慢性牙周炎龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌胶原酶水平与牙周病变程度的关系

目的 检测慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）胶原酶基因prtC及其产物PrtC，了解PrtC水平与牙周病变程度的关系，确定PrtC诱导细胞分泌炎性细胞因子的作用。方法 采用SDS-PAGE检测原核表达系统重组PnC（rPrtC）表达和Ni-NTA亲和层析法提取的rPrtC纯度。rPrtC免疫家兔获得抗血清。建立多重PCR检测56例CP患者209牙位的龈下菌斑标本中Pg 16S rDNA和prtC基因。建立ELISA检测上述标本中的PrtC，并分析PrtC水平与牙周病变程度的关系。采用ELISA检测rPrtC诱导人脐静脉内皮细胞EVC-304分泌IL-1α、IL-8和TNF-α的作用。结果 rPrtC表达产量约占细菌总蛋白的50％。提纯的rPrtC SDS-PAGE后仅见单一的蛋白条带。96．1％（201／209）和92．3％（1931209）的龈下菌斑标本分别Pg 16S rDNA和prtC基因PCR阳性，91．4％的龈下菌斑标本（191／209）PrtC ELISA阳性。重度CP龈下菌斑标本中PrtC含量明显高于轻度和中度CP标本（P〈0．05），但轻度和中度、中度和重度四标本之间PrtC含量差异无统计学意义（P〉0．05）。1μg的rPrtC作用EVC-304细胞24h后，5和10μg的rPrtC作用EVC-304细胞12h后均可使EVC-304细胞分泌的IL-1α、IL-8和TNF-α水平明显增高（P〈0．05）。结论 Pg有很高的prtC基因携带率和表达率。CP牙周病变程度与龈下PrtC水平密切相关。rPrtC有直接诱导细胞合成并分泌IL-1α、IL-8和TNF-α的活性。     

应用PCR检测慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卜啉单胞菌及感染菌株基因型的分析

目的 建立慢性牙周炎（CP）龈下标本中牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg)的PCR检测方法，了解不同患牙龈下菌斑中Pg基因型的差异。方法 采用培养法分离不同患牙龈下菌斑中Pg，同时采用PCR进行Pg 16S rDNA基因、prtC基因和fimA基因的检测。部分扩增产物T－A克隆后测定核苷酸序列。结果 61例患者122个龈下菌斑标本中，Pg 16S rDNA、prtc和fimA分别扩增的阳性率依次为90．6％、81．9％和78．0％，联合扩增的阳性率高达98．4％，培养法阳性率仅为31．1％。30．0％（18／60）患者不同牙位龈下菌斑中的Pg基因型不一致。Pg 16S rDNA、prtC和fimA扩增片段与文献报道的核苷酸序列比较，同源性98．62％－100％。结论 所建Pg PCR检测方法具有较高的敏感性和特异性，可用于慢性牙周炎龈下标本中Pg的快速临床诊断。部分CP患者可被不同基因型的Pg菌株同时感染。     

应用PCR检测慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌及感染菌株基因型的分析

目的建立慢性牙周炎(CP)龈下标本中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, Pg)的PCR检测方法,了解不同患牙龈下菌斑中Pg基因型的差异. 方法采用培养法分离不同患牙龈下菌斑中Pg,同时采用 PCR进行Pg 16S rDNA基因、prtC基因和fimA基因的检测.部分扩增产物T-A克隆后测定核苷酸序列. 结果 61例患者122个龈下菌斑标本中,Pg 16S rDNA、prtC和fimA分别扩增的阳性率依次为 90.6%、81.9%和78.0%,联合扩增的阳性率高达98.4%,培养法阳性率仅为 31.1%.30.0%(18/60)患者不同牙位龈下菌斑中的Pg基因型不一致.Pg 16S rDNA、prtC和fimA扩增片段与文献报道的核苷酸序列比较,同源性为98.62%～100%. 结论所建Pg PCR检测方法具有较高的敏感性和特异性,可用于慢性牙周炎龈下标本中Pg的快速临床诊断.部分CP患者可被不同基因型的Pg菌株同时感染.     

慢性牙周炎患者龈下菌斑中伴放线放线杆菌基因型的分析

目的：建立龈下菌斑标本中伴放线放线杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans，Aa）PCR检测方法，了解慢性牙周炎患者不同牙位的龈下菌斑中Aα 的感染率及其优势基因型。方法：61例慢性牙周炎患者每例采取2个不同牙位共122份龈下菌斑标本，采用培养法分离Aα菌株，以PCR或多重PCR检测16SrDNA基因、lktA基因和fap基因，部分扩增产物克隆后测序。结果：在11例患者的11份龈下菌斑标本中分离到Aα菌株。122份龈下菌斑中Aα16SrDNA、lktA、和fap检测阳性率分别为84.4%、75.4%、和50.0%。38.8%的患者（19/49）不同牙位龈下菌斑中检出的Aα基因型不一致。Aα有4种基因型，其优势基因型是16SrDNA^ /lktA^ /fap^ ，其次为16SrDNA^ /lktA^ /fap^-。部分标本上述3种基因的扩增片段与文献报道核苷酸序列的同源性为93.75%-100%。结论：建立的PCR或多重PCR有较高的敏感性和特异性，适用于龈下菌斑标本中Aα的快速检测。慢性牙周炎患者Aα感染率较高，并存在优势基因型，部分患者可被不同基因型的菌株同时感染。     

甲型副伤寒杆菌鞭毛蛋白H1a基因原核表达系统构建及其表达产物的免疫原性和保护作用

目的 构建甲型副伤寒杆菌（Salmonella paratyphi A）H1a基因原核表达系统，确定表达产物rH1a免疫原性和保护作用，检测甲型副伤寒杆菌临床菌株H1a基因携带和表达情况。方法 采用高保真PCR从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中扩增H1a基因，T-A克隆后测序，构建H1a基因原核表达系统pET32a-H1a-E．coli B121DE3。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检查rH1a表达情况，Ni-NTA亲和层析法收集rH1a。采用Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性。建立PCR和ELISA检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株H1a基因携带和表达频率。观察rH1a对甲型副伤寒杆菌50001株感染小鼠的免疫保护作用。结果 与报道的相关序列比较，所克隆的H1a基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为99．59％。rH1a表达量为细菌总蛋白的60％左右。甲型副伤寒杆菌全菌抗血清能识别rH1a并与之结合。rH1a免疫家兔可产生抗体。100％（98／98）甲型副伤寒杆菌临床菌株均含有H1a基因并表达H1a。500μg rH1a灌喂或皮下注射免疫小鼠受甲型副伤寒杆菌50001株攻击后的存活率均为50．0％，若加入5μg rLTB，存活率分别上升至75．0％和66．7％。结论 本研究成功地从甲型副伤寒杆菌临床菌株中构建了H1a基因高效原核表达系统。rH1a有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用。甲型副伤寒杆菌临床菌株广泛存在H1a基因并高频率表达。     

牙龈卟啉菌脂多糖诱导HL-60细胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-6能力及其相关Toll样受体和信号通路的差异

目的探讨牙龈卟啉菌（Porphyromonasgingivalis）脂多糖诱导人粒细胞HL-60分泌IL-lβ、TNF-α、IL-6能力差异及其相关T0u样受体和信号通路。方法采用酚水法提取牙龈卟啉菌ATCC33277株脂多糖（Pg—LPS）。采用ELISA试剂盒定量检测Pg—LPS作用的HL-60细胞分泌IL-lβ、TNF-α和IL-6水平。采用TLR2或心单克隆抗体阻断试验联合ELISA检测，了解Pg—LPS结合靶细胞上Toll样受体的类型。采用JNK、P38MAPK和NF-kB通路特异性阻断剂的阻断试验联合ELISA检测，了解Pg—LPS诱导HL-60细胞分泌IL-lβ、TNF-α和IL-6的相关胞内信号传导通路。实验中采用大肠杆菌O111：B4脂多糖（E-LPS）作为对照。结果1μg／ml Pg—LPS分别作用2，4、48和48h或1μg／ml E—LPS分别作用48、48和72h，HL-60细胞分泌的IL-1β、TNF-α和IL-6水平明显升高（P〈0．01）；Pg—LPS诱生的TNF-α最高浓度与E-LPS相近（P〉0．05），但诱生的IL-Iβ和IL-6最高浓度明显高于E—LPS（P〈0．05）。TLR2单抗可抑制Pg—LPS诱导HL-60细胞分泌IL-lβ、TNF-α或IL-6的活性（P〈0．05），但BLPS诱导HL-60细胞分泌上述3种细胞因子的活性仅可被TLR4单抗所抑制（P〈0．05）。Pg—LPS诱导HL-60细胞分泌IL-lβ、TNF-α和IL-6的信号通路分别为JNK和NF-kB、JNK和P38MAPK及NF-kB、JNK和P38MAPK（P〈0．05），E-LPS则分别为JNK和P38MAPK及NF-kB、P38MAPK和NF-kB、P38MAPK和NF-kB（P〈0．05）。结论Pg—LPS诱导HL-60细胞分泌IL-lβ、TNF-α和IL-6活性高于E-LPS。TLR2和11尉分别可能是Pg—LPS和E-LPS的受体。Pg-LPS诱导HL-60细胞合成上述细胞因子的信号传导通路与E-LPS明显不同，不同细胞因子合成的胞内信号传导通路也不尽相同。     

四环素类药物对牙周炎治疗作用的研究进展

牙周炎主要是由特异性微生物的龈下感染所致，表现为牙周组织炎症和牙槽骨吸收。传统的牙周治疗是采用机械疗法清除局部刺激物。这种外科性质的清创术只能去除附着性菌斑，对于非附着性菌斑则未能奏效。四环素类药物近十多年来国内临床很少应用，近期国外学者认为盐酸四环素是牙周炎化学疗法的首选药物。四环素对牙周炎的治疗作用具有如下特点：（１）有效抑制龈下菌斑中致牙周炎的革兰氏阴性菌：（２）在龈沟液中的浓度明显高于其血清浓度；（３）易于吸附于牙根表面，然后以活性形式缓慢释放，从而延长作用时间。四环素还具有调节宿主反应…     

幽门螺杆菌napA基因原核表达系统构建及其表达产物的免疫性和致炎作用

目的　构建幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)napA基因的原核表达系统 ,了解表达产物rNAPA免疫性和致炎作用。方法　采用PCR从Hp临床菌株Y0 6株DNA中扩增napA全长基因片段 ,T A克隆后测序 ,构建napA基因原核表达系统pET32a napA E .coliBL2 1DE3。采用SDS PAGE估计不同浓度IPTG诱导下rNAPA表达产量 ,Ni NTA亲和层析收集rNAPA。采用Westernblot和免疫扩散试验鉴定rNAPA的免疫性。采用ELISA分别检测 1 0 9株Hp临床菌株NAP(neutrophil activatingprotein)表达、1 2 5例Hp感染者血清中NAP抗体和rNAPA诱导人脐静脉内皮EVC 30 4细胞分泌IL 1、IL 8、TNF α和ICAM 1的作用。结果　所克隆的napA基因与报道的相应核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 94 .8%和 96 .9%。所构建的napA基因原核表达系统rNAPA表达量高达细菌总蛋白的 5 0 %以上。Hp全菌抗体商品 (DAKO)能识别rNAPA并与之结合 ,rNAPA兔抗血清的免疫扩散试验效价为 1∶8。 95 .4 %Hp临床菌株 (1 0 4 1 0 9)表达NAP ,92 .8%Hp感染者 (1 1 6 1 2 5 )血清中存在rNAPA抗体。 1～1 0 μg的rNAPA均可诱导人脐静脉内皮细胞株EVC 30 4IL 1、IL 8、TNF α和ICAM 1的分泌明显增加 (P<0 .0 5～ 0 .0 1 )。结论　成功地从Hp临床菌株Y0 6中构建了napA基因高     

甲型副伤寒杆菌ompA基因分布及重组表达产物的免疫学鉴定

目的 构建甲型副伤寒杆菌ompA基因原核表达系统,确定其重组表达产物rOmpA免疫原性和保护作用,检测甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率.方法 采用PCR从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中扩增ompA基因,T-A克隆后测序并构建ompA基因原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rOmpA表达情况及其产量,采用免疫扩散法、微量肥达试验和Western blot鉴定其抗原性和免疫反应性.采用PCR检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率.采用小鼠感染模型,了解rOmpA对甲型副伤寒杆菌50001株感染的免疫保护作用.结果 与报道的相关序列比较,所克隆的ompA基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.rOmpA表达量约为细菌总蛋白的65%.rOmpA能与其兔抗血清和甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生免疫反应(Western blot),并可在家兔中诱导产生抗体.94.9%(93/98)甲型副伤寒杆菌临床菌株含有ompA基因.100 μg和200 μg rOmpA对感染小鼠的免疫保护率分别为41.7%(5/12)和58.3%(7/12).rOmpA免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清对各副伤寒杆菌H抗原的凝集效价为1:5～1:40.结论 ompA基因在甲型副伤寒杆菌临床菌株中分布广泛.rOmpA有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可考虑为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原.     

人EGF受体胞外域在大肠杆菌中表达、复性及抗原性鉴定

目的 构建人EGF受体（EGFR）胞外域的原核表达载体并在大肠杆菌中表达,制备EGFR特异性抗体,对表达产物进行鉴定。方法 以PCR方法从克隆的EGFR胞外区cDNA中扩增编码胞外结构域L1、S1、L2（EGFR-LSL）的DNA片段,并在其3′端加入编码His6标签的序列,与pET-3c连接构建EGFR-LSL原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达;同时以纯化的EGFRL2结构域蛋白（EGFR-L2）制备抗血清,以此抗血清鉴定表达产物。结果 EGFR-LSL在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效表达,抗His6抗体免疫印迹分析表明,表达产物全部以包涵体形式存在,通过Ni2^＋．NTA柱上复性获得纯化的可溶性EGFR-LSL蛋白;免疫印迹分析表明,EGFR-LSL与小鼠抗EGFR-L2抗血清具有高特异性反应。结论 从大肠杆菌中获得具有特异抗原性的可溶性EGFR-LSL蛋白。     

胱硫醚合酶基因及其在人群中的多态性

胱硫醚合酶的活性降低或丧失是心脑血管系统等系统疾病独立的危险因子或易感因素.目前研究发现使酶活性降低或丧失的胱硫醚合酶基因的变异在人群中存在多态性.     

肝豆状核变性基因表达产物及基因突变的研究

目的 探讨肝豆状核变性（Wilson's disease,WD)的发病机理。方法 将活检获得的WD患者肝标本体外分离,培养肝细胞,应用Western印迹法对WD患者肝细胞WD蛋白进行检测,同时扩增其基因组DNA并直接测序。结果 3例WD患者中有2例出现肝细胞WD蛋白特异条带密度降低。DNA测序发现其中一例患者存在ATP7B778位点CGG→CTG（Arg778Leu)杂合突变及770位点CTC→CTG改变。结论 WD基因在WD患者肝细胞的蛋白表达存在异常。可能与ATP7B基因突变有关。     

Loss of retinoblastoma gene and amplification of N-myc gene in retinoblastoma.

We have analyzed paired samples of genomic DNA from peripheral leukocyte and primary tumor tissue from nine patients with retinoblastoma (RB) and from two RB cell lines, WERI-Rb-1 and Y79, to detect the molecular alterations of the retinoblastoma susceptibility gene (RB-1) and N-myc gene. In Southern analysis, RB-1 deletions in tumor tissues were detected in five patients (56%), one of these revealed a total loss of RB-1. N-myc amplification was found only in one (11.1%) out of nine patients. We also observed a total loss of RB-1 in WERI-Rb-1, and a more than 100-fold amplification of N-myc in Y79. The analysis of the relationship between molecular events and clinical characteristics such as age, sex, tumor laterality did not reveal any specific correlation. These results suggest that genetic backgrounds of RB in Korean patients are quite similar to those of reported cases elsewhere. The high sensitivity of our method in detecting the RB-1 loss indicates that this method can be a useful tool for initially screening a large number of tumors.     

Chromosomal mapping and gene disruption of the ADHIII gene in Aspergillus nidulans

Summary There are at least three alcohol dehydrogenases in Aspergillus nidulans. ADHIII has no obvious physiological function. We describe here the cloning of the ADHIII gene (alcC), its mapping on linkage group VII by reverse genetics, and the properties of multicopy transformants tested for their ability to grow on a range of alcohols (butan-1-ol being the best substrate tested for growth). We were unable to detect any obvious alteration in phenotype of a strain carrying a disrupted copy of the ADHIII gene.     

bax和c—fos基因在肝癌及肝硬变细胞中的表达

本实验用免疫组化技术ＡＢＣ法,测定了肝几肝硬化细胞中的ｂａｘ和ｃ－ｆｏｓ蛋白。结果表明：癌组的ｂａｘ和ｃ－ｆｏｓ基因表达均显著增高,提示,ｃ－ｆｏｓ基因激活,导致肝癌的发生,同时,促细胞凋亡基因ｂａｘ表达增强,细胞凋亡剧烈。     

eNOS基因和MTHFR基因多态性与子痫前期发病关系的研究

目的探讨内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因第7外显子G894T突变和N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T突变与子痫前期的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,对53例子痫前期患者(子痫前期组)和49例正常妊娠妇女(对照组)的eNOS基因G894T突变和MTHFR基因C677T突变进行检测。结果子痫前期组eNOS基因Glu/Glu、Glu/Asp、Asp/Asp基因型频率分别为71.7%、28.3%、0.0%;MTH-FR基因CC、CT、TT基因型频率分别为22.7%、39.6%、37.7%。对照组eNOS基因Glu/Glu、Glu/Asp、Asp/Asp基因型频率分别为83.7%、16.3%、0.0%;MTHFR基因CC、CT、TT基因型频率分别为20.4%、61.2%、18.4%。子痫前期患者TT基因型频率(37.7%)显著高于对照组(18.4%)(P<0.05),而CT基因型频率子痫前期组(39.6%)显著低于对照组(61.2%)(P<0.05),而eNOS基因型和等位基因频率两组比较差异均无显著性(P>0.05)。携带TT基因型个体发生子痫前期的风险增加2.69。结论eNOS基因G894T突变与子痫前期发病无关;MTHFR基因TT基因型能增加子痫前期的患病风险;eNOS基因和MTHFR基因在子痫前期发病中无协同作用。     

载体与基因转染的研究进展

基因载体是指将基因或其它核酸物质运载到细胞中的工具.其化学本质可以是蛋白质或多肽、核酸、脂类、糖类、其它有机分子或它们的复合物.基因传递系统是基因治疗的重要组成部分,也是目前基因治疗的瓶颈.现有的基因载体包括两类.即病毒载体和非病毒载体.病毒载体转染效率高,但由于其转染具有免疫原性和致突变性限制了它的应用;非病毒载体系统具有低毒、低免疫原性和相对靶向性等优点,是新兴发展起来的基因转移系统.就各种载体的最新研究进展作一综述.     

Characterization of a beta-tubulin gene and a beta-tubulin gene products of Brugia pahangi

A genomic clone containing a beta-tubulin gene from the parasitic nematode Brugia pahangi was isolated. This gene was sequenced to determine its size, structural organization, and corresponding primary amino acid sequence. The coding sequence of the beta-tubulin gene spans 3.8 kb, is organized into 9 exons and expresses an mNRA of 1.8 kb which codes for a protein of 448 amino acids. The predicted beta-tubulin amino acid sequence is 89%, 94%, 90% and 88% identical to the chicken beta 2, and the Caenorhabditis elegans ben-1, tub-1 and mec-7 gene products, respectively. Southern hybridization analyses demonstrated that there is only one copy of this gene isotype but that other distinct beta-tubulin genes may exist in the Brugia pahangi genome. A nematode specific antipeptide rabbit antiserum raised against the predicted amino acid sequence of the extreme carboxy-terminal region of the B. pahangi beta-tubulin was used to identify beta-tubulin isoforms in adult nematodes and microfilariae. Isoforms detected by this nematode-specific antipeptide antiserum were identical in both adult worms and microfilariae and did not differ from the isoform patterns detected by a monoclonal antibody recognizing a conserved beta-tubulin epitope. This suggests that this carboxy-terminal peptide is highly represented in the beta-tubulin isoforms of B. pahangi.