RCS大鼠病变发育过程中视网膜神经节细胞形态学变化的研究

目的研究皇家外科学院大鼠(royal college of surgeon rat,RCS)病变发育过程中视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)形态学变化.方法取RCS大鼠、RCS-rdy 大鼠3、5、7、9、11周龄视网膜,固定后行视网膜平铺片,甲酚紫染色,使用LEICA DM TRET显微镜及自带的LEICA Q WIN系统软件,观察视网膜神经节细胞层细胞数量总数及RGCs亚群数量上的变化.结果RCS大鼠病变发育过程中,其节细胞层中细胞横径≥12μm的细胞在数量上,7、9、11周龄段相较与3周龄段出现显著减少(P＜0.01).相同周龄段上的视网膜节细胞层中,RCS大鼠与RCS-rdy 大鼠在横径≥12μm的细胞数量上相互比较,可见RCS大鼠从5周龄段开始相较于RCS-rdy 大鼠出现显著减少(P＜0.05),7、9、11周龄段相较与RCS-rdy 大鼠减少更为显著(P＜0.01).但是节细胞层细胞总数及横径≥9 μm的细胞数量上,RCS大鼠自身发育前后对照以及与RCS-rdy 大鼠相比较没有显著差异.结论RCS大鼠视网膜色素变性过程中,随着光感受器细胞的变性和缺失,虽然视网膜节细胞层细胞在整体数量上没有明显变化,但是RCS大鼠视网膜病变发育早期,其节细胞层中胞体横径≥12μm的RGCs在数量上开始出现明显缺失.     

RCS大鼠视网膜色素变性过程中视网膜形态学研究

目的研究遗传性视网膜色素变性大鼠(Royal College of Surgeons rat,RCS rat)在视网膜变性发展过程中视网膜形态学变化.方法 RCS-p (视网膜含色素的变性大鼠)按出生后视网膜变性的发展状况分为变性早期(RCS15 d)、中期(RCS 30 d)、晚期(RCS90 d)3个时相点,分别采用相应时期的RCS-rdy p (视网膜含色素的正常大鼠)作为对照组(control groups,C 15 d,C 30 d,C 90 d),每组5眼,取各组大鼠眼球进行视网膜切片,行HE染色,采用MIAS-1000图像分析系统在400倍光镜下测视网膜外节(OS)、外核层(ONL)以及内核层(INL)厚度.结果①视网膜感光细胞随着病变的发展逐渐变性死亡,晚期视网膜色素上皮层和感光细胞层结构紊乱,但光镜下观察内核层、神经节细胞层仍保持较正常的形态.②与对照组比较,RCS大鼠视网膜色素变性过程中感光细胞外节膜盘堆积,外核层变薄,内核层在变性中期增厚,早期及晚期变薄.结论①RCS大鼠病变发展过程中视网膜各层神经元形态改变的不一致性.②变性中期视网膜内核层较对照组增厚,可能与该时期内核层神经元缺乏前级神经元的信号输入致细胞突起反应性增生,产生视网膜形态重构(remodeling)有关.     

枸杞子提取液对RCS大鼠遗传性视网膜变性的作用

目的 观察枸杞子提取液(LBA)对RCS大鼠遗传性视网膜变性的治疗作用.方法 出生后RCS大鼠24只,随机分为对照组和治疗组,每组12只.治疗组RCS大鼠出生后10 d开始喂食1 mg/kg的LBA, 对照组正常饲养.两组大鼠分别在出生后25、35、45 d取眼球,制备组织切片,应用苏木精-伊红(HE)染色和TUNEL染色观察视网膜感光细胞坏死和凋亡情况,并应用免疫组化方法检测Caspase-2的表达.结果 治疗组大鼠出生后25 d 和35 d时TUNEL染色阳性细胞与对照组相比明显减少(t=3.33～6.72,P<0.05);治疗组和对照组大鼠生后25～45 d时Caspase-2在节细胞层和内核层均有表达,但在25 d时治疗组与对照组相比明显减少(t=6.33,P<0.05).结论 在RCS大鼠遗传性视网膜变性的早期,LBA通过抑制细胞凋亡及Caspase-2表达对神经元起保护作用.     

大鼠发育过程中视网膜神经节细胞的膜学特性

目的 研究出生后不同发育阶段Wistar大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)的膜学特性，包括被动膜学特性和去极化脉冲诱发的动作电位(AIction potential，AP)，并分析其与年龄的关系。方法 应用视网膜切片膜片钳全细胞记录技术，获得7～30dWistar大鼠视网膜神经节细胞的膜片钳全细胞记录。结果 ①记录了112个视网膜神经节细胞；②随着发育，RGCs的膜学特性发生显著变化，兴奋性增加，睁眼前组与睁眼后组间有显著性差异；③去极化脉冲诱发其产生的动作电位有3种形式：单峰型、瞬变型、持续型。随着视觉发育，单峰型逐渐减少，持续型逐渐增加，细胞成熟时未见到单峰型，只见到瞬变型和持续型。随着发育，RGCs的电生理特性发生显著变化。结论 ①睁眼后形觉刺激促进RGCs膜学特性的成熟；②随着发育，RGCs的AP类型发生显著变化，单峰型是RGCs发育过程中的一种前期状态，最终分化为瞬变型和持续型RGCs。     

Long Evans大鼠视网膜神经节细胞培养与鉴定

目的建立Long Evans大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)体外培养的方法,为RGCs的体外实验研究奠定基础.方法出生后1～3 d的Long Evans大鼠视网膜神经上皮层,胰蛋白酶 透明质酸酶消化制成单细胞悬液,用DMEM培养液进行培养,观察细胞生长规律,图像分析系统分析有突起的RGCs数目、胞体面积和最长的突起长度,Thy1.1单克隆抗体和微管相差蛋白2多克隆抗体荧光双标法鉴定RGCs.结果 Long Evans大鼠RGCs体外培养存活4 d;荧光双标显示RGCs纯度为80%～90%.结论在普通培养基中Long Evans大鼠RGCs体外培养能获成功.胰蛋白酶 透明质酸酶联合消化较单独用胰蛋白酶消化效果好.     

视网膜神经节细胞与糖尿病视网膜病变

糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy, DR)是糖尿病最常见的并发症.多年来对其发病机理的研究主要集中在视网膜毛细血管微循环的改变上,对视网膜神经组织的研究较少.20世纪80年代中期已有学者提出DR的主要发病机理可能不仅是视网膜血管本身,而且与血管周围的神经元或神经胶质组织关系更为密切.视网膜的神经元和/或神经胶质可能对长期的高血糖影响特别敏感,微血管损害就成为其代谢紊乱的继发结果[1].近年大量临床电生理学研究表明,糖尿病患者在DR临床发病前,起源于神经网膜内层的振荡电位视网膜电图波振幅下降,潜伏期延长,其异常早于血-视网膜屏障通透性异常.应用持续固定聚焦视网膜电图研究发现,DR病变前期和/或早期,视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells ,RGCs)和双极细胞功能已发生异常.实验动物研究也显示,发生DR前,视网膜神经节细胞和苗勒氏(Müller)细胞已出现凋亡[2].有学者推测,糖尿病因耗尽了神经元所依赖的神经营养因子而导致DR的发生[3],神经网膜、神经细胞与DR的关系探讨成为目前DR发病机制的研究热点.本文就与DR神经网膜关系密切RGCs的研究现状作一综述.     

α晶体蛋白对视网膜神经节细胞作用的初步研究

目的 探讨α晶体蛋白对体外培养视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的作用.方法 原代培养RGCs,Thy1.1免疫荧光法鉴定RGCs并进行纯度检测,10-7、10-6、10-5、10-4 g/L α晶体蛋白加入后于1、3、12 h、1、2 d和3 d在相差倒置显微镜下观察RGCs形态学变化;计数突起数目和轴突长度;应用免疫荧光及激光共聚焦扫描技术观察实验组α晶体蛋白在体外培养RGCs上的定位并进行荧光强度半定量分析.结果 Thy1.1鉴定RGCs纯度为90%～95%,RGCs 10-4、10-5 g/L组突起数目及轴突长度显著大于对照组,以10-4 g/L组变化最显著.免疫荧光结果显示10-4 g/Lα晶体蛋白组RGCs与α晶体蛋白抗体呈阳性结合,并呈先升高后降低趋势.结论 α晶体蛋白能够促进RGCs生长,最佳浓度为10-4 g/L,细胞膜上抗体结合阳性,表明α晶体蛋白可与RGCs膜结合,这在α晶体蛋白促进RGCs存活和轴突再生的反应中可能起重要作用.     

视网膜神经节细胞体外培养研究进展

视网膜神经节细胞（RGC）是视网膜的第三级神经元，在视觉通路中起着重要的传导作用。许多眼科疾病（如视神经病、青光眼等）可导致RGC损伤、变性和凋亡，最终引起视功能丧失，因此保持或促进RGC存活及轴突生长对视功能的维持至关重要，目前国内外学者都在努力探寻体外培养RGC的最有效方法。笔者就RGC的培养、分离、鉴定、纯化等方法的研究进展作一综述。     

大鼠视网膜共培养诱导神经干细胞分化为视网膜神经节细胞

目的:研究新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养对干细胞分化的影响.方法:采用机械分离、无血清培养基选择培养的方法从孕14 d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并传代培养.使用组织-细胞共培养系统将出生4 d的乳鼠视网膜组织与上丘源神经干细胞共培养,观察干细胞分化过程,对分化细胞进行鉴定,并与干细胞的自然分化过程进行比较.结果:从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长,可以持续传代培养,具有多向分化能力,经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞.新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养促进干细胞的分化,并诱导分化出Thy1.1阳性细胞.结论:从胚胎大鼠上丘可以分离培养神经干细胞,与新生鼠视网膜组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化出视网膜神经节细胞.     

视神经损伤后视网膜神经节细胞继发变性的病理机制

外伤、肿瘤、高眼压、缺血和炎症均可引起视神经损伤,是神经外科和眼科的常见疾病。视神经损伤后视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）将发生继发变性,是不可逆视觉功能减退的主要原因。减缓或抑制视神经损伤后RGCs的继发变性是有效治疗视神经损伤和促进视觉功能恢复的基础。本文就视神经损伤后RGCs变性的原因、特点及分子机制方面的进展作一综述。     

荧光金逆行标记乳鼠视网膜神经节细胞的实验研究

目的建立荧光金逆行标记乳鼠视网膜神经节细胞的方法。方法选取出生1 d的SD大鼠乳鼠,腹腔注射水合氯醛麻醉后,剪开头部皮肤,向双侧上丘各注射4%荧光金注射液1μl,缝合皮肤,4 d后处死,提取视网膜,胰酶消化后培养,显微镜下观察被标记的视网膜神经节细胞。结果混合培养的视网膜细胞中,可见被荧光金标记的视网膜神经节细胞,大约占细胞总数的0.34%,视网膜神经节细胞可存活3周。结论荧光金逆行标记乳鼠视网膜神经节细胞是一种可行的方法,可用于视网膜神经节细胞的鉴定。     

猪视网膜神经节细胞的培养及超微结构

目的：建立视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs)的体外培养方法,并研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用,为RGCs的体外实验研究奠定基础。方法：进行猪视网膜细胞混合体外培养和神经节细胞的纯化培养,观察神经节细胞生长状态及轴突生长情况,研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用。结果：视网膜细胞混合培养时,神经节细胞生长良好,纯化后的神经节细胞间连接减弱,细胞存活时间缩短。结论：视网膜细胞混合培养有利于神经节细胞的贴壁和生长。     

孕酮对慢性高眼压模型大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的：建立大鼠慢性高眼压模型，检测孕酮对高眼压下大鼠视网膜神经节细胞的保护作用。方法：通过烧灼3条巩膜上静脉制作慢性高眼压动物模型，此模型按腹腔注射不同浓度的孕酮而分为高、中、低浓度孕酮注射组及空白对照组，左眼为模型眼，右眼为自身对照眼，3个月后处死动物，取眼球制石蜡切片，行HE染色、Thy-1.1免疫组化染色及TUNEL原位凋亡检测。结果：各组模型眼比较，高浓度孕酮注射组视网膜神经节细胞数多于低、中浓度孕酮注射组及空白对照组（P<0.05），且TUNEL阳性细胞数也少于低、中浓度孕酮注射组及空白组(P<0.05)。结论：孕酮对慢性高眼压模型大鼠的视网膜神经节细胞有保护作用，并且此保护作用与孕酮的浓度有关。     

Muller细胞诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化

目的研究Muller细胞在视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化中的作用。方法分离培养Muller细胞和不同时期的胚胎视网膜前体细胞,将其与Muller细胞共同培养,并进一步用Muller细胞条件培养液来诱导视网膜前体细胞的分化。倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况,Thy1.1标记视网膜神经节细胞并计数。结果视网膜前体细胞能分化为多种视网膜细胞类型,包括视网膜神经节细胞。不同时期、不同培养条件下的视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比不同。单独培养组、共同培养组和Muller细胞条件培养液组视网膜神经节细胞的百分比,E14分别为(16.91±4.05)%,(47.25±9.67)%和(42.36±10.52)%,E18则分别为(4.65±1.88)%,(9.90±3.19)%和(8.69±3.01)%。相同时期的视网膜前体细胞,共同培养组和Muller细胞条件培养液组视网膜神经节细胞的百分比较单独培养组高,差异有统计学意义。相同培养条件下,E14视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比较E18高,差异有统计学意义。结论Muller细胞能诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化,可能通过Muller细胞释放某些可溶性因子发挥作用。     

骨髓间充质干细胞向视网膜神经节样细胞分化过程中的电生理特性

目的：利用乳鼠视网膜细胞条件分化液将骨髓间充质干细胞( BMSCs)分化为视网膜神经节样细胞,比较BMSCs、诱导后的视网膜神经节样细胞以及原代培养的视网膜神经节细胞(RGCs)的电生理特性。方法：取传至第3代的大鼠BMSCs,利用乳鼠视网膜细胞条件分化液作为诱导剂,进行增殖培养、分化诱导;免疫组织化学法观察NF、MA...     

黄芪对高眼压大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的探讨黄芪对高眼压大鼠视网膜神经节细胞(RGC)的保护作用及眼压对其保护作用的影响。方法采用烙闭大鼠双眼上巩膜静法制备高眼压大鼠模型,将SD大鼠造模后随机分为假手术组、模型组、黄芪组、点药组、联合组。造模后4周开始干预,假手术组、模型组给予生理盐水灌胃,其他组分别给予黄芪(20 g/kg)灌服、降眼压药(贝美前列素)点眼及2种措施同时干预;干预4周后,采用激光共聚焦显微镜定量分析不同组大鼠的RGC数目及凋亡率的差异。结果假手术组RGC数目明显高于其他各组(P0.01),RGC凋亡率明显低于其他各组(P0.01);模型组恰好与假手术组相反;点药组较黄芪组RGC数目多而凋亡率低,但均无显著性差异(P0.05);联合组RGC数目明显高于点药组和黄芪组(P0.05)而凋亡率明显低于此2组(P0.05)。结论黄芪可通过抑制高眼压大鼠RGC凋亡发挥神经保护作用,与降眼压药物联合应用可提高其保护作用。     

急性高眼压条件下大鼠视网膜节细胞热休克蛋白70的表达

目的 :通过对急性高眼压条件下大鼠视网膜节细胞(RGCs)热休克蛋白 70 (HSP70 )表达变化的分析 ,初步探讨热休克蛋白在高眼压导致视网膜节细胞缺血时的保护作用 .方法 :Wistar大鼠 2 1只一侧眼球在维持 7.98kPa(1mmHg=0 .133kPa)前房压力持续灌注 2h后 ,然后降低眼内压恢复视网膜血液再灌注 ,根据再灌注时间随机分为 0 ,2 ,4 ,8,2 4和4 8h组 ,对照组行前房穿刺 .采用HE染色观察节细胞密度变化情况 ,采用免疫组化方法和图像分析研究视网膜节细胞热休克 70表达及其变化情况 .结果 :再灌注 4 8h组节细胞密度 (3.2 2± 1.6 4个 / 10 0 μm)较其他各组均低 (P <0 .0 5 ) ,对照组和再灌注不同时间后大鼠视网膜节细胞层HSP70表达灰度值之间差异有显著性 ,2 4h组灰度值 (14 8.35 8± 8.0 5 0 )较其他各组低 (P <0 .0 5 ) .结论 :HSP70的表达与缺血再灌注时间关系密切 ,HSP70在视网膜节细胞损伤与防护环节中可能起到重要作用     

Neuroprotective Effect of Melatonin on Retinal Ganglion Cells in Rats

Glaucoma , the fourth blindness-causing ill-ness in the world, is mainly manifested by twosymptoms : elevated intraocular pressure (IOP)and loss of visual field. Though the IOP of manypatients with glaucoma can be li mited to a properor low level ,it can' t prevent the i mpaired nervefrom deteriorating and therefore , with the condi-tionit is i mportant to protect optic nerve .In addi-tion, the progressive apoptosis of RGCs is thepathological basis for the glaucoma to i mpair thevisual func…     

Culture of rat retinal ganglion cells

This study aimed to modify the mixed and purified culture of rat retinal ganglion cells(RGCs) in vitro.The retinae of 1-3 day old Sprague-Dawley(SD) rats were separated bluntly into two layers:inner layer and outer layer,under a surgical microscope.Retinal cells isolated from different layers(inner layer,outer layer and whole retinal tissue) by using enzyme dissociation method were cultured in F12/DMEM medium containing 15% FBS.After 3-day culture,the RGCs in the retinal cells obtained from mixed culture of inner,outer,and whole retinal tissue were identified by immunocytochemical staining of Thy-1.1,and the rate of RGCs to retinal cells(RGCs%) was calculated.Two monoclonal antibodies,anti-macrophages/granulocytes(OX-41) against rat macrophage and antibody against rat Thy-1.1(OX-7),were used to purify RGCs by either a conventional or modified two-stepped immunopanning procedure(purification in situ).Purified RGCs were seeded at different cell density and cultured in F12/DMEM medium containing 15% FBS.Immunocytochemical staining for Thy-1.1,MTT,and PI-Hoechst33342 fluorescence imaging were used to identify the purity and the viability of RGCs in purified culture of RGCs.The results showed:(1) Immunocytochemistry of different retinal tissue layers culture revealed that the RGCs% was(19.9±1.2)%,(0.5±0.2)%,and(6.2±1.7)% respectively in the mixed culture of inner,outer,and whole retinal tissue,with differences being significant(P<0.05);(2) fluorescent double staining of Hoechst33342 and PI indicated that with the same RGCs%,RGCs obtained from purification in situ grew well with more neurite outgrowth than those by the conventional two-stepped immunopanning method;(3) the viability of purified RGCs seeded at high density was in-creased and the cells developed complex intercellular networks.The viability of RGCs was declined with the decreasing seeding density,and most cells presented round or oval in shape with thin neurites.It was concluded that:(1) RGCs% in the inner layer retina was higher than that in the outer layer retina;(2) RGCs obtained by in situ purification had more neurite outgrowth and lower mortality than those by conventional two-stepped immunopanning procedure;(3) the viability of purified RGCs could be increased by increasing cell seeding density to some extent.