移植的骨髓间充质干细胞在兔腰椎间盘内分化的研究

目的观察移植的骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内分化的情况。方法从兔骨髓中分离和培养骨髓间充质干细胞,用核标记物BrdU标记后注入到兔的椎间盘中,8周后取材采用双染的方法检测移植骨髓间充质干细胞的细胞质中Ⅱ型胶原蛋白的表达情况。结果移植后的骨髓间充质干细胞部分双染呈阳性显色,即胞质内含有Ⅱ型胶原蛋白,向软骨细胞方向分化。结论在椎间盘环境的影响下骨髓间充质干细胞可以分化为软骨样细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外软骨向诱导的实验研究

目的:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞(MSCs),并定向诱导其向软骨细胞表型分化。方法:抽取兔股骨骨髓,经密度梯度离心与贴壁培养分离得到MSCs。用含有TGF-β、b-FGF、胰岛素、维生素C、转铁蛋白等的DMEM/Ham′s-F12培养基进行软骨向诱导。通过形态学观察,阿辛蓝-PAS特染及Ⅱ型胶原免疫组化染色,鉴定经过诱导后细胞的软骨细胞的表型。结果:兔MSCs原代细胞呈梭形,克隆样生长,经过诱导培养7d后,细胞形态由梭形、多角形变为椭圆形,胞浆丰富,细胞核和核仁清晰可见。阿辛蓝-PAS和Ⅱ型胶原染色阳性。结论:密度梯度离心与贴壁培养两种方法相结合可获得相对高纯度的MSCs,该细胞经诱导后可向软骨细胞分化。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化的影响因素

关节软骨在受到创伤后,难以自行修复。传统的治疗方法如软骨下骨钻孔术、软骨移植、骨膜或软骨膜移植、软骨细胞移植等因修复组织以纤维软骨为主,缺少正常透明软骨的力学性能及耐用性,故不能取得满意效果。而应用组织工程方法修复关节软骨缺损却展示了令人鼓舞的前景。种子细胞是组织工程化软骨形成的首要条件。骨髓间充质干细胞（MSCs）是来源于骨髓的一群非造血干细胞,在不同诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、神经细胞分化的潜能。MSCs因具有易于从骨髓中分离和体外大量扩增纯化、供区损伤小、便于白体移植、在适宜的体内或体外条件下可分化形成软骨组织等特点,故被认为是软骨组织工程最有希望的种子细胞来源之一。现就影响MSCs向软骨细胞表型分化的因素综述如下。     

骨髓间充质干细胞的分离培养及定向诱导软骨细胞的实验研究

目的　体外培养大鼠骨髓间充质干细胞并向软骨细胞表型分化 ,探讨其作为组织工程软骨种子细胞的可行性。方法　取成年大鼠股骨骨髓 ,体外培养、纯化。取第三代成年大鼠骨髓间充质干细胞 ,实验组用HG DMEM无血清培养液诱导 ;对照组用含 1 0 %胎牛血清的HG DMEM培养液自然分化。形态学观察 ,免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌。结果　大鼠骨髓间充质干细胞为均一的成纤维细胞样。实验组与对照组Ⅱ型胶原免疫组化阳性率有显著差异 (P <0 .0 1 )。结论　成年大鼠骨髓间充质干细胞在特定的培养基能向软骨细胞方向转化 ,作为软骨组织工程种子细胞具有可行性     

骨髓间充质干细胞复合壳聚糖凝胶体外构建可注射组织工程软骨

目的：探讨壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶用作骨髓间充质干细胞的载体体外构建可注射型组织工程软骨的有效性和可行性。方法：骨髓间充质干细胞与壳聚糖/β-甘油磷酸钠制成注射型细胞/凝胶复合物并行体外成软骨诱导培养,通过倒置显微镜、扫描电镜和组织学检查等观察细胞在凝胶内黏附、生长、增殖、向软骨细胞分化及形成软骨样组织等情况。结果：在体外成软骨培养条件下,壳聚糖凝胶支持骨髓间充质干细胞生长、增殖、向软骨细胞分化并形成软骨样组织。结论：骨髓间充质干细胞/壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶复合物,有望用作可注射型组织工程软骨修复软骨缺损。     

诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外诱导成软骨细胞的生物学特性，为骨组织工程提供实验依据。方法体外培养获取生长状态良好的兔骨髓间充质干细胞，进行成软骨诱导，观察并检测其生物学特性。结果BMSCs在转化生长因子-β1、维生素C的作用下，7d后可见细胞多变为圆形或椭圆形，并聚集形成软骨样结节，阿利辛蓝染色、蕃红花“O”-亮绿染色显示细胞内酸性粘多糖含量高，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性，PCR检测有Ⅱ型胶原的表达，表现出软骨细胞的分化特点。结论在特定诱导条件下，兔BMSCs体外可定向诱导分化为软骨细胞，为骨组织工程提供实验依据。     

骨髓间充质干细胞构建组织工程半月板软骨种子细胞

目的使用特定细胞因子刺激诱导分离扩增后的兔骨髓间充质干细胞（Mesenchynml stem cells,MSCs）,在体外试验中使其分化为软骨细胞,为后续构建工程化半月板研究提供种子细胞,探讨兔MSCs重建半月板组织的可行性和有效性。方法用碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）和转化生长因子β1（Transforming growth factor-βl,TGF-β1）协同刺激已分离并经体外传代培养扩增的兔MSCs,通过倒置细胞显微镜观察及免疫组化检测,证明其已经向软骨细胞系分化。结果用bFGF和TGF-β1协同刺激已分离并经体外扩增的兔MSCs后,细胞生长速度增快,免疫组织化学检测提示向软骨细胞系分化。结论兔MSCs可向软骨细胞分化;bFGF和TGF-β1能加快MSCs的体外增殖并促使其向软骨细胞系分化,可为构建工程化半月板提供理想的自体来源种子细胞。     

脂质体介导胰岛素样生长因子-1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的脂质体介导IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞（MSCS），并研究对MSCS成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法以密度梯度离心结合全骨髓培养法获得纯化骨髓间充质干细胞（MSCs），经流式细胞仪检测，细胞表面标志CD29和CD44表达阳性，但是CD14和CD45表达阴性。采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3．1-IGF-1转染MSCs，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原（ColⅡ）的表达行Western blot检测。结果获得纯度较高的兔骨髓间充质干细胞（MSCs）；脂质体为介导将全长兔IGF-1目的基因导入MSCs，Western blot鉴定转染成功，转染后的MSCs较未转染MSCs成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

胎儿骨髓间充质干细胞在体外无支架下向软骨组织分化的探讨

目的　探讨骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)无支架条件下在体外向软骨组织定向分化的条件。方法　取引产胎儿骨髓悬液 ,经Percoll密度梯度离心 ,获取单个核细胞 ,细胞贴壁、扩增后 ,再以高糖DMEM(TGF β15ng/ml)进行成软骨细胞预诱导 ,4～ 7d后获得成纤维样单层贴壁的MSCs。以此MSCs为种子细胞 ,2× 10 6个细胞离心成团 ,在TGF β1与IGF Ⅰ及其它辅助成分的协同作用下 ,体外培养 3wk后形成组织团块。经固定、包埋、切片后行甲苯氨蓝染色 ,免疫组化方法测定特异性Ⅱ型胶原。通过图象分析软件检测组织块蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达强度 ,并与胎儿正常软骨比较。结果　胎儿骨髓单个核细胞经过预诱导 ,细胞表达特异性Ⅱ型胶原 ,甲苯氨蓝染色蓝染明显增强 ;再经离心成团、体外诱导培养后形成有光泽软骨样组织块 ,其甲苯氨蓝染色呈蓝染 ,特异性Ⅱ型胶原为阳性表达 ,图象分析表明其蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达强度与胎儿正常软骨相似。结论　胎儿骨髓间充质干细胞经高糖DMEM预诱导后可向软骨细胞分化 ;离心成团后 ,在TGF β1与IGF Ⅰ及其它辅助成分的协同作用下具有形成类软骨组织的能力 ,本实验建立的定向诱导培养系统在无支架条件下可使MSCs向软骨样组织分化。     

诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)向软骨细胞诱导分化的能力。方法 选用不同代次的MSCs，使用条件培养基，观察细胞的形态变化，同时采用细胞化学和免疫组化的方法检测糖胺多糖的分泌和Ⅱ型胶原的表达。结果 MSCs在转化生长因子-β1、维生素C的作用下，7天后可见细胞多变为圆形或随圆形，糖胺多糖和Ⅱ型胶原染色阳性，表现出软骨细胞的分化特点。结论 在一定培养条件下成功诱导人MSCs向软骨细胞分化。MSCs作为骨组织工程学方面的种子细胞具有潜在的应用价值。     

MSCs定向诱导分化为软骨细胞实验研究

目的：体外诱导骨髓间充质干细胞（MSC）向软骨细胞定向分化,并对分化后的细胞进行鉴定方法：由健康兔子骨髓中分离出MSC,取第4代细胞进行实验。鉴定后,将细胞在地塞米松,bFGF,维生素C及TGF-B等诱导下分化后,通过RT-PCR检测Ⅱ型胶原（ColⅡ）的表达结果：诱导分化后的MSC可表ColⅡ的mRNA。结论：MSC在地塞米松,bFGF,维生素C及TGF-B等诱导后,可分化为软骨细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外诱导软骨形成

目的：体外分离培养兔骨髓间充质干细胞(MSCs),在诱导刺激物作用下,使其分化为软骨细胞。方法：在骨髓MSCs培养液内加入地塞米松10_-7 mol•L^-1,维生素C 50 mg•L^-1, 基因工程牛酸性成纤维细胞生长因子(bFGF)10 μg•L^-1,培养1周后将bFGF换为基因工程人转化生长因子-β₁(TGF-β₁)10 μg•L^-1,继续培养3周。 结果：细胞形态由纺锤形变为圆形或椭圆形,细胞分泌了大量的甲苯胺蓝异染的基质,形成了类软骨陷窝。碱性磷酸酶(ALP)的活性增高了近20倍。逆转录PCR证实转化前的细胞主要表达Ⅰ型胶原mRNA。转化后的细胞主要表达Ⅱ型胶原mRNA。 结论：在该种诱导环境下,部分骨髓MSCs可以转化为软骨细胞。     

体外非接触性共培养对MSC向软骨细胞诱导分化的实验观察

目的：探讨骨髓基质干细胞（MSCs）与软骨细胞体外非接触性共培养成软骨的可行性。方法：分离、培养、扩传兔MSCs及软骨细胞，MSCs以1×10^5个/ml接种于共培养板内孔，第1代软骨细胞以1×10^4个/ml接种于共培养板外空板。48h后将内孔插如外孔中，补充全培养基覆盖于MSC细胞层上。以相同密度MSC单独培养为空白对照，观察共培养7d和14d流式细胞仪观察MSC的Ⅱ型胶原蛋白变化情况。结果：实验空白组在7d和14d，Ⅱ型胶原蛋白均阴性表达，符合MSC特性。非接触共培养1周后，Ⅱ型胶原蛋白阳性表达，与空白对照比较，P〈0.01，具有统计学意义；非接触共培养2周后，Ⅱ型胶原蛋白也阳性表达，与空白对照比较，P〈0.01，同样具有统计学意义；实验14d组与实验7d组比较，P〈0.01，具有非常显著性差异。结论：软骨微环境在MSCs成软骨分化及体内软骨形成中具有重要作用，软骨细胞能有效地诱导MSCs向软骨细胞分化并促进MSCs体内软骨形成。     

定向诱导骨髓间充质干细胞-藻酸盐复合物构建软骨组织

目的研究骨髓间充质干细胞(M SC s)经向软骨细胞定向诱导后,与藻酸盐复合,构建组织工程软骨的可能性。方法取大鼠股骨骨髓,经梯度离心法和贴壁法分离M SC s,经鉴定后用含转化生长因子1β10 ng/m l、地塞米松1-0 7m o l/L、转铁蛋白3 m g/m l、胰岛素2 m g/m l的诱导因子培养基对M SC s进行诱导,14 d后免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌情况,将诱导后和未经诱导的M SC s以1×106/m l细胞密度与藻酸钙复合接种于裸鼠,分别于4周、8周后行组织学检测。结果经诱导的M SC sⅡ型胶原免疫组化阳性,与藻酸盐复合4周,HE染色可见软骨样细胞、软骨陷窝形成,阿辛蓝染色和M asson染色可见新生的软骨细胞和细胞外胶原,8周后软骨细胞明显增多,软骨细胞分泌胶原丰富,而未经诱导的M SC s无明显软骨细胞生成。结论M SC s经定向诱导后,可与藻酸钙复合在体内形成软骨样组织,可能发展为临床修补软骨缺损的一条有效途径。     

In Vitro Chondrogenic Phenotype Differentiation of Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells

In order to study the chondrogenic phenotype differentiation of adult sheep bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) in a defined medium as potential seed cells for cartilage tissue engineering, MSCs were isolated by density centrifugation with Percoll solution from bone marrow aspirated from sheep iliac crest. The third passage of MSCS were induced with H-DMEM containing TGF-β3 .IGF-I, Dexamethasone and VitC. The shape and ultrastructure of cells were observed, toluidine blue stain for GAG and immunohistochemistry for type II collagen were applied for chondrogenic phenotype identification. After 14 days of induction, MSCs changed from a spindlelike appearance to a polynal shape, a large amount of endoplasmic reticulum, Golgi complex and mitochondria were observed, and the differentiation of MSCs chondrogenic phenotype was verified by positive staining of toluidine blue and immunohistochemistry. MSCs derived from bone marrow can differentiate to chondrogenic phenotype when induced in vitro and can be used as optimal seed cells for cartilage tissue engineering.     

In vitro chondrogenesis of the goat bone marrow mesenchymal stem cells directed by chondrocytes in monolayer and 3-dimetional indirect co-culture system

Background  Cartilage injury has a very poor capacity for intrinsic regeneration. The cell-based treatment strategy for the cartilage repair using differentiated bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) is, however, a promising approach to the chondral repair. This study was aimed to explore the chondrogenic potential of the goat BMSCs in the Transwell co-culture system and the poly-laetide-co-glycolide (PLGA) scaffolds.

Methods  The BMSCs were isolated from the goat iliac crest while the chondrocytes were obtained from the goat’s last costal cartilage. In the Transwell co-culture system, the BMSCs co-cultured with chondrocytes were designed as group A, whereas the goat’s BMSCs induced with the chondrogenic medium were group B. Both groups A and B were the experimental groups, while group C that only contained BMSCs was the control group. In the PLGA scaffolds co-culture system, BMSCs were seeded into the PLGA scaffolds, which were suspended in the 24-well plate, and the control group was established by presence or absence of chondrocytes at the bottom of the 24-well plate. Toluidine blue staining, Alcian blue staining, collagen II immunofluoresence, collagen II immunochemical staining, collagen I, collagen II, COL2a Q-PCR and osteopontin Q-PCR were used to examine the chondrogenic conditions as well as the expressions of chondrogenic and osteogenic genes.

Results  Cells isolated from the aspirates of the goat bone marrow proliferated rapidly and gained characteristics of stem cells in Passage 4. However, the differentiations of chondrocytes were not apparent in Passage 3. The results from Toluidine blue staining, collagen II immunofluoresence and PCR showed the transformation of BMSCs to chondrocytes in the Transwell co-culture system and PLGA scaffolds. Although the cartilage gene expressions were upgraded in both chondrogenesis group and co-culture system, the osteopontin gene expression, which represents osteogenic level, was also up-regulated.

Conclusions  The Transwell co-culture system and the PLGA scaffolds co-culture system can promote the chondrogenic differentiation of the goat’s BMSCs, while up-regulated osteopontin gene expression in the Transwell co-culture system implies the osteogenic potential of BMSCs.

     

人骨髓间充质干细胞的分化与端粒酶活性

目的　研究人骨瞩间充质干细胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ）的分化特性及其端粒酶活性。方法　取人胚胎股　　　　骨骨瞩,分离、培养、扩增ＭＳＣｓ,原位杂交法检测ＭＳＣｓ的端粒酶活性。将ＭＳＣｓ种植于裸鼠皮下,４周后观察ＭＳＣｓ的　　　　分化情况。结果人　ＭＳＣｓ呈端粒酶反应阳性。植入裸鼠体内后可分化成骨、软骨、脂肪、骨骼肌、肌腱样组织和无髓神经　　　　纤维束样结构。结论人ＭＳＣｓ是一种具有多向分化能力的干细胞,具有较高的端粒酶活性。     

骨髓间充质干细胞修复兔皮肤缺损创面的实验研究

目的研究骨髓间充质干细胞(MSCs)参与皮肤缺损创面修复重建表皮的可能性,为组织工程化皮肤提供新的种子细胞来源。方法自体来源的骨髓MSCs应用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记后,以Ⅰ型胶原为载体植入兔背部左侧全层皮肤缺损创面(治疗组),右侧全层皮肤缺损创面仅植以Ⅰ型胶原作为对照组。于术后6、12天观察创面收缩率,记录愈合时间;术后4、5周切取创面中央再生皮肤组织,行常规病理和BrdU免疫组织化学染色检测,进行对比研究。结果创面收缩率,治疗组>对照组(P<0.05);愈合时间,治疗组<对照组(P<0.05)。常规病理检测治疗组再生皮肤表皮层明显增厚,细胞数目显著增多;免疫组化检测,在治疗组再生皮肤附件毛囊内层以及表皮基底层、棘层可见BrdU阳性标记细胞。结论骨髓间充质干细胞在全层皮肤缺损创面可能分化为表皮细胞参与表皮重建并具有促进创面愈合的作用。     

诱导的人骨髓间充质干细胞在裸鼠体内生成软骨的实验研究

目的探讨利用组织工程方法,将人骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外诱导、培养后,再造软骨组织的可能性。方法从胸外科手术所获得的肋骨骨髓腔中分离得到人MSCs,经无血清培养基诱导培养为软骨细胞,接种于支架材料上,埋植于裸鼠体内,6周后取材进行大体及组织学观察。结果大体观察见裸鼠皮下形成包块,触之有韧性;组织学观察可见有大量软骨细胞成堆形成,但尚有部分未降解的支架材料残留。结论人MSCs在体外经定向诱导后成为软骨细胞,与支架材料复合物可在裸鼠体内形成软骨组织;人MSCs可能成为组织工程软骨的“种子细胞”。