抗人胱蛋白酶抑制剂C单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗人Cys-C单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法用基因工程表达的Cys-C抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗人Cys-C单克隆抗体,间接ELISA法检测单克隆抗体的效价、亲和力,鉴定单克隆抗体的亚类并检测抗原位点互补关系,SDS-PAGE鉴定抗体纯度,秋水仙素阻抑法鉴定染色体数目。结果筛选出2株能稳定分泌抗人Cys-C单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2H2、3C4,抗体Ig亚类均为IgG1,亲和常数分别为7.429×10-8、1.95×10-7,2株单克隆抗体抗原位点不重叠,染色体鉴定符合杂交瘤细胞的特性。结论成功制备了特异性的抗人Cys-C单克隆抗体,为Cys-C检测试剂盒的研究开发奠定了基础。     

2型猪链球菌溶血素多克隆和单克隆抗体制备及鉴定

目的制备并鉴定2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)四川分离菌株05ZYH33的溶血素(Suilysin,SLY)多克隆和单克隆抗体。方法利用重组SLY蛋白制备SLY兔多抗,优化间接ELISA体系检测多抗效价,Western blot分析SLY多抗特异性,检测SLY兔多抗对人外周血杀菌作用的影响。利用杂交瘤细胞融合技术制备SLY单抗,筛选杂交瘤细胞株并制备小鼠腹水,间接ELISA和Western blot鉴定SLY单抗的效价和特异性。结果间接ELISA显示SLY多抗效价高达1∶204 800,Western blot显示SLY多抗有较高的特异性和免疫反应性,人外周血杀菌试验显示,SLY多抗能加强人外周血对05ZYH33的杀伤作用。间接ELISA检测杂交瘤细胞2B6和5F7培养上清效价分别是1∶800和1∶3 200,单抗效价都为1∶204 800。间接ELISA和Western blot鉴定显示,单抗2B6和5F7具有很强的特异性和免疫反应性。结论成功制备了效价高、特异性强的S.suis 2 05ZYH33 SLY多克隆和单克隆抗体。     

甲基对硫磷单克隆抗体的研制及鉴定

目的研制甲基对硫磷(M1605)单克隆抗体(McAb).方法人工抗原M1605-TTH免疫BALB/C小鼠,用被免疫的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在融合剂PEG4000作用下融合.经过HAT培养液选择性培养、间接ELISA法筛选和有限稀释克隆后,鉴定该杂交瘤细胞株和McAb.结果获得2株稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株G12、H02,其培养液和腹水滴度为1103和1105.进一步研究G12发现,该杂交瘤细胞株的染色体数为99～108,其McAb分类为IgM,该McAb的亲和力常数为1.67×105L/mol,且具有较好的特异性.结论获得抗M1605的特异性McAb,为建立M1605简便、快速、特异的生物检测方法提供了必要条件.     

鳙鱼变应原小清蛋白单克隆抗体制备及鉴定

目的制备、纯化及鉴定抗鳙鱼小清蛋白单克隆抗体。方法以重组鱼主要过敏原小清蛋白(parvalbu-min)为抗原免疫BALB/c小鼠,融合免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1,半固体培养基法结合有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,采用蛋白A亲和层析法获得纯化抗体,间接ELISA方法和w estern blot鉴定抗体效价和特异性以及与其他过敏源的交叉反应性;采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型。结果共获得抗parvalbumin细胞株7株,1G1,1B5,1A5,2B9,1H4,1B7,1G3。1G1、1B7、1A5、1H4和1G3效价均高于1∶400 000,P/N>2.1;1B5效价高于1∶200 000,2B9效价较低;Western blot检测表明所有抗体均能识别parvalbumin;抗体亚类为IgG1型,1G1,1A5,2B9,1H4,1B7特异性结合parvalbumin,与其他种类过敏原无交叉反应,1G3和1B5与虾和大豆过敏原有交叉反应性,P/N>2.1。结论获得高效价抗体5株,发现parvalbumin与虾、大豆过敏原存在交叉反应性,为建立parvalbumin检测体系提供依据。     

用麻疹活疫苗制备抗麻疹病毒单克隆抗体及其应用

[目的]制备抗麻疹病毒(MV)的单克隆抗体(单抗,McAb),并用该单抗研制捕获法ELISA检测MV-IgM的诊断试剂盒。[方法]以MV减毒活疫苗免疫Balb/c小鼠,其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗MV的杂交瘤细胞株,以获得该单抗,并对用其研制的检测抗MV-IgM试剂盒进行考核。[结果]获得的杂交瘤细胞株中,B2能稳定分泌高滴度抗MV单抗。经考核,用该单抗酶结合物研制的检测抗麻疹-IgM试剂盒特异性和稳定性良好,与同类商品试剂盒比较,其检出麻疹病例血清抗MV-IgM的时间较早。[结论]应用麻疹减毒活疫苗成功地制备了小鼠杂交瘤细胞,其中B2株能稳定分泌高效的抗MV单抗,用于研制检测抗MV-IgM捕获法ELISA试剂盒,其敏感性、特异性和稳定性令人满意。     

Ⅰ型登革病毒prM抗体的制备及初步鉴定

目的以Ⅰ型登革病毒pr M蛋白为靶抗原,制备相应的多克隆和单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法 RTPCR扩增Ⅰ型登革病毒全长pr M基因,转入克隆载体和构建重组表达载体,以原核表达及纯化后的pr M蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,采集免疫兔血清,制备抗pr M蛋白多克隆抗体;取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经HAT选择培养、间接ELISA筛选阳性克隆,获得特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备抗pr M蛋白单克隆抗体,应用亲和层析法纯化抗体,Western-blot鉴定抗体特异性,间接ELISA检测抗体效价。结果获得全长pr M的多克隆抗体及1株能稳定分泌抗pr M蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗体的效价高,特异性好。结论制备了Ⅰ型登革病毒pr M多克隆抗体和1株单克隆抗体,为进一步探讨登革病毒pr M抗体依赖的感染增强作用奠定基础。     

结核分枝杆菌Rv3428c重组蛋白表达与纯化及其单克隆抗体的制备

目的 制备并鉴定Rv3428c的单克隆抗体，为结核分枝杆菌快速特异性抗原检测奠定基础。方法 同源重组得到pET28a-Rv3428c表达载体，转入E.coli BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达，用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。重组蛋白免疫小鼠后进行细胞融合，间接ELISA、Western Blot筛选阳性杂交瘤细胞系，以筛选获得的阳性杂交瘤细胞诱导小鼠产生腹水，蛋白A亲和层析法纯化抗体，BCA法测定浓度，ELISA和SDS-PAGE进行单克隆抗体的鉴定及亚型和效价的测定。结果 成功构建pET28a-Rv3428c表达载体、表达并纯化出目的蛋白。Rv3428c蛋白免疫小鼠使小鼠产生致敏B淋巴细胞，在聚乙二醇作用下，淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。筛选得到的阳性杂交瘤细胞株，通过体内诱生法制备获得Rv3428c单克隆抗体。该单抗属于IgG2a亚类，κ型轻链，效价约为1∶128 000,浓度为4 mg/ml。结论 本研究制备并纯化了Rv3428c重组蛋白，获得了抗Rv3428c单克隆抗体，为Rv3428c用于结核分枝杆菌快速特异性抗原检测奠定基础。     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定抗T-2毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株,以期为T-2毒素的快速检测提供有力的抗体工具。方法:采用琥珀酸酐法将T-2毒素活化为T-2HS,T-2HS在DCC与NHS作用下与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶联合成完全抗原。以T-2HS-BSA为抗原,免疫BALB/c小鼠,用ELISA筛选、建立分泌抗T-2毒素抗体的杂交瘤细胞株。测定单抗免疫球蛋白亚类及单抗效价,用间接竞争法检测单克隆抗体细胞株的特异性。结果:建立了1株稳定分泌抗T-2毒素抗体的杂交瘤细胞株T-1B3,该细胞株所分泌的单隆抗体Ig亚类为IgG1,ELISA检测结果表明抗T-2毒素抗体可以与T-2毒素发生特异性反应,工作浓度为1:6.5×104,IC50为3.6 ng/ml。该抗体与HT-2毒素的交叉反应为65.9%,与黄曲霉毒素无交叉。结论:制备出能分泌具有较高特异性和亲和力的抗T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。     

具备中和中东呼吸综合征冠状病毒活性的单克隆抗体的制备

目的制备并鉴定对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)具有中和活性的单克隆抗体,为进一步开展MERS-CoV感染与免疫保护机制研究,以及发展诊断与治疗手段奠定基础。方法 MERS-CoV S蛋白受体结合区与人IgG Fc片段融合表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过ELISA筛选出阳性克隆,随后通过多次亚克隆筛选出稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水并进行抗体效价测定及亚类鉴定;通过MERS-CoV假病毒及活病毒中和试验筛选出中和单抗。结果获得了10株能够稳定分泌抗原特异性单抗的杂交瘤细胞株。制备的腹水单抗亚类均为IgG1;其中7株单抗抗体ELISA效价达到10 000以上,并有1株单抗对MERS-CoV具有良好的中和活性。结论本研究获得了1株对MERSCoV具有良好中和活性的单克隆抗体。     

小肠结肠炎耶尔森菌O:9血清型特异性单克隆抗体筛选及其应用

目的利用杂交瘤技术筛选出能分泌小肠结肠炎耶尔森菌O：9血清型特异性单克隆抗体的细胞株,用于该型菌株的鉴定.方法采用ELISA方法筛选克隆株,并用玻片凝集法进行单克隆抗体的特异性鉴定.结果筛选到3株能分泌小肠结肠炎耶尔森菌O：9血清型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分泌的抗体与经鉴定的18株小肠结肠炎耶尔森菌O：9血清型菌株呈阳性反应,而与其他血清型小肠结肠炎耶尔森菌及常见肠道致病菌无交叉凝集反应;应用于小肠结肠炎耶尔森菌野生株分型鉴定时,能准确鉴定出其中的24株O：9血清型菌株,与用日本进口分型血清鉴定、PCR毒力基因检测结果相同.结论筛选获得的细胞株产生的单克隆抗体,用于小肠结肠炎耶尔森菌O：9血清型鉴定,具有很好的型特异性,避免了过去免疫血清制备中繁琐的抗原交叉吸收试验.     

腹泻性贝毒软海绵酸单克隆抗体的制备和酶联免疫检测方法的建立

采用细胞融合技术制备抗赤潮毒素腹泻性贝毒软海绵酸的单克隆抗体,应用此抗体发展建立了软海绵酸的间接竞争酶联免疫检测方法。采用碳二亚胺法,将半抗原与载体蛋白偶联,得到免疫抗原和包被抗原。免疫BALB/c小鼠,用免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,ELISA方法筛选阳性克隆,经多次克隆化,获得了4株能稳定分泌抗软海绵酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过小鼠体内诱生腹水方法获得单克隆抗体,建立分析检测软海绵酸的间接竞争酶联免疫方法。最低检出限为31.2ng/ml,批内平均变异系数8.1%,回收率为87%~112%。     

抗乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原McAb的特性分析与初步应用

目的：通过对抗乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原单克隆抗体的特性分析，研制检测乙型副伤寒沙门菌的ELISA法，对副伤寒传染病进行早期诊断。方法：用杂交瘤技术制备单克隆抗体，并进行鉴定，用双抗体夹心ELISA建立检测乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原ELISA方法，对临床标本进行检测。结果：7株抗乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原的单克隆抗体IgG15株、IgG2a1株、IgG2b1株，均不与相关沙门菌、肠道菌反应，用菌体免疫制备的MeAb 3B5、3G12、7H1、2B5，与乙型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原反应，而用纯化的鞭毛抗原免疫制备的单克隆抗体1F4、5D3、3H7，只与乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原，385与7H1识别同一抗原表位，3B5、7H1与3G12、2B5相互识别不同抗原表位，1F4、5D3、3H7相互识别不同抗原表位。3B5包被、过氧化物酶（HRP）标记3G12建立双抗体夹心ELISA，鞭毛抗原、菌体的最低检出量分别为5ng／ml、10^5个／ml。检测159份献血员血清及70份发热待查血清为阴性，1份发热待查血清、9份血培养阳性患者血清为阳性。结论：用纯化的鞭毛抗原免疫制备的单克隆抗体不适于检测乙型副伤寒沙门菌，菌体免疫制备的单克隆抗体特异性强，建立的双抗体夹心ELISA法，可对乙型副伤寒进行早期诊断。     

抗甲型流感病毒内部抗原单克隆抗体的稳定性观察

目的了解抗甲型流感病毒内部抗原单克隆抗体的稳定性。方法应用杂交瘤技术获得3株分泌抗甲型流感病毒内部抗原单克隆抗体细胞株1A9、1B1和1D4,通过ELISA与血凝抑制试验测定其单克隆抗体的稳定性与特异性。结果3株细胞连续传代9个月,能稳定地分泌单克隆抗体,经不同冻融时间观察其A值无明显改变并且与甲3,甲1型流感病毒呈阳性反应,与乙型流感病毒,腺病毒呈阴性反应。结论抗甲型流感病毒内部抗原单克隆抗体具有很好的稳定性与型特异性。在流感病毒的病原学诊断方面有实用价值。     

抗重组SARS病毒N蛋白单克隆抗体制备及性质初步研究

目的：制备抗重组SARS病毒N蛋白单克隆抗体。方法：重组SARS病毒N蛋白免疫BALB／c雌性小鼠获得免疫脾细胞，利用杂交瘤技术将免疫脾细胞同骨髓瘤Sp2／0细胞融合，间接ELISA方法筛选阳性克隆并扩增。结果：获得了能稳定分泌抗重组SARS病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株，经鉴定分泌的抗体IgG亚类为IgM。结论：制备了鼠源性单克隆抗体并初步研究了该抗体性质。     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与中和效应

用提取的Ａ型产气荚膜梭菌α毒素包涵体免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合和克隆化，经ＥＬＩＳＡ筛选，共获得７株稳定分泌单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株，分别命名为１Ａ８、１Ｃ３、１Ｄ５、１Ｄ８、１Ｆ１、１Ｈ１和２Ｅ３。经鉴定，７株ＭｃＡｂ的Ｉｇ亚类有ＩｇＧ１（１Ｄ８）、ＩｇＧ３（１Ａ８、１Ｃ３和２Ｅ３）和ＩｇＭ（１Ｄ５、１Ｆ１和１Ｈ１）。细胞培养上清和腹水抗体效价分别为：１∶５１２～１∶１０２４和１∶１０６～１∶１０８。尤为重要的是，２Ｅ３杂交瘤细胞株分泌的ＭｃＡｂ不仅能够中和α毒素的磷脂酶Ｃ活性和溶血活性，而且能够对致死性腹腔感染小鼠产生良好的被动保护作用     

抗软海绵酸单克隆抗体的制备

目的利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗软海绵酸(OA)的单克隆抗体(McAb).方法用碳化二亚胺法将半抗原OA与牛血清白蛋白(BSA)制备成完全抗原OA～BSA,用OA-BSA免疫BALB/c小鼠,使小鼠脾细胞产生抗OA的抗体.在聚乙二醇的作用下,使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合在一起,融合后的细胞用HAT选择培养,最后用ELISA法筛选出分泌抗OA McAb的杂交瘤细胞株.结果用碳化二亚胺法成功地将微量半抗原OA与BSA和卵清白蛋白(OVA)制成了完全抗原OA-BSA和OA-OVA.免疫小鼠血清中抗OA的抗体呈现阳性反应,表明小鼠脾细胞产生了抗OA的抗体.经3次抗体检测筛选出3株分泌抗OA MCAb的杂交瘤细胞株.结论抗OA McAb的成功制备为建立快速、经济的软海绵酸ELISA检测方法打下了坚实的物质基础,也为其它贝毒素检测方法的研究提供了可借鉴的经验.     

Opportunistic infections caused by Shewanella, new emergent bacteria

Shewanella putrefaciens and Shewanella algae are Gram negative, nonfermentative and oxidative bacilli whose the main phenotypic feature is the production of hydrogen sulfide gas. Widespread in the environment, both S. putrefaciens and S. algae species are rare human bacteria although they are reported with increasing frequency as a cause of opportunistic infection in humans, such as skin and soft tissue infections and bacteremia. Chronic infections of the lower limbs and liver disease have been identified as risk factors for bloodstream infection, with a faster course and a poorer prognosis in the last case. S. algae appears to be more virulent than S. putrefaciens. Most human S. putrefaciens strains are isolated from bacterial flora, which puts to question its clinical significance. Molecular biology must be used for an adequate identification because S. algae can easily be mistaken for S. putrefaciens with usual tests.     

双单抗夹心ELISA方法检测EPF活性

目的 建立双单抗夹心酶联免疫吸附试验法用于测定早孕因子(EPF)。方法筛选可稳定分泌抗EPF单克隆抗体的细胞株，制备腹水型单抗(McAb)并分离纯化，用改良碘化钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗，分析McAb的结合位点，通过抗体配对试验选择合适的捕获和检测McAb，建立双McAb-ELISA检测方法。结果筛选出二株稳定分泌抗EPF抗体的单克隆细胞株；两株单抗识别不同的抗原表位；双McAb夹心ELISA法测EPF活性灵敏度可达0．01udml，线性测定范围在0．01～10ug/ml，2份同批血清标本分别重复8次测定，平均批内变异系数为7．7％，2份不同批血清分别重复6次测定，平均批间变异系数为5．8％。建立的双McAb-ELISA法灵敏度90．2c％和特异度为92．8％。结论 建立的双McAb夹心ELISA法，有优异的灵敏度和特异度，稳定性强，而且简便、快速，适用于血清EPF检测，并有一定的临床应用前景。