绿脓假单胞菌主动外排表型及OprM基因检测

绿脓假单胞菌（PA）是医院内最常见的条件致病菌之一，对多种抗菌药物表现耐药。研究发现PA细胞膜上的主动外排泵是导致其多重耐药的主要原因之一，主动外排泵由菌体细胞膜的内膜蛋白与外膜蛋白组成，在六种外排泵中外膜蛋白OprM最为常见。本试验对临床分离的PA多重耐药菌主动外排表型及OprM基因进行筛选，探讨PA多重耐药和主动外排的分子机制。     

铜绿假单胞菌的基因芯片检测研究

目的用基因芯片对临床标本铜绿假单胞菌进行快速检测。方法结合临床检验经验,抽取98例临床标本,其中78例常规细菌培养鉴定疑似铜绿假单胞菌感染,20例非铜绿假单胞菌感染,铜绿假单胞菌质控菌株(ATCC27853),大肠埃希菌(ATCC25922),用研究制备出铜绿假单胞菌筛查的基因芯片进行测定,同时进行比对分析。结果铜绿假单胞菌检出符合率为100%,基因芯片检测的标本需要量少,检验时间短,敏感性、特异性、准确性高。结论针对细菌培养的临床标本特点,采用高效的基因芯片检测方法,具有现实的临床意义。     

铜绿假单胞菌主动外排系统与多重耐药性

铜绿假单胞菌(PA)是假单胞菌中常见的院内感染条件致病菌,其对多种不同性质的抗生素高度耐药。复杂的主动排出系统在铜绿假单胞菌多重耐药性中起着极其重要的作用。通过检测已发现铜绿假单胞菌中的7种主动外排系统,包括MeXAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM、MexJK-OprM、MexGHI-OpmD和MexVW-OprM。不同类型的外排系统在作用底物和调控机制等方面有着各自的特点。     

铜绿假单胞菌多药主动外排系统研究进展

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA），是一种重要的医院感染病原菌，主要感染医院内免疫力低下患者。PA对多种临床常用抗生素呈现明显的固有与获得性多重耐药（multidrug resistance，MDR），一旦感染，临床治疗十分困难。自Geroge等提出主动外排是细菌耐药的一个基本机制后，外排机制得到了广泛而深入的研究，新的药物外排系统不断发现，而且随着分子生物学技术的应用，该领域的研究更加深入；随着主动外排在临床主要病原菌耐药中的重要作用不断被揭示和认同，主动外排系统越来越引起人们重视，也是目前细菌耐药机制研究中的新热点。本文将对近年PA中各类外排泵的研究情况和进展做一综述。     

铜绿假单胞菌药物外排泵研究进展

感染性疾病目前仍然是威胁全球人类健康的第二大杀手，发达国家的第三大杀手。欧美和中国的多项病原菌流行病学监测资料中，铜绿假单胞菌（P—seudomonas aeruginosa，PA）均高居榜首，尤其是获得性免疫缺陷综合征（AIDS）等严重免疫缺陷性患者，一旦感染PA往往是致命性的。此外，PA也是囊性纤维化患者最重要的死亡原因。资料表明，PA的耐药状况十分严重，美国1998～2002年间多重耐药PA增加了32％。铜绿假单胞菌常对多种常用抗生素耐药，所涉及耐药机制复杂，包括：外膜低渗透、抗生素修饰酶的生成（如β-内酰胺酶）、外膜孔蛋白缺失、生物膜形成、青霉素结合蛋白改变和主动外排泵系统。对PA耐药机制的研究有助于抗生素的合理应用。近年来多药外排泵被认为是导致PA多重耐药的重要原因。     

铜绿假单胞菌耐药基因的检测与分析

目的研究铜绿假单胞菌连续分离株的多种耐药基因的分布状况和耐药机制。方法采用PCR方法检测1株铜绿假单胞菌β-内酰胺酶编码基因、菌膜蛋白oprD2基因、Tn21／Tn501型转座子编码基因merA、Ⅰ类整合子编码基因qacE△1-SU11、16SRNA甲基化酶及氨基糖苷类修饰酶基因、氯霉素耐药相关基因catB、cm1A。四环素耐药相关基因tetA、tetB以及小多药外排泵基因star-2。采用PCR直接全自动荧光法进行阳性基因测序。结果该株铜绿假单胞菌未检出TEM基因和OXA-10基因,检出OXA-2基因,且伴有OprD2缺失;转座子遗传标记MerA阳性,Ⅰ类整合子遗传标记qacE△1-Sul1阳性;耐氨基糖苷类基因aac（3）-Ⅱ、aac（6′）-Ⅰb、ant（3″）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ阳性。未检出氯霉素耐药相关基因catB、cm1A和四环素耐药相关基因tetA、tetB以及小多药外排泵基因smr-2。OXA-2阳性产物进行基因测序．将测得序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库已登录的OXA氨基酸序列比较,与OXA-21型最为接近,但仍存在二个氨基酸序列差别。结论我院多药耐药铜绿假单胞菌存在多种耐药基因,介导了细菌的多药耐药。     

呼吸内科多重耐药铜绿假单胞菌相关耐药基因检测分析

目的 了解该院呼吸内科分离多重耐药铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶基因和β-内酰胺酶基因携带情况.方法 用聚合酶链反应技术检测14株多重耐药铜绿假单胞菌耐药相关基因.结果 除GIM、SPM、VIM-1、VIM-2、CTX-M、aac(3′)-Ⅰ、aac(3′)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ基因全部为阴性外,其余耐药基因有不同程度的阳性.结论 携带多种耐药基因是呼吸内科多重耐药铜绿假单胞菌对氨基糖苷类和β-内酰胺类抗菌剂耐药的重要机制.     

铜绿假单胞菌毒力基因检测及临床意义

摘要：目的：检测淄博和青岛地区107例铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)临床分离株毒力基因存在情况。 方法：用ATB系统鉴定Pa;PCR法检测分离菌株exoU、exoS、pcrV、exoT以及exoY 5种毒力基因。 结果：exoU和exoS 2种基因在分离菌株中相互排斥;黏液型与非黏液型Pa菌株5种毒力基因的阳性率无显著性差异（P＞0.05）;淄博地区Pa毒力基因exoU阳性率高于青岛地区（P＜0.01）,exoS阳性率低于青岛地区（P＜0.05）。 结论：exoU和exoS 2种基因可能占据相同的染色体位点,两者不能共存;Pa黏液型与非黏液型的毒力基因携带情况相似;Pa毒力基因携带存在一定的地域性差别。     

绍兴地区铜绿假单胞菌质粒型AmpC酶DHA基因的检测

目的 探讨浙江绍兴地区铜绿假单胞菌是否存在质粒型AmpC酶基因。方法 收集浙江绍兴市多重耐药的铜绿假单胞菌进行质粒型AmpC酶DHA基因检测。结果 39株铜绿假单胞菌中3株检出DHA基因。结论 浙江绍兴地区铜绿假单胞菌已携带质粒型AmpC酶基因。     

MexAB—OprM主动外排系统在全耐药铜绿假单胞菌耐药中的作用及机制

目的探讨MexAB—OprM主动外排系统（外排泵）在全耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用及其过度表达的机制。方法联合L-酚丙氨基-L-氨基酰-β-萘胺（MC-207,110）和环丙沙星（CIP）,测定26株全耐药铜绿假单胞菌的MIC;用RT—PCR法扩增MexAB—OprM内膜转运蛋白MexB的结构基因mexB和内参照基因16SrDNA片段,根据mexB与16SrDNA扩增产物的电泳扫描比值,分析mexB mRNA的表达水平,判断MexAB—OprM的表达情况;用PCR法扩增MexAB—OprM调控基因mexR并对其产物测序,用Blast软件在GenBank中与已知序列比对。结果联合MC-207,110后有20株（76．9％）CIP的MIC值下降4倍及以上;26株全耐药铜绿假单胞菌中有22株MexAB-OprM高表达,其中有15株mexR基因发生变异,13株发生点突变,出现氪基酸替换．2株发生插入突变,导致氨基酸插入;点突变位点是336G—A、603G—A、660G—A、584C—G、653T—A,后两者导致氨基酸替换103Ala—Gly、126Val—Glu,插入突变是在470和474核苷酸间插入碱基GGC,导致66和68氨基酸间插入Ala。结论MexAB—OprM主动外排系统的高表达对铜绿假单胞菌的耐药性起重要作用,调控基因mexR的突变是其高表达的原因之一。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprM原核表达及抗体制备

目的制备铜绿假单胞菌（PA）主动外排系统外膜蛋白OprM及抗OprM多克隆抗体,为深入研究主动外排系统奠定基础。方法从PA基因组中克隆oprM基因,构建pET28 a-c-OprM表达载体,在大肠埃希菌中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并用免疫转印试验（W estern b lot）验证,建立重组OprM纯化方案,免疫动物制备多克隆抗体。结果扩增出带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点及保护碱基的oprM基因序列,构建了pET28 a-c-OprM表达载体,诱导表达的重组OprM蛋白为带有H is标签的不可溶包涵体,建立并优化了重组OprM的纯化方法,免疫小鼠获得抗OprM蛋白的多克隆抗体。结论成功制备了OprM蛋白和抗OprM多克隆抗体,为深入研究该蛋白及相关的主动外排系统提供了有效手段。     

多重耐药绿脓假单胞菌中I类整合子的研究

目的 探讨整合子介导耐药在多重耐药绿脓假单胞菌中所起的作用。方法 采用纸片扩散法进行药物敏感试验，筛选多重耐药绿脓假单胞菌；应用三维试验法区别β内酰胺酶型别；采用聚合酶链反应（PCR）技术检测耐药菌中的整合子基因，并应用DNA测序研究整合子内携带的耐药基因。结果 多重耐药绿脓假单胞菌中整合子检出率为42．4％，所检出整合子共有3种长度即750、1000、2500bp，它们分别携带了aadB、aadA2、aadB、aac6-Ⅱ和PSE-1基因。结论 整合子参与是形成绿脓假单胞菌多重耐药的重要因素。     

儿童患者中对碳青霉烯类耐药的绿脓假单胞菌产金属酶基因型研究

目的研究儿童患者中对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌产金属酶的基因型。方法本研究收集了2003年12月至2005年11月我院住院患儿中分离出的对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌59株。使用E试验法检测产金属酶的耐药表型，PCR技术检测编码金属酶的IMP、VIM、SPM和GIM4种基因型。PCR反应产物进行纯化后，使用双脱氧末端终止法进行DNA测序。将得到的拼接序列与GenBank中Blast进行同源分析，确定其基因亚型。结果59株对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌中，纸片法检测金属酶表型结果阳性29株，占49．2％。PCR检测金属酶基因型阳性39株，占66．1％，其中IMP型阳性35株，占89．7％，VIM型阳性4株，占10．3％。未检测出SPM和GIM型金属酶。测序结果显示，IMP型测序结果均为产IMP．1亚型金属酶的绿脓假单胞菌。VIM型测序结果均为产VIM-2亚型金属酶的绿脓假单胞菌。结论儿童患者中对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌，产金属酶率高于成人报道。产生的金属酶同时存在IMP-1和VIM-2两种基因型，其中以IMP-1亚型为主，少部分为VIM-2亚型。产金属酶是儿童患者对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌的重要耐药机制。在儿科进行对碳青霉烯类耐药的绿脓假单胞菌产金属酶的监测十分重要。     

Alterations of susceptibility of Pseudomonas aeruginosa by overproduction of multidrug efflux systems, MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY/OprM to carbapenems: substrate specificities of the efflux systems

Overproduction of multidrug efflux systems MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY/OprM of Pseudomonas aeruginosa caused reduction of susceptibility of the mutant, which lacked AmpC and all three systems to panipenem, meropenem, S4661 and DU6681a; meropenem, S4661 and DU6681a; and BO2727, panipenem, meropenem, S4661 and DU6681a, respectively, but not reduction of the susceptibility to imipenem and biapenem. Thus, we determined substrate specificities of these efflux systems to carbapenems. Received: February 28, 2002 / Accepted: July 5, 2002     

绿脓假单胞菌β内酰胺类耐药基因研究

目的 调查湖北襄樊地区绿脓假单胞菌多重耐药菌株中β内酰胺酶编码基因及oprD2基因存在状况。方法 采用PCR方法检测分离自本地区的35株绿脓假单胞菌耐药菌株各种β内酰胺酶编码基因TEM、SHV、OXA、PER、GES、IMP、VIM、质粒型AmpC酶DHA、MIR及OprD2。结果 35株β内酰胺类耐药基因TEM、OXA、质粒型AmpC酶DHA的阳性率分别为51．4％、17．1％、2．9％，OprD2基因缺失率100％，而SHV、PER、GES、IMP、VIM、MIR基因检测均阴性。结论研究表明，携带TEM、OXA、质粒型AmpC酶DHA以及OprD2基因缺失是导致本组绿脓假单胞菌多重耐药菌株对β内酰胺酶类抗生素耐药的重要机制。     

铜绿假单胞菌MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统的耐药作用

目的探讨MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统(外排泵)在多重耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用。方法选取36株临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌,采用琼脂二倍稀释法,测定环丙沙星对铜绿假单胞菌的MIC及进行泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)存在情况下的干预试验;用实时定量RT-PCR测定结构基因mexA、mexX的mRNA表达水平来判断MexAB-OprM、MexXY-OprM外排泵表达情况;用PCR法分别扩增其调控基因mexR、mexZ,并对其产物测序,用Blast软件在GenBank与已知序列比较,研究其过度表达的机制。结果在CCCP作用下,36株铜绿假单胞菌中24株菌对环丙沙星的敏感性(MIC)由20～320 mg/L提高到2.5～40 mg/L,主动外排表型阳性率为66.7%(24/36),15株菌高表达Mex-AB-OprM外排系统(41.7%),21株高表达MexXY-OprM外排系统(58.3%)。15株高表达MexAB-OprM外排系统铜绿假单胞菌同时表达MexXY-OprM外排系统;12株干预试验阴性的铜绿假单胞菌均无mexA、mexX高表达;随机选择mexA、mexX高表达的4株细菌均发生mexR、mexZ基因突变,出现氨基酸替代。结论主动外排系统MexAB-OprM、MexXY-OprM在多重耐药铜绿假单胞菌中过度表达是铜绿假单胞菌多重耐药的机制之一;外排泵MexAB-OprM、MexXY-OprM高表达分别与调控基因mexR、mexZ发生变异有关。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特征及β-内酰胺类耐药基因研究

目的分析该院2005年1～12月临床分离的34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗生素的耐药特征以及B～内酰胺类耐药相关基因存在状况。方法应用BDPhoenix100全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和药物敏感试验,头孢哌酮／舒巴坦敏感性检测采用K—B法。应用PCR方法检测12种β-内酰胺类耐药相关基因,分别为TEM、SHV、CARB、OXA-10、PER、VEB、GES、DHA、IMP、VIM、GIM、SPM。结果亚胺培南耐药铜绿假单胞菌除对阿米卡星100．00％敏感外,对哌拉西林、哌拉西林／他唑巴坦敏感率为48．00％～55．00％,对第3、4代头孢菌素、氨曲南、喹诺酮类等抗生素抗菌活性差,敏感率为3．22％～29．03％。对美洛配能29．03％敏感,对氨苄西林／舒巴坦、氯霉素、四环素、复方新诺明全部耐药。β-内酰胺类耐药相关基因TEM、CARB、DHA、IMP阳性率分别为5．9％、32．4％、14．7％、17．6％,而SHV、0XA-10、PER、VEB、GES、VIM、GIM、SPM均为阴性。结论耐亚胺培南的铜绿假单胞菌除对阿米卡星敏感外,对其他常用抗生素耐药严重。携带TEM、CARB、DHA、IMP基因是本组试验菌株对β-内酰胺类抗生素和亚胺培南耐药的重要机制。     

医院获得性患者铜绿假单胞菌感染分布及药敏试验情况

目的：研究医院获得性患者铜绿假单胞菌分布特点以及药敏试验情况,为临床治疗提供参考。方法对484例医院获得性痰标本进行细菌培养鉴定及药敏试验,研究铜绿假单胞菌的感染情况及药敏特点。结果484例医院获得性肺炎革兰阴性杆菌检出389株,占80.37％,以铜绿假单胞菌为主,检出207株,占42.77％,革兰阳性球菌95株,占19.63％,革兰阴性杆菌与革兰阳性球菌构成比差异有统计学意义（χ2＝354.38,P ＝0.000,P ＜0.05）。铜绿假单胞菌感染呈现增长态势;年龄分布51岁以上老人居多,占42.51％;药敏试验头孢呋辛、环丙沙星、左氧氟沙星及替卡西林／克拉维酸耐药率较高,分别达96.6％、65.3％和49.3％、49.3％,亚胺培南未发现耐药菌株。结论铜绿假单胞菌为引起医院获得性感染的重要菌群,多重耐药常见,临床治疗过程中应根据药敏试验合理使用抗菌药物。     

全耐药铜绿假单胞菌中多药外排泵mRNA表达的定量RT-PCR检测

目的分析4种重要的药物外排泵系统在临床分离的全耐药铜绿假单胞菌与全敏感铜绿假单胞菌中表达的差异。方法用SYBR G reenⅠ实时定量RT-PCR方法检测临床分离鉴定的全耐药和全敏感铜绿假单胞菌中4种外排泵M exAB-OprM、M exCD-OprJ、M exEF-OprN、M exXY-OprM的mRNA。结果全耐药菌株较全敏感菌株多药外排泵M exAB、M exXY、M exCD、M ex-EF的mRNA表达明显增高(P<0.01)。以敏感菌株拷贝平均数×4判定明显高表达,则全耐药菌M exAB高表达率为18.9%;M exXY高表达率为13.5%;M exCD高表达率为56.8%;M exEF高表达率为35.1%。37株全耐药菌有1种外排泵高表达的8株;2种外排泵高表达的10株;3种外排泵高表达的4株;4种外排泵同时高表达的2株,4种外排泵表达均未增高的有13株。结论药物外排泵系统在临床全耐药铜绿假单胞菌耐药机制中起着重要作用,研究结果提示可能还存在其他耐药机制或存在外排泵功能与其表达量存在差异的情况。     

gyrA、gyrB和外排系统共同介导铜绿假单胞菌对喹诺酮类耐药机制研究

目的探讨临床分离的对环丙沙星和左氧氟沙星均耐药的铜绿假单胞菌耐药机制。方法收集临床分离经VITEK-2（C0mpact细菌鉴定仪检测环丙沙星和左氧氟沙星均耐药的铜绿假单胞菌,琼脂稀释法测定环丙沙星和左氧氟沙星的MIC值,PCR扩增DNA促旋酶基因gyrA和gyrB以及DNA拓扑异构酶Ⅳ的parC和parE基因,实时-RT-PCR分析细菌外排系统表达情况。结果琼脂稀释法检测结果与VITEK-2 Compact细菌鉴定仪检测结果相符。PCR扩增测序发现以DNA促旋酶基因gyrA（在位点941处插入碱基C）和gyrB（3株在位点1588处缺失碱基A,其他菌株在位点1543处插入碱基T）基因缺失或者插入导致移码突变为主,parE基因有3株在位点1895处插入碱基C。实时定量PCR检测发现以mexA和mexC表达增加为主。结论检出的耐环丙沙星和左氧氟沙星铜绿假单胞菌是由于DNA促旋酶基因gyrA和gyrB基因的突变和mexAB-OprM和mexCD-OprJ表达增加共同作用的结果。