丙型肝炎病毒HCV E1区基因的真核表达载体构建及序列分析

建立丙型肝炎病毒包膜区基因的真核表达载体，并通过对其序列分析阐明其作为基因接种的可能性。方法：经常规ＲＴ－ＰＣＲ法从ＨＣＶ ＲＮＡ阳性病人的血清中扩增出ＨＣＶ Ｅ１区的基因片段，经ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ双酶发后将其克隆到真核表达载体ＰｃＤＮＡ３中，阳性克隆经ＳｍａⅠ和ＸｂａⅠ双酶切鉴定以脱氧终止法测序，同时利用计算机软件对其推定的氨基酸序列进行分析。     

慢性丙型肝炎患者HCV核心蛋白基因及其肽链的序列分析

为探讨丙型肝炎病毒感染在肝癌发生中的作用，从３５例ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性的非甲非乙型肝病患者血清中提取ＨＣＶ－ＲＮＡ，经随机引物逆转合成ｃＤＮＡ，在病毒的Ｃ基因区进行分型，再于病毒５‘－末端至Ｅ１区进行测序分析。     

丙型肝炎病毒HCV E1区基因在真核细胞中的表达及表达产物 …

建立丙型肝炎病毒包膜区基因的真核表达载体,并对表达产物进行鉴定,同时测定表达产物与抗ＨＣＶ阳性血清的反应情况。方法：用限制性内切酶ＸｂａⅠ和ＥｃｏＲⅠ从原核表达载体ｐＭＳ－ＣＶＥ１中切下ＨＣＶＥ１区的基因片段,并将其克隆到真核表达载体ＰｃＤＮＡ３．１中,阳性克隆经ＳｍａⅠ和ＸｂａⅠ双酶切鉴定后,用磷酸钙共沉淀法将其转染入小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０中,同时利用ＷｅｓｔｅｒｎＢＬｏｔ方法对表达产物进行鉴     

丙型肝炎病毒Core基因重组表达载体Pet32a-Core的构建

目的扩增丙型肝炎病毒核心区（HCV-Core）基因，并构建HCV-Core基因的重组表达载体。方法设计合成HCVCore基因全长引物，提取丙型肝炎患者血清中的HCVRNA，应用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）扩增c区基因片段，用限制性内切酶BamH1和SaL1双酶切后，连接到Pet32a表达载体中，并转化到BL21大肠杆菌中：然后PCR和双酶切鉴定转化茵落。结果扩增得到目的基因长度约600bp，经测序证实为HCV-Core基因，表明HCV-Core基因重组表达载体Pet32a-Core构建成功。结论成功构建HCV-Core基因表达载体Pet32a-Core，为下一步Core蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定基础。     

丙型肝炎病毒HCV E1区基因在真核细胞中的表达及表达产物的初步应用

目的:建立丙型肝炎病毒包膜区基因的真核表达载体,并对表达产物进行鉴定,同时测定表达产物与抗HCV阳性血清的反应情况。方法:用限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ从原核表达载体pMSCVE1中切下HCVE1区的基因片段,并将其克隆到真核表达载体PcDNA3.1中,阳性克隆经SmaⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定后,用磷酸钙共沉淀法将其转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2/0中,同时利用WesternBlot方法对表达产物进行鉴定;测定表达产物与20份抗HCV阳性血清标本和10份抗HCV阴性的血清标本的反应性。结果:经酶切过夜后从原核表达载体上切下的基因片段与经过同样双酶切的真核表达载体PcDNA3.1连接,阳性克隆经SmaⅠ和XbaⅠ酶切后产生了预期大小的354bp的片段。经磷酸钙转染,产生了具有对G418抗性的细胞克隆,经WesternBlot方法用抗HCVE1区合成肽抗原的单抗检测表达产物,产生了特异的反应;并证实该表达产物与HCV患者的血清有特异反应。经WesternBlot证实在抗HCV阳性血清中有35%(7/20)可与表达产物产生特异的反应;阳性细胞经3个月传代后,仍可检测到HCVE1的表达产物。结论:此项研究所建立的能够表达HCVE1基因细胞系表达产物可与阳性血清发生特异性反应,该细胞系的建立为进一步研究抗HCVE1抗体的临床意义及进行有关HCV核酸免疫的研究创造了条件。     

中国HCV一株NS5区部分基因克隆及序列分析

研究HCVNS5基因的结构与功能，为进一步研制适合我国使用的第3代抗-HCV试剂打下基础。方法：自行设计引物，从河北固安县慢性丙型肝炎患者血中，用逆转录-聚合酶链反应扩增出HCVNS5基因，并将其克隆到载体pKPL-3α，经Dotblot、Southernblot和限制性内切酶分析筛选出阳性克隆pKHC－5α，进行序列测定。结果：核苷酸序列分析表明，克隆的HCVNS5基因与HCVⅡ／1b的核苷酸同源性约90％。结论：所克隆的HCV属于我国常见的HCVⅡ／1b基因型。     

丙型肝炎病毒NS5B区基因的扩增、克隆及序列分析

目的 对丙型肝炎病毒(HCV)NSSB区基因克隆并测序，研究其变异状况。方法 从HCV RNA阳性血清中抽提病毒RNA，利用巢式RT-PCR对NS5B区基因进行扩增，将扩增获得的靶cDNA克隆至P^KPL-3a质粒载体中，并以内引物为测序引物进行序列测定分析。结果 构建了已克隆HCVNS5B区基因的重组质粒KHC5—1；序列分析表明，与HCV-BDS株同源性最高，属于主要流行于我国的HCV 1b基因亚型。结论 证实了在NS5B区，与RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)活性密切相关的基元结构Gly-Asp-Asp及其相邻序列的同源性非常高。     

丙型肝炎病毒C，E2，NS3区基因嵌合重组载体的构建

目的：构建包含丙型肝炎病毒（HCV）C区、E2区及NS3区的嵌合重组载体。方法：设计合成3对寡核苷酸引物，用PCR法从HCV重组质粒pHCVc、pBE2和pGMXNS3-5中特异扩增出编码HCV C区、E2和NS3区抗原的部分基因片段（501、603和900bp)，分别用HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，逐个定向连接到质粒pcDNA3中，转化宿主菌XL1－Blue，分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果：酶切鉴定示所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道序列及预计结果一致，证实符合表达框架。结论成功构建了HCV嵌合重组质粒pcDNA3-C-E2-NS3.     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建

目的：构建HCV NS5A/pCI-neo真核表达载体,转染Huh-7细胞系,为体外高效表达NS5A蛋白奠定基础。方法：用PCR方法从带有丙型肝炎病毒NS5A基因的pC DNA 3.1（+）/HCV NS345质粒中扩增出HCV NS5A基因,然后TA克隆于pGEM-T载体中,转化大肠杆菌JM109。阳性克隆经测序鉴定,再经双酶切消化后插入真核表达载体pCI-neo上,经酶切鉴定与测序证实。结果：用PCR方法扩增出HCV NS5A基因全序列,因其 cDNA的G+C含量高直接测序未成功,后经TA克隆,筛选得到的阳性克隆经测序鉴定,与设计的HCV NS5A基因序列完全一致。经酶切连接并成功插入pCI-neo上。结论：成功构建了高效表达丙型肝炎病毒NS5A基因的pCI-neo真核表达载体。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的表达载体构建及在酵母中的表达

目的：为探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心（core）蛋白的功能，在真核生物酵母细胞中表达HCV核心蛋白基因。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法在HCV全长质粒pBRTM／HCV为膜板扩增HCV核心蛋白基因，克隆到pGEM－T载体中，双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HCV核心蛋白基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示了HCV核心蛋白在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在，分子量22000ku左右。结论：HCV核心蛋白在酵母中表达成功。     

丙型肝炎病毒结构蛋白真核表达载体的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)结构蛋白的真核表达载体.方法:用RT-PCR方法扩增HCV结构基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA3中,用磷酸钙转染法将其转入Sp2/0细胞,用免疫组化法检测细胞中瞬时表达的目的蛋白.结果:克隆的基因片段全长约1.9kb,包括C及E2的全长和E1的部分.免疫组化显示表达蛋白位于细胞浆中.结论:构建的丙型肝炎病毒结构蛋白的真核表达载体能够在哺乳动物细胞中得到表达,为进一步研究HCV结构蛋白的性质及各结构蛋白相互作用下的基因免疫效果奠定了基础.     

小鼠MME基因真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆小鼠巨噬细胞金属弹力酶(MME)基因结构域Ⅰ和Ⅱ,构建真核细胞表达载体,用于动物肿瘤原位种植模型的研究.方法通过PCR选择性扩增MME基因结构域Ⅰ和Ⅱ,克隆入pGEM-T载体中,限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切及PCR鉴定.结果以MME cDNA为模板进行PCR扩增的特异性片段在750 bp和1 000 bp之间.以此构建的pGEM-T-MME克隆载体和表达载体, 经限制性内切酶酶切证实载体中带有MME目的基因片段; 与小鼠MME cDNA序列的碱基符合率为99.63%; 证明MME基因已正确克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中.结论成功构建了pcDNA3.1-MME重组质粒,奠定了转基因研究MME表达与肿瘤生长转移关系的实验基础.     

大鼠Neurogenesin-1基因真核表达载体的构建及在cos-7细胞中的表达

目的 克隆大鼠海马中Neurogenesin-1(Ng1)基因片段,构建pSecTag2/Hygro B-Ng1真核表达载体,并检测其在cos-7细胞中的表达,为进一步研究该基因对脊髓神经干细胞分化的影响提供实验依据.方法 在无RNA酶污染的条件下提取出大鼠海马总RNA.利用逆转录聚合酶链反应扩增出Ng1基因片段.将该基因片段连接到真核表达载体pSecTag2/Hygro B,聚合酶链反应初步筛选,双酶切鉴定后送测序.将构建成功的重组真核表达载体转染入cos-7细胞,Western blot鉴定重组Ng1蛋白的表达. 结果 逆转录聚合酶链反应成功获得大鼠Ng1 cDNA.随机挑选10个重组真核表达载体的克隆,聚合酶链反应筛选出阳性克隆2个,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组质粒构建成功.脂质体介导转染cos-7细胞48 h后,Western blot鉴定重组Ng1蛋白在cos-7细胞中的表达,在46 ku处出现阳性条带. 结论 大鼠海马Ng1基因的真核表达载体pSecTag2/Hygro B-Ng1构建成功,转染cos-7细胞后能够表达重组Ng1蛋白.     

HCV NS4B表达载体的构建及其对细胞凋亡的影响

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）2a 型非结构蛋白4B（NS4B）的真核表达载体,并观察其对骨肉瘤细胞U2OS凋亡的影响。方法以质粒PJFH1为模板,通过PCR反应扩增4 目的基因片段,采用同源重组法与PCMV-tag2b 载体相连,转化大肠杆菌感受态DH5α,筛选正确的克隆。以脂质体为介导转染U2OS 细胞,通过Western blot 检测NS4B蛋白的表达,免疫荧光检测细胞的凋亡。结果构建pCMV-tag2b-NS4B 重组质粒,经测序其与NCBI 公布的序列完全一致,并可在U2OS 细胞中表达,DAPI 检测显示细胞凋亡率为（17.25±2.5）%,对照组凋亡率为（6.53±2.36）%。结论成功构建NS4B 的真核表达载体,并可在U2OS 细胞中表达,诱导细胞凋亡。     

Klotho基因真核表达载体的构建及其在TCMK-1细胞中的稳定表达

目的构建小鼠Klotho基因真核表达载体,进而获得稳定表达Klotho分子的小鼠肾上皮细胞株TCMK-1。方法应用PCR方法扩增带有FLAG标签的Klotho编码基因,并克隆至载体pCD．CXIN（CMV-MCS-IRES-Neomycin）的相应位点;经酶切及测序鉴定重组质粒,脂质体转染TCMK-1细胞,通过G418筛选得到稳定表达Klotho分子的TCMK-1细胞株;Real-TimePCR检测KlothomRNA水平,Westernblotting检测Klotho蛋白的表达。结果将带有FLAG标签的Klotho基因重组表达载体转染至TCMK-1细胞后,经G418筛选获得TCMK-1细胞株。与对照组相比,KlothomRNA和蛋白表达均显著升高。结论成功构建了Klotho基因的重组表达载体,并获得了稳定表达Klotho基因的TCMK-1细胞株,为进一步研究Klotho基因和蛋白在小鼠肾上皮细胞中的作用奠定了基础。     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的:利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)的原核表达载体pBV220/mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法:制备重组质粒pGEM-T/hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果:重组原核表达质粒pBV220/mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论:成功构建了原核表达载体pBV220/mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的：利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子（human brain-derived neurotrophic factor, hBDNF）的原核表达载体pBV220／mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法：制备重组质粒pGEM-T／hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果：重组原核表达质粒pBV220／mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论：成功构建了原核表达载体pBV220／mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。     

构建可诱导表达MST1基因的慢病毒载体及其在肝癌细胞系Huh-7中的表达

 目的 构建可诱导表达MST1基因的慢病毒载体,为进一步研究MST1与肝癌之间的关系提供理想的模型。方法 克隆MST1基因到慢病毒载体pLVPT-tTRKRAB中,2种慢病毒载体（pLVPT-tTRKRAB-MST1和pLV-tTRKRAB-Red）与包装质粒通过293FT细胞系介导,分别包装成病毒颗粒,先后2次去感染肝癌细胞系Huh-7。培养7 d后,使用强力霉素（doxcycline）进行诱导,用Western blot检测MST1表达情况。结果 构建了可诱导MST1真核表达病毒载体并获得相应的病毒,病毒可以高效感染目的肝癌细胞系Huh-7。在强力霉素诱导条件下,肝癌细胞系Huh-7可以表达MST1。结论 成功构建出可诱导表达MST1基因的慢病毒载体,并获得在强力霉素诱导条件下可以表达MST1的肝癌细胞亚系。     

携带DNMT1-shRNA真核表达载体的构建及其对DNMT1表达的影响

目的构建携带针对DNA甲基转移酶1（DNMT1）mRNA的shRNA真核表达载体,检测重组质粒对DNMT1的沉默效应。方法以DNMT1mRNA序列为靶基因设计shRNA和阴性对照序列（HK）,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体7P-Gensil-1中,构建真核表达载体P-DNMT1-shRNA、P-HK。将重组质粒转染到大肠杆菌DH5口中,经筛选后对提取质粒测序鉴定。用构建的重组质粒转染T24细胞,进行RT-PCR和western blot检测,观察DNMT1mRNA和蛋白的变化。结果重组质粒经Sac Ⅰ酶切得到大小两个基因片段,与设计相同,经测序显示插入完全正确;DNMT1mRNA在24h、48h和72h的抑制率为28．44％、52．48％、70．91％;其蛋白在24h、48h和72h的抑制率为24．27％、57．79％、69．74％。结论成功构建了P-DNMT1-shRNA真核表达载体并能有效沉默T24细胞中DNMT1H水NA和蛋白的表达。