不同价态砷对DNA和砷甲基转移酶的影响

目的观察不同价态、不同剂量砷染毒大鼠肝脏中DNA甲基转移酶和砷甲基转移酶mRNA的表达情况,寻找两者间的相关性及不同价态砷(iAs3+和iAs5+)体内甲基化间的差异。方法将35只健康清洁级Wistar雄性大鼠按体重随机分为7组,分别为正常对照(去离子水)组和低剂量(1/45 LD50,2.33 mg/kg)、中剂量(1/15 LD50,6.67 mg/kg)、高剂量(1/5LD50,20.00 mg/kg)砷酸氢钠(iAs5+)染毒组以及低剂量(2.33 mg/kg)、中剂量(6.67 mg/kg)、高剂量(20.00 mg/kg)亚砷酸钠(iAs3+)组,每组5只。采用自由饮水方式进行染毒,连续染毒90 d。采用实时荧光定量PCR法测定肝脏中DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)和砷甲基转移酶(As3MT)mRNA的表达情况。结果与对照组相比,各染毒组大鼠肝脏中As3MT mRNA的表达量较高,DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达量较低,高、低剂量亚砷酸钠染毒组和高剂量砷酸氢钠染毒组DNMT1 mRNA的表达量均较高,中剂量亚砷酸钠染毒组和低剂量砷酸氢钠染毒组DNMT1 mRNA的表达量均较低,差异有统计学意义(P<0.05)。随着亚砷酸钠染毒剂量的升高,大鼠肝脏中As3MT mRNA的表达量呈上升趋势,DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达量呈下降趋势;随着砷酸氢钠染毒剂量的升高,大鼠肝脏中As3MT mRNA的表达量呈下降趋势,DNMT3A、DNMT3B、DNMT1 mRNA的表达量呈上升趋势。As3MT的表达量与DNMT3A和DNMT3B表达量呈负相关(P<0.01);与DNMT1表达量无相关关系(P>0.01)。结论长期亚慢性暴露iAs3+和iAs5+均可促进As3MT的表达,抑制DNMT3A及DNMT3B的表达,但iAs3+和iAs5+间在剂量-效应关系上呈反向性;机体As3MT表达上调与DNMT3A和DNMT3B表达抑制间具有协同效应,并可导致基因低甲基化。     

急性砷暴露对C57BL/6J和129X1/SvJ小鼠肝脏全基因组DNA甲基化的影响

目的研究常用近交系品系C57BL/6J(B6)和129X1/SvJ(129)小鼠急性砷暴露后肝脏全基因组DNA甲基化的差异。方法将健康成年清洁级雄性野生型B6和129小鼠各18只按体重随机分别分为3组,分别为对照组(生理盐水,24 h),亚砷酸钠(5 mg/kg)染毒后6 h、24 h组,每组各6只。采用一次性灌胃方式进行染毒,采用ELISA法检测肝脏中全基因组DNA甲基化水平,采用Western blot法检测肝脏中DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b以及砷甲基化相关酶亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)、甲硫氨酸合成酶(methionine synthetase,MTR)、砷甲基转移酶(CYT19)蛋白的表达水平。结果与对照组相比,亚砷酸钠处理后6 h的129小鼠肝脏中全基因组DNA甲基化水平降低,亚砷酸钠处理后24 h的B6小鼠肝脏中全基因组DNA甲基化水平升高,差异均有统计学意义(P0.05)。在基础水平下,129小鼠肝脏中全基因组DNA甲基化水平高于B6小鼠,差异有统计学意义(P0.05);亚砷酸钠处理后24 h时,129小鼠肝脏中全基因组DNA甲基化水平低于B6小鼠,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,亚砷酸钠染毒后24 h的B6小鼠肝脏中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的蛋白表达水平均较高,而亚砷酸钠染毒后6 h的129小鼠肝脏中DNMT1、DNMT3a的蛋白表达水平均较低,差异有统计学意义(P0.05)。基础水平下的129小鼠肝脏中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的蛋白表达水平及亚砷酸钠染毒后24 h的129小鼠肝脏中DNMT3b的蛋白表达水平均高于B6小鼠,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,仅亚砷酸钠染毒后24 h的B6小鼠肝脏中MTHFR、MTR的蛋白表达水平均较高,差异有统计学意义(P0.05);而亚砷酸钠染毒129小鼠肝脏中MTHFR、MTR、CYT19的蛋白表达水平均无明显变化。基础水平下的129小鼠肝脏中MTHFR、MTR的蛋白表达水平及亚砷酸钠染毒后6 h的129小鼠肝脏中MTHFR的蛋白表达水平均高于B6小鼠,差异有统计学意义(P0.05)。结论急性亚砷酸钠染毒可升高B6小鼠肝脏中全基因组DNA甲基化水平以及DNA甲基转移酶和砷甲基化相关酶蛋白的表达,而降低129小鼠肝脏中全基因组DNA甲基化水平以及DNA甲基转移酶和砷甲基化相关酶蛋白的表达。     

双酚A对MCF-7细胞内DNA甲基化的影响

目的探讨双酚A对MCF-7细胞内整体DNA甲基化水平及甲基化转移酶的影响。方法分别将浓度为10-6mol/L、10-7mol/L的双酚A作用于MCF-7细胞72 h后,免疫荧光法测5-甲基胞嘧啶的含量,RT-PCR法测DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达。结果双酚A(10-6mol/L、10-7mol/L)作用72 h后,与溶剂对照组(0.1%DMSO)相比,5-甲基胞嘧啶的含量下降,差异有统计学意义(P0.05);RT-PCR结果表明浓度为10-6mol/L双酚A处理组的DNMT1的mRNA的表达下降,10-6mol/L、10-7mol/L双酚A组的DNMT3A和DNMT3B的mRNA的表达均增加,差异有统计学意义(P0.05)。结论双酚A能够引起MCF-7细胞整体DNA甲基化水平下调,其机制可能是通过改变甲基化转移酶的表达来实现。     

香烟烟雾对小鼠卵母细胞染色质构型、DNA甲基化及相关基因表达的影响

目的探讨香烟烟雾暴露对小鼠卵母细胞染色质构型、全基因组DNA甲基化及相关基因表达的影响。方法将清洁级健康ICR雌鼠分成3组(对照组和香烟烟雾低剂量组、高剂量组),分别置于点燃0、1、2支香烟的染毒柜(容积18 L)中,每天2次,每次1 h,共4周。利用Hoechst 33342对细胞核染色,观察卵母细胞质量及染色质构型;间接免疫荧光法分析卵母细胞全基因组DNA甲基化模式,实时荧光定量PCR测定卵母细胞DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMT)1、DNMT3a及DNMT3b基因的mRNA表达水平。结果随着烟雾浓度的升高,去透明带卵母细胞直径显著减小(P0.05),核仁未包围(non surrounded nucleolus,NSN)染色质构型比例明显升高(P0.05)。高剂量组卵母细胞DNA甲基化水平显著下降(P0.05)。随烟雾浓度升高DNMT1表达量降低,DNMT3b在高剂量组中表达水平显著降低(P0.05)。结论香烟烟雾暴露可能通过改变卵母细胞染色质构型,降低DNA甲基转移酶的表达,使DNA甲基化水平下降,从而降低卵母细胞质量。     

氢醌对DNA甲基转移酶表达的影响

目的探索氢醌(hydroquinone,HQ)致DNA整体低甲基化的分子机制。方法以磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组为对照组,分别以2.5、5.0、10.0和20.0μmo/lL HQ染毒TK6细胞为处理组。应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达水平。结果与对照组相比,DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的mRNA表达量在各HQ处理组细胞中均下降,其中以20.0μmo/lL组细胞的下降最为明显,分别下降46%(P0.05)、83%(P0.05)和48%(P0.05),且DNMT1和DNMT3a的表达量随着HQ剂量的增加而下降。结论 HQ致DNA整体低甲基化下调机制可能与DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表达异常有关。     

妊娠期至性成熟期饮水砷暴露对子代小鼠海马组织中DNA甲基转移酶mRNA表达的影响

目的研究妊娠期至性成熟期砷暴露致子代小鼠海马DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)水平的影响,探讨不同浓度砷暴露导致子代小鼠学习与记忆能力损伤的相关分子机制。方法将24只妊娠第1天的SPF级小鼠随机分为对照组、15、30和60 mg/L亚砷酸钠染毒组,仔鼠断乳之前经母鼠染砷,断乳至出生后(postnatal day,PND)40天以自行饮水方式进行砷暴露。对PND40子代小鼠进行水迷宫检测,PND10、PND20和PND40仔鼠取脑并分离海马,采用实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)法测定子代小鼠海马DNMT1、DNMT3a和DNMT3b mRNA水平。结果水迷宫结果显示,从训练第4天开始,不同浓度砷暴露组仔鼠寻找平台潜伏期均明显长于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);在撤平台后,30和60 mg/L亚砷酸钠染毒组与对照组相比,仔鼠在第Ⅱ象限停留时间明显缩短,差异具有统计学意义(P0.05);30和60 mg/L亚砷酸钠染毒组PND20仔鼠海马DNMT1 mRNA的表达水平明显高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);PND10和PND40各组仔鼠海马DNMT1 mRNA的表达水平均无统计学差异(P0.05)。不同发育阶段各组仔鼠海马DNMT3a和DNMT3b mRNA的表达水平均无统计学差异(P0.05)。结论砷暴露损伤仔鼠学习记忆能力可能与海马DNMT1 mRNA水平升高有关。     

DNA甲基转移酶在苯并[a]芘致小鼠空间学习记忆功能障碍中的改变

目的研究DNA甲基转移酶在苯并[a]芘(B[a]P)致小鼠学习记忆功能障碍中的改变,为B[a]P神经毒作用机制的研究提供科学依据。方法将48只成年雄性SPF级hauschka(ICR)小鼠按体重随机分为4组,每组12只,分别为溶剂(花生油)对照组,0.5 mg/kg(低剂量)、2.0 mg/kg(中剂量),和10.0 mg/kg(高剂量)B[a]P染毒组,隔天腹腔注射染毒1次,连续染毒30次。染毒结束后,用Morris水迷宫检测小鼠的空间学习记忆能力。并在染毒第10、20和30次后,用实时荧光定量-聚合酶链式反应(q PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠大脑皮质DNA甲基转移酶(DNMTs)的基因表达和蛋白活性的改变。结果水迷宫结果显示,随着染毒剂量的增加,小鼠到达平台的潜伏期逐渐延长,高剂量组潜伏期显著高于溶剂对照组,差异有统计学意义(P0.05);小鼠进入目标象限的总次数和在目标象限的游泳路程逐渐减少,高剂量组显著低于溶剂对照组,差异有统计学意义(P0.05);与溶剂对照组相比,各染毒组小鼠大脑皮质中DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的基因表达量和蛋白激酶的活性均逐渐增强,呈明显的剂量和时间依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。结论 B[a]P诱导大脑皮质DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因表达水平和蛋白激酶的活性增强,可能是B[a]P致小鼠空间学习记忆障碍的重要机制之一。     

三氯乙酸对L-02细胞DNA甲基化转移酶1蛋白及mRNA表达的影响

目的探讨三氯乙酸(TCA)染毒对L-02细胞DNA甲基化转移酶1(DNMT1)蛋白及mRNA表达的影响。方法取处于对数生长期的正常肝细胞(L-02细胞),分别加入含0(对照)、0.1、0.3、0.9 mmo/L TCA的培养液继续培养24、48、72 h,同时,设DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-aza-d C,5μmol/L)处理组,TCA-re组(0.9 mmol/L TCA处理后换正常培养基继续培养24 h)和人肝癌(HepG2)细胞组作为对照。检测细胞DNMT1蛋白和mRNA的表达水平。结果与对照组比较,各浓度TCA染毒组及5-aza-d C处理组、TCA-re组L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平均较低,而HepG2细胞组DNMT1 mRNA的表达水平较高,差异均有统计学意义(P0.05)。与相同剂量TCA染毒24 h比较,各浓度TCA染毒48、72 h后L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平均较低,除0.1、0.9 mmol/L TCA染毒48 h外,差异均有统计学意义(P0.05)。且随着TCA染毒浓度的升高和染毒时间的延长,L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平均呈下降趋势。与0.9 mmol/L TCA染毒组比较,TCA-re组L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平较高,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组比较,各浓度TCA染毒组及5-aza-d C处理组L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平均较低,除0.1 mmol/L TCA染毒24、48 h及0.3mmol/L TCA染毒24 h外,差异均有统计学意义(P0.05);而TCA-re组L-02细胞和HepG2细胞组DNMT1蛋白的表达水平均无明显变化。与相同剂量TCA染毒24 h比较,各浓度TCA染毒48、72 h后L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平均较低,差异均有统计学意义(P0.05)。除TCA染毒24 h时L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平随染毒浓度的升高而呈先升高后下降的趋势外,随着TCA染毒浓度的升高和染毒时间的延长,L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平均呈下降趋势。与0.9 mmol/L TCA染毒组比较,TCA-re组L-02细胞DNMT1蛋白表达水平较高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 TCA体外染毒可能通过抑制DNMT1的表达维持或者促进细胞的DNA低甲基化状态。     

DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因表达与小儿热性惊厥的相关性分析

目的探讨DNA甲基转移酶1 (DNMT1)、DNA甲基转移酶3A (DNMT3A)、DNA甲基转移酶3B (DNMT3B)基因表达与小儿热性惊厥的相关性。方法选取2016年4月-2018年5月收治的72例热性惊厥患儿为热性惊厥组,其中包括35例单纯型热性惊厥患儿与37例复杂型热性惊厥患儿,另收集同期进行体检的健康儿童45例为健康对照组。收集两组儿童的血液样本,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的基因表达水平,分析患儿DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因表达水平与热性惊厥的相关性。结果热性惊厥组患儿的DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因表达水平均高于健康对照组(P0. 05)。单纯型热性惊厥与复杂型热性惊厥患儿的DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因表达水平比较差异无统计学意义(P0. 05);对热性惊厥组、健康对照组进行Logistic回归分析,DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的最大似然估计值和OR值均0,且P0. 05。结论热性惊厥患儿血液中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B等基因呈高表达,在单纯型与复杂型热性惊厥患儿间无差异,且小儿热性惊厥与DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的基因表达水平呈正相关,说明表观遗传修饰在热性惊厥的进程中发挥重要作用。     

肥胖小鼠DNA甲基化改变以及n-3多不饱和脂肪酸的影响作用

【目的】 探讨肥胖状态下脂肪组织基因组DNA甲基化及甲基转移酶表达改变以及n-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFAs)的影响作用。 【方法】 使用30只3~4周龄C57BL/6J雄性小鼠,随机分为3组,每组10只。小鼠分别给予两种高脂饲料(脂肪含量为34.9%,供能比为60%)-n-6 PUFAs(脂肪来源于葵花籽油)饲料和n-3 PUFAs(脂肪来源于鱼油)饲料喂养14周;以正常脂饲料(脂肪含量为4.3%,供能比为10%)(脂肪来源于葵花籽油)为对照。喂养结束后对小鼠脂肪组织基因组DNA总甲基化以及甲基转移酶(DNMTs)进行测定。 【结果】 与正常脂饲料喂养小鼠相比,两组高脂饲料诱导肥胖小鼠的脂肪组织DNA总甲基化程度均明显升高,但n-3 PUFAs高脂饲料组升高的程度显著低于n-6 PUFAs组。n-6 PUFAs高脂饲料诱导肥胖小鼠的脂肪组织DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达均显著高于正常脂饲料组小鼠,而n-3 PUFAs高脂饲料喂养小鼠脂肪组织中这3种酶的表达无变化。 【结论】 肥胖状态下脂肪组织基因组DNA甲基化程度升高;鱼油n-3 PUFAs具有抑制DNA甲基化的作用。     

燃煤污染型砷中毒人群MGMT基因甲基化、转录及表达的研究

目的了解O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因(MGMT基因)启动子区甲基化、转录及表达以及DNA甲基转移酶1(DNMT1)的转录及表达与砷中毒的关系。方法采集68例燃煤污染型砷中毒(以下简称砷中毒)患者(轻度24例、中度28例、重度16例)及23例非病区居民外周血。用甲基化特异性PCR法(MSP)检测MGMT基因启动子区甲基化,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测MGMT及DNMT1 mRNA的水平。利用自愿手术治疗的砷中毒患者皮肤组织标本(61例,其中34例为一般病变,21例为癌前病变,6例为癌变)和对照皮肤组织标本(15例),以免疫组织化学(IHC)法检测砷中毒患者及对照皮肤组织中MGMT及DNMT1蛋白的表达。结果 MGMT基因启动子区甲基化阳性率与砷中毒程度有关(χ2=13.739,P0.01)。砷中毒组MGMT mRNA表达水平与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05);MGMT基因启动子区甲基化患者和非甲基化患者之间MGMT mRNA和DNMT1 mRNA表达差异无统计学意义(P0.05)。但轻、中度患者DNMT1 mRNA表达明显低于对照组(P0.01);癌前病变组和癌变组皮肤组织中MGMT蛋白表达明显低于对照组(P0.01),与皮肤损害程度有关(rs=-0.446,P0.01);MGMT基因启动子区甲基化患者MGMT蛋白表达明显低于非甲基化组(P0.05)。砷中毒组皮肤组织中DNMT1蛋白表达强于对照组(P0.01),并与皮肤损害程度有关(rs=0.740,P0.01);且MGMT基因启动子区甲基化患者组织中DNMT1蛋白表达明显高于非甲基化组(P0.05)。结论 MGMT基因启动子区高甲基化抑制了燃煤污染型砷中毒患者皮肤组织中MGMT蛋白的表达,且DNMT1蛋白的高表达参与了此抑制过程。     

短期暴露于纳米SiO_2对HaCaT细胞基因组DNA甲基化的影响

目的探讨纳米SiO2对体外培养细胞基因组总体DNA甲基化水平的影响。方法分别以2.5、5、10μg/ml纳米SiO2溶液和10μg/ml微米级SiO2处理人皮肤表皮细胞系(HaCaT)24h;以3μmol/L DNA甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(DAC)处理48 h的10μg/ml组为阳性对照,并设立溶剂对照组。应用高效毛细管电泳(HPCE)定量分析纳米SiO2处理细胞24h后,基因组DNA总体甲基化的变化,用Q-PCR和Western Blot方法检测甲基化相关蛋白mRNA和蛋白的表达变化,并用DNA甲基化转移酶活性试剂盒检测DNA甲基化转移酶的活性。结果 HPCE定量分析结果显示纳米SiO2可引起HaCaT细胞总体甲基化程度降低,呈剂量依赖性关系;与正常细胞相比,微米SiO2以及2.5、5和10μg/ml纳米SiO2组分别降低37.8%、43.9%、54.9%和52.8%,差异有显著性(P<0.05);对照组5-aza-dC处理后使HaCaT细胞甲基化程度减少27.3%。各组酶的蛋白表达与mRNA表达水平及DNMTs活性变化具有相同的变化趋势,经纳米SiO2处理的HaCaT细胞,DNMT1、DNMT3a及MBD2表达随着纳米SiO2剂量的上升而下降,DAC组表达水平最低。结论纳米SiO2能引起HaCaT细胞整体基因组DNA甲基化水平降低,可能与DNA甲基化转移酶的酶活性降低有关。     

孤独症谱系障碍患者基因组DNA甲基化水平的初步研究

目的检测孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)患者基因组DNA甲基化的水平,探讨其在ASD发病中的意义。方法采集2014年1月-2016年2月在儿童保健所门诊就诊及训练的30例ASD患者和正常对照组外周静脉血,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMCs),抽提DNA,采用Methyflash~(TM)总体DNA甲基化试剂盒检测外周血单个核细胞基因组DNA甲基化水平,实时荧光定量PCR技术检测DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)mRNA表达水平,分析两者之间的相关性及其与儿童孤独症行为量表(Autism Behavior Checklist,ABC)得分的相关性。结果与正常对照组相比,20例ASD患者外周血单个核细胞基因组总体DNA甲基化水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05);两组间DNMT1基因mRNA表达差异无统计学意义(P0.05)。ASD患者基因组DNA总体甲基化水平与DNMT1的mRNA表达水平无明显相关性(r=0.311,P=0.182);ASD患者基因组DNA总体甲基化水平与ABC量表得分呈负相关(r=-0.504,P=0.038)。ASD患者DNMT1的mRNA表达水平与ABC量表得分无显著相关性(r=-0.112,P=0.645)。结论 ASD患者基因组DNA甲基化水平降低。     

氢醌对骨髓间充质干细胞PARP-1和DNA甲基转移酶基因和蛋白表达的影响

目的探讨氢醌(HQ)诱导DNA甲基化改变的分子机制。方法用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组作为对照,采用实时荧光定量-聚合酶链反应和蛋白质免疫印记法检测2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L HQ染毒骨髓间充质干细胞(BMMSCs)聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1(PARP-1)和DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因和蛋白的表达。结果 PARP-1、DNMT1基因和蛋白表达水平均随HQ染毒剂量的增加而升高,呈剂量-效应关系,基因表达的回归方程分别为y=0.030 x+1.283,y=0.075 x+1.088,蛋白表达的回归方程分别为y=0.025 x+1.234,y=0.043 x+1.097,DNMT3a基因和蛋白表达水平随剂量增加而降低,呈剂量-效应关系,基因和蛋白表达的回归方程分别为y=-0.040 x+1.151;y=-0.012 x+1.021。结论 HQ暴露导致基因组DNA甲基化的改变可能与DNA甲基转移酶表达异常有关,且PARP-1可能参与了HQ暴露致DNA低甲基化的过程。     

n-3多不饱和脂肪酸对肥胖小鼠瘦素基因启动子区DNA甲基化的影响

目的 从基因启动子区DNA甲基化环节, 探讨n-3多不饱和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids, n-3 PUFAs)对肥胖状态下瘦素表达的表观遗传调控机制。方法 3~4周龄C57BL/6J雄性小鼠30只, 随机被分为3组(每组10只), 分别给予高脂饲料、鱼油n-3 PUFAs高脂饲料(脂肪含量均为34.9%, 供能比为40%)以及正常脂饲料(脂肪含量为4.3%, 供能比为10%)喂养4个月以诱导肥胖。喂养结束时取性腺周围脂肪组织, 应用RT-PCR检测脂肪组织瘦素mRNA水平;应用亚硫酸盐修饰直接测序(bisulfite sequencing-PCR, BSP)法检测瘦素基因启动子区CpG甲基化程度;应用染色质免疫共沉淀-荧光定量PCR(CHIP-RT-PCR)技术测定瘦素基因启动子区结合的DNA甲基化转移酶(DNMTs)、甲基化CpG结合蛋白2(MECP-2)以及RNA聚合酶2(Poly II)的变化。结果 与正常脂饲料组小鼠相比, 脂肪组织中瘦素mRNA 表达在高脂饲料诱导肥胖小鼠明显增加, 而在鱼油高脂饲料组肥胖小鼠无变化。基因启动子区甲基化结果显示, 高脂肥胖小鼠瘦素基因启动子区CpG位点甲基化程度、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和MECP-2含量均较正常饲料组显著升高, 并伴随Poly II含量减少;而鱼油高脂饲料组瘦素基因启动子区结合DNMT3a、DNMT3b and MeCP-2增加, 但启动子区MECP-2含量与高脂饲料组比缺有显著降低, DNMT1和Poly II以及CpG位点甲基化程度无改变。结论 肥胖状态下瘦素表达变化可能与基因启动子区DNA甲基化以及结合的相关调控蛋白、RNA聚合酶等有关;n-3 PUFAs对瘦素基因表达的调节也可能是通过对这些蛋白的影响而实现的。     

苯并[a]芘诱导的细胞恶性转化对DNA甲基化转移酶的影响

目的研究苯并[a]芘(B[a]P)诱导的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化过程对DNA甲基化转移酶(DNMTs)表达水平及活性的影响。方法以野生型小鼠胚胎成纤维细胞(polβ+/+)和BaP长期多次染毒构建的小鼠胚胎成纤维恶性转化细胞(polβ-T)为研究对象,采用RT-PCR和Western-blot分别检测两种细胞中dnmts(dnmt1、dnmt3a和dnmt3b)的mRNA及蛋白表达水平,同时用DNA甲基转移酶活性/抑制分析试剂盒检测DNMTs的酶活性。结果 polβ-T细胞dnmt1和dnmt3b的mRNA相对表达量分别为(0.940±0.033)和(0.905±0.062),均高于polβ+/+细胞[(0.560±0.031)和(0.666±0.041)],差异有统计学意义(P<0.05)。polβ-T细胞DNMT1和DNMT3b蛋白相对表达量分别为2.172±0.089和1.134±0.144,亦均高于polβ+/+细胞(1.311±0.050和0.820±0.106),差异具有统计学意义(P<0.05)。两种细胞DNMT3a蛋白和mRNA相对表达水平均无显著性差异。酶活性检测结果显示,与polβ+/+细胞[(329.48±52.11)OD·h-1·mg-1]相比,polβ-T细胞甲基化转移酶活性[253.70±20.56)OD·h-1·mg-1]降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 dnmt1和dnmt3b的异常表达以及DNMTs酶活性的改变可能参与苯并[a]芘诱导的细胞恶性转化过程。     

槲皮素及其甲基化产物对大鼠肝细胞DNMTs蛋白表达与活性影响的研究

目的观察槲皮素及其甲基化产物(异鼠李素和柽柳黄素)对DNA甲基转移酶(DNMTs)表达和活性的影响。方法体外培养BRL大鼠肝细胞,以MTT法测定槲皮素甲基化产物和DNMTs活性抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza)对BRL细胞活力的影响;采用HPLC法测定细胞内S-腺苷蛋氨酸(SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的含量;采用试剂盒法检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的蛋白表达水平,DNMTs活性及细胞总DNA甲基化水平。结果根据MTT的结果,确定异鼠李素和柽柳黄素的处理浓度为5μmol/L,5-Aza的浓度为20μmol/L,处理时间均为24h。与对照组相比,槲皮素组细胞内SAH含量显著降低(P0.05)。异鼠李素组细胞内SAM含量、SAM/SAH比值显著升高(P0.05),柽柳黄素组细胞内SAM含量显著增加。与对照组比较,槲皮素组DNMT1表达显著降低(P0.05);与槲皮素组和异鼠李素组比较,柽柳黄素组DNMT1则显著增加(P0.05);与异鼠李素组比较,柽柳黄素组DNMT3b表达显著增加(P0.05)。与对照组比较,5-Aza组、槲皮素及其甲基化产物组DNMTs活性均显著降低(P 0.05);与5-Aza组比较,槲皮素组、异鼠李素组DNMTs活性均显著降低(P0.05);与槲皮素组和异鼠李素组比较,柽柳黄素组DNMTs活性显著增加(P0.05)。与其余3组比较,异鼠李素和柽柳黄素组DNA甲基化水平显著增加(P 0.05)结论槲皮素显著抑制DNMTs活性,减少DNMT1的蛋白表达。柽柳黄素提高DNA甲基化水平。槲皮素、柽柳黄素与异鼠李素对DNMTs的作用存在差异。[营养学报,2020,42(3):275-280]     

氯乙烯致大鼠肝细胞DNA损伤与DNA修复基因表达

目的　研究氯乙烯 (VCM)对大鼠肝细胞DNA的损伤作用 ,及对DNA损伤修复酶 [O6 甲基鸟嘌呤 DNA甲基转移酶 (MGMT)、X线修复交叉互补基团 1(XRCC1)和X线修复交叉互补基团 3(XRCC3) ]表达的影响 ;探索VCM所致DNA损伤的修复机制。方法　采用腹腔注射VCM染毒 ,实验组按不同染毒剂量分为 3个剂量组 ,分别为低剂量 5mg kg、中剂量 10mg kg和高剂量 2 0mg kg ,染毒12周 ,以单细胞凝胶电泳 (彗星试验 )测DNA损伤 ,免疫组化法测DNA损伤修复酶的表达。结果　低、中和高剂量组大鼠肝细胞DNA损伤细胞百分率分别为 11.75 %、12 .38%和 17.6 3% ,均高于对照组(5 .6 7% ) ,且中、高剂量与对照组比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1)。MGMT和XRCC1表达随染毒剂量增加而减少 ,而XRCC3的表达随染毒剂量的增加而增加。VCM致DNA损伤与XRCC3表达有相关关系 (r=0 .4 38,P =0 .0 6 7)。结论　VCM可导致肝细胞DNA发生损伤 ,且存在剂量 -反应关系 ;DNA损伤修复酶参与修复VCM所致的DNA损伤。     

DNMT1与DNMT 3B在子宫内膜异位症患者血液与腹腔液中的表达水平及相关性研究

目的通过检测对比,检测DNA甲基转移酶DNMT 1及DNMT 3B在不同期别子宫内膜异位症(EMS)患者血液及腹腔液中的表达水平,探讨二者在EMS发病中的作用和影响。方法以84例行腹腔镜手术并证实为盆腔EMS的患者为研究对象。采用ELISA法检测84例EMS患者及38例对照者血清及腹腔液中DNMT 1、DNMT 3B的水平,分析二者的相关性。结果 EMS组血清中DNMT1、3B及腹腔液DNMT 3B水平显著高于非EMS组(P0.05)。血清DNMT1、3B的表达水平在EMSⅢ~Ⅳ期高于Ⅰ~Ⅱ期与非EMS组,Ⅰ~Ⅱ期DNMT 3B亦较非EMS组高(P0.05);腹腔液中DNMT 1、3B的表达水平在EMSⅠ~Ⅱ期高于Ⅲ~Ⅳ期与非EMS组,其中DNMT 3B在三组之间差异有统计学意义(P0.05),而DNMT 1的组间差异无统计学意义(P0.05)。增殖期腹腔液中DNMT 1水平高于分泌期(P0.05)。血清中DNMT1与DNMT 3B表达呈现正相关关系,腹腔液中的DNMT 1与DNMT 3B呈正相关;血清与腹腔液中DNMT 3B呈正相关,DNMT 1在两样本中无统计学相关性(P0.05)。结论甲基化改变是EMS发生发展的关键因素之一。DNMTs可以作为反映DNA甲基化状态的间接指标。