TCP组有一些细小颗粒脱落散在分布于板底或细胞表面．有少量细胞脱落死亡。扫描电镜见HA组细胞贴附、增殖良好，β-TCP组细胞贴附率不高。MTT法显示HA组细胞增殖与对照组接近，而β-TCP组则显著低于对照组。结论新型HA与恒河猴BMSc生物相容性好，可用作恒河猴骨组织工程的支架材料．AO人工骨需要作性能上的改进。     

骨髓间充质干细胞的二维及三维培养实验研究

目的在二维、三维培养体系中探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)分裂、增殖的特性,为构建组织工程提供足够的种子细胞。方法密度梯度离心结合全骨髓贴壁法培养BMSCs,采用流式细胞仪检测细胞表面标志;将壳聚糖、β-甘油磷酸钠及羟乙基纤维素按比例混合制备三维支架。选取第3代骨髓间充质干细胞分别在传统二维培养体系以及在三维支架上接种培养2周。倒置相差显微镜下连续观察细胞形态变化的特征,收集细胞支架复合物行苏木精-伊红染色,并通过扫描电镜观察BMSCs的超微结构。结果传统二维条件下BMSCs培养2d,贴壁细胞开始展开,呈长梭形,3d后细胞以集落样方式分布,出现许多圆、亮的细胞,呈"放气球样"黏附于表面。在三维培养体系中,扫描电镜可观察BMSCs呈球形,细胞贴附于支架纤维上生长;HE染色可见大量圆形的细胞沿着支架纤维生长。结论在三维培养体系中,支架、胶冻状物质、BMSCs、相关的细胞因子共同构成三维培养体系的微环境,与BMSCs共培养具良好的组织相容性,BMSCs表现出活跃的增殖能力。     

恒河猴骨髓基质干细胞与新型可吸收羟基磷灰石及β-磷酸三钙体外相容性的观察

目的 观察恒河猴骨髓基质干细胞(rBMSC)与新型可吸收羟基磷灰石(HA)及AO人工骨茁-磷酸三钙(茁-TCP)的体外相容性。为在灵长类动物体内构建组织工程化骨作材料方面的准备。方法 取第三代恒河猴骨髓基质细胞与材料复合培养。实验分3组:A组将rBMSC与HA复合培养;B组rBMSC与茁-TCP复合培养;C组为对照,只有细胞不加材料。倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及增殖情况,MTT法半定量检测细胞增殖。结果 倒置显微镜下见HA组细胞生长良好,与对照组无显著差异。茁-TCP组有一些细小颗粒脱落散在分布于板底或细胞表面,有少量细胞脱落死亡。扫描电镜见HA组细胞贴附、增殖良好,茁-TCP组细胞贴附率不高。MTT法显示HA组细胞增殖与对照组接近,而茁-TCP组则显著低于对照组。结论 新型HA与恒河猴BMSc生物相容性好,可用作恒河猴骨组织工程的支架材料,AO人工骨需要作性能上的改进。     

新型骨组织工程支架材料β-TCP/CPPF/PLLA的性能观察

目的:研究新型骨组织工程支架材料β-TCP/CP-PF/PLLA的降解性能及生物相容性.方法:将试样真空干燥至恒重后放入盛有人工降解液的试管中,在37℃下密闭降解,用扫描电镜观察材料的微观结构.将骨髓基质细胞(BM-SCs)与材料复合构建人工骨,在体外培养3,7 d后,扫描电镜观察骨髓基质细胞在材料上的附着及生长情况.结果:降解后的材料仍然具有三维网状的立体结构,扫描电镜(SEM)见在材料表面及内部有大量细胞正常生长.结论:β-TCP/CP-PF/PLLA骨组织工程支架复合材料具有合理的微孔直径、较高的孔隙率,良好的降解性及生物相容性,基本满足骨组织工程的要求.     

脱细胞基质与颌下腺细胞体外复合培养的实验研究

目的:颌下腺细胞与脱细胞生物衍生支架材料复合培养,观察细胞在支架材料上的生长情况.方法:用传代培养第2代的颌下腺细胞与颌下腺脱细胞基质在体外复合培养,扫描电镜下观察不同时间细胞在支架材料上的生长情况.结果:颌下腺细胞多数附着在支架材料的孔隙内或其边缘,细胞大小不等、形态各异,部分细胞之间分泌基质相互连接,细胞表面凸凹不平、突起丰富、数目不等、长短不一,表面结构似"银耳"状.结论:颌下腺脱细胞基质支架材料具有良好的生物相容性,是一种较为理想的颌下腺组织工程用支架材料.     

多孔β-磷酸三钙/胶原支架与犬牙周膜细胞三维复合体的构建

目的:探索用多孔β-磷酸三钙/胶原(β-TCP/col)支架与犬牙周膜细胞(PDLCs)在体外构建三维复合体.方法:分离培养犬PDLCs,并对其来源进行鉴定;利用甲基噻唑基四唑法检测β-TCP/col浸提液对PDLCs增殖的影响;并将第3代PDLCs以2×10⁵/mL的浓度接种于β-TCP/col支架上进行三维复合体的体外构建,用扫描电镜观察.结果:β-TCP/col浸提液对犬PDLCs增殖无不良影响;PDLCs可在材料的三维结构上贴附生长,细胞充分伸展,且表面可见明显分泌物. 结论:多孔β-磷酸三钙/胶原支架与犬牙周膜细胞具有良好的生物相容性,二者可在体外构建成三维复合体,提示该材料具有成为牙周组织工程理想支架材料的潜力.     

应用骨髓干细胞和自制胶原-壳聚糖构建组织工程心瓣膜

目的探讨应用骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化的内皮细胞为种子细胞,以胶原-壳聚糖复合物为支架材料,运用组织工程学的原理和方法体外构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)的可行性。方法兔主动脉壁体外分离、培养、传代平滑肌细胞、成纤维细胞,将培养的成纤维细胞、平滑肌细胞与兔骨髓基质干细胞诱导分化的内皮细胞按顺序种植在预湿处理的胶原-壳聚糖复合支架上,通过组织学及倒置显微镜、扫描电镜观察内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞在支架上生长、增殖和基质分泌情况。结果 HE染色示内皮细胞能够在胶原-壳聚糖复合支架黏附、伸展、增殖,在TEHV表面长成连续的细胞层;扫描电子显微镜示TEHV表面光滑,细胞生长良好,细胞层完整,且瓣膜表面的内皮细胞具有合成和分泌前列环素(PGI2)的功能。结论以兔主动脉壁体外分离、培养、传代的平滑肌细胞、成纤维细胞和BMSCs诱导分化的内皮细胞为种子细胞,依次种植在胶原-壳聚糖复合支架上可以构建TEHV,且内皮细胞能够分泌PGI2。     

猕猴组织工程化周围神经的体外构建

目的:研究以猕猴骨髓基质干细胞作为种子细胞和以PLGA作为支架材料,体外构建猕猴组织工程化周围神经的方法.方法:采用密度梯度离心的方法分离培养猕猴骨髓基质干细胞,利用相差显微镜观察细胞生长情况,描绘其生长曲线;将4/0vicryl编织线在10倍手术显微镜下打散成PLGA细丝纤维,扫描电镜下观测其表面形态;将猕猴骨髓基质干细胞种植到经生物学修饰的PLGA纤维上共培养,倒置显微镜下观察细胞在支架材料上的生长情况.结果:采用密度梯度离心的方法可得到大量增殖能力强的猕猴骨髓基质干细胞;接种后的骨髓基质干细胞很快粘附于PLGA纤维上,生长、分裂、增殖良好,在PLGA纤维表面形成串珠样排列,部分细胞还形成连接在PLGA纤维间的链状或片状细胞桥.结论:猕猴骨髓基质干细胞与PLGA适合体外构建组织工程化周围神经.     

黄芪-壳聚糖/聚乳酸多孔支架对犬骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的:观察黄芪-壳聚糖/聚乳酸、壳聚糖/聚乳酸多孔支架复合材料对犬骨髓基质细胞(BMSCs)的黏附、生长及分化的影响,寻找较合适的牙周骨组织工程复合物支架材料。方法:将诱导分化的犬BMSCs分别与黄芪-壳聚糖/聚乳酸、壳聚糖/聚乳酸支架体外培养。第5天取材,测定2种材料的吸附率,用扫描电镜观察超微结构,以免疫组织化学检测I型胶原,放射免疫法检测骨钙素的分泌情况。结果:BMSCs与2组材料均能形成良好贴附,黄芪-壳聚糖/聚乳酸复合材料上贴附的细胞吸附率、Ⅰ型胶原及骨钙素的分泌量高于壳聚糖/聚乳酸组。结论:黄芪-壳聚糖/聚乳酸能促进BMSCs生长、分化及基质分泌,是一应用前景良好的组织工程骨构建复合材料。     

Bio-Oss胶原支架材料体外结构及细胞黏附生长观察

目的 观察兔骨髓间充质干细胞(BMSC)在Bio-Oss胶原材料上的生长情况和Bio-Oss胶原作为骨组织工程支架材料的优点.方法 扫描电镜观察Bio-Oss多孔矿化骨及Bio-Oss胶原结构,并与人体松质骨结构进行比较.扫描电镜观察体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSC)在Bio-Oss胶原表面生长、黏附、基质分泌情况.结果 Bio-Oss多孔矿化骨孔隙率为65%,孔径700μm,孔孔之间交通相连,形成网络立体空间结构.BMSCs Bio-Oss胶原复合物培养7d后断面可见BMSC充分伸展,似成纤维细胞形态黏附在Bio-Oss胶原表面,并有细胞重叠.一些细胞和细胞外基质充填于Bio-Oss胶原孔隙中.结论 Bio-Oss胶原骨与人体骨结构相似,是一种很有前途的骨组织工程的支架材料.     

兔骨髓基质细胞与自体牙骨质片的体外附着生长

目的:探索兔骨髓基质细胞与自体牙骨质片的体外附着生长规律. 方法:体外分离培养新西兰大白兔骨髓基质细胞,接种于牙片联合培养4 wk,通过倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞与材料附着情况. 结果:骨髓基质细胞附着牙骨质片生长良好,贴附紧密,并能形成新生的类牙骨质样矿化组织. 结论:骨髓基质细胞能在牙骨质片上附着生长并形成新生矿化组织,是理想的牙周组织工程种子细胞.     

经血源子宫内膜干细胞复合3D打印PLGA支架体外培养的相容性研究

[目的]通过经血源子宫内膜干细胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,Men SCs)与3D打印PLGA支架材料的复合培养,探讨构建组织工程化骨软骨的可行性。[方法]预处理3D打印PLGA支架,取第5代Men SCs,倒置显微镜下观察细胞生物学特性,按1.0×106/m L的密度接种到PLGA支架材料上复合培养,通过倒置显微镜、Mico-CT、扫描电镜和组织病理学进行观察,并借此判断Men SCs与3D打印PLGA支架材料复合体外培养的融合性。[结果]Men SCs生长良好,细胞平铺生长,呈梭形或纺锤形,胞质薄,核圆居中,具有成纤维细胞形态。细胞传至第5代,为长梭形细胞单层,呈漩涡状排列。PLGA支架的微观呈现相互连通的多孔结构,结构疏松,孔隙大且互相交通,孔壁较薄。Men SCs在PLGA支架材料上生长状态良好,细胞在支架表面和内部生长,支架孔径内有细胞基质样组织连接,表明Men SCs与3D打印PLGA支架材料复合体外培养的融合性良好。[结论]经血源Men SCs是骨组织工程适宜的种子细胞,与3D打印的PLGA支架材料复合可体外构建组织工程骨。     

骨膜成骨细胞与生物衍生骨材料联合培养的实验研究

目的探索山西省医用组织库生产的冻干人同种骨植入材料作为组织工程支架材料的可行性。方法取兔胫骨前骨膜的成骨细胞，传代培养后作为种子细胞与冻干人松质骨小粒在体外联合培养，通过倒置相差显微镜、光镜及扫描电镜观察，了解成骨细胞在人松质骨小粒支架材料中的生长情况。结果冻干人松质骨材料具有天然不规则网孔结构，体外复合培养3天，细胞贴敷伸展，个别部位有少量细胞增殖；培养1周，形成了由一层或几层细胞构成的细胞膜片，覆盖整个骨小梁网架表面；培养3周，所形成的细胞膜片已较厚，细胞表面有基质分泌。结论人同种骨为天然骨基质，具有良好的生物相容性及细胞吸附性，是细胞良好的载体材料，可作为骨组织工程中较好的支架材料。     

应用GFP标记技术示踪裸鼠体内组织工程化骨的形成

目的应用绿色荧光蛋白(GFP)标记技术,观察组织工程化骨体内形成过程中种子细胞的变化与转归.方法用GFP重组逆转录病毒载体(GFP-RV)转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs),将其接种于β-磷酸三钙(β-TCP),形成细胞-材料复合物,移植于裸鼠皮下.术后8周,HE染色观察组织结构,碱性磷酸酶(AKP)染色和骨钙素(OCN)免疫组化检测功能蛋白,激光共聚焦显微镜下对GFP进行示踪观察.结果 8周后,大体可见组织工程化新骨形成,组织学示新生骨小梁围绕材料孔隙生成,AKP染色和OCN免疫组化结果阳性,并可见新生组织内有呈绿色的GFP标记细胞,β-TCP部分降解.结论组织工程化骨组织学结构与松质骨小梁类似.新生组织表达GFP,证实组织工程化骨组织的形成来源于供体细胞.     

多孔聚醚砜平板膜培养肝细胞的初步研究

目的初步观察一种多孔聚醚砜平板膜上支持人肝细胞系L02细胞生长能力,探讨聚醚砜膜材料用于生物人工肝的可行性。方法将正常人肝细胞系L02细胞接种在多孔聚醚砜平板膜片上,用倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜以及扫描电镜观察L02细胞在此种平板膜上的贴壁和生长情况。结果倒置相差显微镜下可以观察到L02细胞能够在多孔聚醚砜平板膜较好生长,细胞培养到7 d时,细胞仍然保持良好生长增殖状态。激光共聚焦显微镜证实了该结果,且随着培养时间延长,细胞可呈多细胞聚集状态生长,保持活性。扫描电镜下膜表面微孔和微小孔结构得以观察,并能观察到部分细胞可以向微孔中延伸密集生长。结论多孔聚醚砜平板膜能够有效的支持L02细胞在其表面生长,有望成为生物人工肝支持系统理想的生物支架材料。     

组织工程骨表面微观形貌和生物矿化的实验研究

目的：用绿色荧光蛋白( GFP)标记结合扫描电镜和X射线能谱分析( SEM/EDS)技术对组织工程骨的表面微观形貌和生物矿化进行观测,以评价脱钙骨( DBM )支架体外构建组织工程骨的生物性能。方法用重组腺病毒介导GFP基因转染兔骨髓间充质干细胞( BMSCs)进行示踪标记,细胞与DBM复合经成骨诱导后,通过倒置荧光显微镜对细胞生长情况进行即时观察,结合SEM/EDS技术,观测组织工程骨的表面微观形貌和生物矿化。结果在倒置荧光显微镜下见细胞在DBM支架上能较好的黏附、重叠生长和增殖,体外培养至14 d 时,细胞内 GFP 有较高水平瞬时表达。SEM见DBM呈疏松多孔结构,孔隙直径为300~600μm,孔隙率达90%。 SEM下观察组织工程骨,见细胞在DBM网孔内表面贴壁生长,分泌基质旺盛,并可见粗糙的生物矿化物覆盖支架。 EDS显示其表面为钙、磷沉积物,其钙磷比( Ca/P)为1．46。结论 DBM体外构建组织工程骨有非常好的生物性能,GFP标记结合SEM/EDS技术可以作为DBM体外构建组织工程骨较好的评价手段。     

四种显微技术观测大鼠颌下腺细胞与丝素-壳聚糖体外共培养的形态学特点

目的 采用倒置显微镜、扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜(( laser scanning confocal microscopy,LSCM))技术对大鼠颌下腺细胞(rat submandibular gland cells,RSMGs)与丝素-壳聚糖( silk fibroin-chitosan,SFCs)的体外复合培养进行形态学观察.为观测、评估种子细胞在三维支架的内部生长情况提供技术支持.方法 取0～8d龄SD大鼠的颌下腺,对大鼠颌下腺细胞进行原代培养、分离纯化并传代;用抗细胞角蛋白单克隆抗体( CK8)及淀粉酶抗体的免疫细胞化学染色鉴定细胞来源.选取传至第二代的对数生长期的RSMGs作为种子细胞,选取SFCs共混膜(5×5×2)mm作为支架材料构建组织工程化涎腺样结构.将种子细胞与支架材料复合培养并分别于倒置显微镜、SEM、荧光显微镜和LSCM下观察二者复合生长情况.结果 倒置显微镜可以直接观察活细胞与支架复合生长情况,方法简单易行.SEM可以较精确的展示细胞支架复合生长的表面超微结构.经过荧光染料的着色,荧光显微镜和LSCM都可以观察到支架上锚定的种子细胞.荧光显微镜可见细胞核的荧光信号均匀的分布在支架孔隙内.LSCM通过层扫描及三维重建技术对较厚的标本获取图像;并可以通过旋转图像,从不同角度观察细胞支架复合物的三维剖面或整体结构,得到更为准确的定位信息.结论 四种显微技术均可应用于RSMGs与SFCs体外共培养的形态学观测.LSCM的三维重建技术结合荧光染料标记可以较好地获得RSMGs与SFCs复合生长的情况,有着较广泛的应用价值.     

Ⅰ型胶原支架材料与人脂肪干细胞体外生物相容性研究

目的 观察人脂肪干细胞与I型胶原支架材料的生物相容性,为脂肪组织工程选择适宜的种子细胞载体.方法 将人脂肪干细胞与Ⅰ型胶原支架体外培养复合,采用倒置相差显微镜和扫描电镜,观察细胞在支架上黏附、生长及增殖情况并计算细胞黏附率,XTT比色法检测细胞增殖率.结果 脂肪干细胞能良好的在支架上黏附、生长和增殖.结论 Ⅰ型胶原支架材料具有良好的细胞相容性,可作为脂肪组织工程的种子细胞载体.     

SD大鼠骨髓基质细胞与多孔羟基磷灰石陶瓷支架体外粘附的实验研究

目的研究诱导培养的SD大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在多孔羟基磷灰石陶瓷支架材料上的粘附和生长。方法SD大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)经矿化诱导培养、扩增后与多孔羟基磷灰石陶瓷支架体外复合培养,扫描电镜观察BMSCs在支架表面的贴附形态;同时以不同浓度细胞悬液接种多孔羟基磷灰石陶瓷支架材料,检测适宜的接种浓度及单位体积支架材料最多可粘附BMSCs数量。结果BMSCs在支架表面贴附良好,当接种浓度为2×106/ml时,单位体积的多孔羟基磷灰石陶瓷支架材料最多可粘附BMSCs数量为3.1×107cell/cm3。结论SD大鼠BMSCs在体外经矿化诱导培养可表达成骨细胞表型,诱导培养后的细胞与新型多孔羟基磷灰石陶瓷支架材料上具有良好的亲和能力。     

狗牙周膜细胞与壳聚糖-磷酸三钙三维培养的实验研究

目的：建立狗牙周膜细胞（PDLCs）体外三维立体培养模型,探讨以狗PDLCs为种子细胞,以壳聚糖-磷酸三钙复合体为支架材料应用于牙周组织工程的可行性。方法：冷冻干燥法制备壳聚糖-磷酸三钙多孔复合支架材料,组织块法培养狗牙周膜细胞,取第4代细胞传代扩增后接种到三维支架上,体外继续培养。免疫组化方法鉴定细胞起源;MTT法检测支架对狗PDLCs增殖的影响;取培养3、6?d的细胞-支架复合物的标本,用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞的形态及在支架上的粘附、生长情况。结果：免疫组化显示,狗PDLCs抗波形丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性,证实为中胚层来源。MTT法检测结果显示,支架材料对狗PDLCs的生长、增殖与空白对照组相比差异均无统计学意义(P＞0．05)。扫描电镜示壳聚糖-磷酸三钙复合体具有良好的多孔网状结构,狗PDLCs在支架上贴附牢固,伸展充分,增殖旺盛并分泌大量的细胞外基质。结论：壳聚糖-磷酸三钙具有良好的粘附性和细胞相容性,狗PDLCs与之复合培养生长良好,表明以自体PDLCs为种子细胞、以壳聚糖-磷酸三钙为支架材料进行的牙周组织工程是可行的。