TLR-4和CD14在急性前葡萄膜炎小鼠虹膜中的表达

目的 观察内毒素诱导的小鼠急性前葡萄膜炎模型中虹膜Toll样受体-4(Toll-like receptor-4,TLR-4)和CD14的表达.方法 C3H/HeN(野生型)和C3H/HeJ(TLR-4基因缺陷型)小鼠足底注射霍乱弧菌内毒素,建立急性前葡萄膜炎动物模型,注射后每隔2h用裂隙灯进行眼前节观察,并做组织病理学检查.用Western blotting及免疫组织化学法检测小鼠虹膜中TLR-4及CD14蛋白的表达.结果 C3H/HeN小鼠在内毒素注射后4～6 h,小鼠结膜囊内出现大量白色分泌物,12～18 h瞳孔区偶见白色渗出,22～24 h可见虹膜后粘连及渗出物,36～48 h前房内未见炎症消退;C3H/HeJ小鼠未见眼前节炎症反应.通过Western boltting发现正常C3H/HeN小鼠虹膜内有TLR-4蛋白的表达,注射内毒素24 h后TLR-4的表达量显著增高,与12 h相比差异有显著统计学意义(P=0.009).免疫组织化学显示在内毒素诱导后24 h,TLR-4与CD14在急性前葡萄膜炎模型虹膜组织中大量表达,而在C3H/HeJ小鼠中未见TLR-4蛋白的表达.结论 TLR-4在内毒素诱导的C3H/HeJ(TLR-4基因缺陷)小鼠中未见表达,而在C3H/HeN(野生型)急性前葡萄膜炎动物模型虹膜组织中大量表达.TLR-4可能在急性前葡萄膜炎发病环节中发挥着重要作用.     

TLR2/MyD88信号系统在大鼠角膜移植术后排斥反应中的作用

目的 探讨Toll样受体2(Toll like receptor,TLR2)/MyD88信号系统在大鼠角膜移植术后排斥反应中的作用.方法 取14只SD大鼠为供体,28只Wistar大鼠为受体,建立28个同种异体穿透性角膜移植模型.建模后分为同种异体角膜移植组14只(6只用于术后观察排斥情况),同种异体角膜移植TLR2单克隆抗体组14只(6只用于术后观察排斥情况).另选16只Wistar大鼠,分为同种自体角膜移植组8只,正常对照组8只.3个手术组大鼠分别行穿透性角膜移植术.术后TLR2单克隆抗体组给予0.5 g·L-1TLR2单克隆抗体,分别于术后0d、2d、4d、6d、8d分5次经球结膜下注射给药.正常对照组、同种自体角膜移植组及同种异体角膜移植组给等量生理盐水.术后每天于裂隙灯下观察角膜透明度、新生血管,并用排斥反应指数评分.第9天取材,行HE、免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测.结果 术后随时间变化各手术组角膜植片均出现不同程度的水肿、混浊和新生血管生长,以同种异体角膜移植组最为明显.HE染色结果显示在同种异体角膜移植组,角膜基质层出现水肿、大量炎症细胞浸润和新生血管,而在同种自体角膜移植组和TLR2单克隆抗体组中炎症反应较轻.免疫组织化学检测结果:TLR2和MyD88分子在正常对照组、同种自体角膜移植组及TLR2单克隆抗体组的角膜上皮中均有微量表达,同种异体角膜移植组角膜上皮、基质细胞中TLR2和MyD88分子的表达明显增多,尤以基质层明显.实时荧光定量PCR结果显示同种异体角膜移植组角膜组织TLR2 mRNA、MyD88 mRNA的表达较同种自体角膜移植组(P =0.000、0.004)和正常对照组(P=0.000、0.000)显著增加,两者的表达亦较TLR2单克隆抗体组显著增加(P =0.000、0.003).结论 TLR2单克隆抗体抑制TLR2及其下游信号分子MyD88的表达;TLR2/MyD88信号系统参与了角膜移植术后排斥反应,影响了角膜植片的转归.     

内毒素诱导的葡萄膜炎中虹膜固有组织细胞上MyD88与TLR-4的共表达

目的观察小鼠内毒素诱导的葡萄膜炎(endotoxin-induced uveitis,EIU)模型中Toll样受体-4(Toll-like receptor-4,TLR-4)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、CD163的共表达。方法 6～8周龄雄性C3H/HeN(野生型)小鼠25只,C3H/HeJ(TLR-4基因缺陷型)小鼠5只,分别腹腔注射霍乱弧菌内毒素细胞壁脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导急性前葡萄膜炎动物模型,处死小鼠后虹膜、睫状体铺片,用免疫荧光三标记的方法检测虹膜、睫状体组织内不同时间CD163、TLR-4、MyD88的表达,并对虹膜内CD163、TLR-4和MyD88阳性细胞进行计数分析。结果 C3H/HeN小鼠LPS注射后12h结膜囊内出现炎症反应,24～48h达到高峰,72h炎症逐渐消退,而C3H/HeJ小鼠LPS注射后没有发现炎症反应。在内毒素诱导的C3H/HeJ小鼠虹膜中未检测到CD163、TLR-4和MyD88阳性细胞。C3H/HeN小鼠腹腔注射LPS后在虹膜铺片内0h未见CD163、TLR-4与MyD88阳性表达,12h后可见阳性细胞(40.3±8.9、45.2±6.3、42.5±4.1),24h阳性细胞数(121.0±39.5、138.6±28.3、125.5±36.1)较12h明显增多,差异均有统计学意义(均为P<0.05);48h阳性细胞数(132.3±54.5、129.9±36.2、122.1±29.3)与24h相比,差异均无统计学意义(均为P>0.05);72h阳性细胞数(12.8±3.2、10.4±5.6、9.3±5.2)较48h减少,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)。结论小鼠EIU模型中,LPS激活了CD163标记的巨噬细胞膜表面的TLR-4,TLR-4与MyD88途径可能是EIU主要的信号传导途径。     

腹腔巨噬细胞核因子转位在小鼠内毒素诱导葡萄膜炎发病中的作用

目的观察野生型C3H/HeN小鼠和Toll样受体4(TLR4)基因缺陷型C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬细胞在脂多糖(LPS)刺激下激活状态的差异,从体外途径探讨TLR4传导信号在前葡萄膜炎发病中的可能作用机制。设计实验研究。研究对象健康成年C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠。方法常规提取两种小鼠腹腔巨噬细胞体外培养,按处理因素不同随机分六组:C3H/HeN小鼠LPS组、正常对照组、抗TLR4单克隆抗体加LPS组、抗TLR4单克隆抗体组;C3H/HeJ小鼠LPS组、正常对照组。各组在不同处理后1h、3h、6h、12h、24h五个时间点通过免疫荧光组织化学染色进行观察。主要指标TLR4传导途径中关键分子TLR4、髓样分化因子88(MyD88)、核因子-κB(NF-κB)免疫荧光强度及表达位置差异。结果所有组TLR4均表达于细胞膜,MyD88表达于细胞质和细胞核。C3H/HeN小鼠LPS组和C3H/HeJ小鼠LPS组TLR4荧光强度比较,差异有统计学意义;余各组TLR4荧光强度两两比较,差异无统计学意义。C3H/HeN小鼠腹腔巨噬细胞LPS组随LPS刺激时间的延长,各观察时间点MyD88荧光强度逐渐减弱,总体差异有统计学意义;余各组各时间点MyD88荧光强度无明显变化。C3H/HeN小鼠正常对照组、抗TLR4单克隆抗体组,C3H/HeJ小鼠正常对照组腹腔巨噬细胞各时间点NF-κB均表达于胞质,C3H/HeN小鼠腹腔巨噬细胞LPS刺激1h后NF-κB表达于胞核,3h依旧表达于胞核,此后无法检测到NF-κB的表达。C3H/HeN小鼠抗TLR4单克隆抗体加LPS组、C3H/HeJ小鼠LPS组巨噬细胞经LPS刺激1h后NF-κB转移至胞膜,直至24h一直表达于胞膜。结论腹腔巨噬细胞TLR4传导途径中核因子的转位可能与前葡萄膜炎的发病有关,特异性阻断该途径或许为前葡萄膜炎的治疗提供新思路。     

LPS-TOLL样受体-4在急性前葡萄膜炎发病机制中的研究进展

了TLR-4的在眼部的转导路径及其在急性前葡萄膜炎中研究进展.     

细胞因子与急性前葡萄膜炎

急性前葡萄膜炎发病机制尚不明确,近年来有学者认为细胞因子在急性前葡萄膜炎的发病机制中发挥重要作用.研究细胞因子及其网络的特点为明确急性前葡萄膜炎发病机制、寻求新的治疗方法提供了重要基础.本文就目前肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、白细胞介素-6、白细胞介素-10、γ-干扰素在急性前葡萄膜炎发病过程中的作用进行综述.     

内毒素诱导的葡萄膜炎大鼠眼内DR5的表达研究

目的 观察内毒素诱导的葡萄膜炎动物模型眼内DR5的表达,研究炎症细胞的凋亡与TRAIL/DR5表达的关系.方法 选取SD大鼠随机分为3组:空白对照组、生理盐水注射组、内毒素注射组.其中内毒素注射组是将内毒素注射到大鼠后足底制成葡萄膜炎动物模型.空白对照组无任何操作,生理盐水注射组以及内毒素注射组又根据注射后不同时间分为6h、12 h、24 h、48 h4个亚组.在注射后不同时间摘除眼球,通过透射电镜观察虹膜毛细血管炎症细胞和内皮细胞的超微结构变化;运用免疫组织化学法检测内毒素诱导后不同时间DR5蛋白在炎症细胞上的表达.结果 透射电镜显示:空白对照组以及生理盐水注射组虹膜组织中毛细血管内皮细胞可见微绒毛、较多的吞饮小泡,未见有明显的结构、形态异常.内毒素注射6h组的毛细血管内皮细胞的吞饮小泡数目开始减少,浸润的中性粒细胞和淋巴细胞出现了染色质边集的表现;24 h组吞饮小泡数目减少明显,大量的中性粒细胞和淋巴细胞出现了染色质浓缩、线粒体空泡样变的凋亡表现.免疫组织化学结果显示:DR5蛋白在空白对照组以及生理盐水注射组大鼠的虹膜色素上皮层呈阴性着色;内毒素注射组中,DR5蛋白在虹膜组织的炎症细胞上呈阳性着色,从6h组炎症细胞就出现,24 h组DR5在炎症细胞中的着色数量及着色强度达到最高,光密度值达到0.085 9±0.019 6,与6h组、12 h组、48 h组比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 TRAIL及其受体DR5可能参与了内毒素诱导的葡萄膜炎中炎症细胞的凋亡.     

MMP-9及TIMP-1在内毒素诱导性葡萄膜炎大鼠中的表达

目的 探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及其组织型抑制剂(tissue inhitor of metallopoteinase-1，TIMP—1)在内毒素诱导性葡萄膜炎(endotoxin induced uveitis,EIU)模型中的表达及意义。方法 200μg伤寒杆菌内毒素注射于SD大鼠双后足垫。建立EIU模型。在内毒素注射后的不同时间点处死大鼠。采用免疫组织化学方法和计算机图像分析系统检测MMP-9和TIMP-1在不同时间点的表达及其积分吸光度(A)值。结果内毒素注射6h开始出现炎症，以后炎症加重。于24h达到炎症高峰，以后炎症减轻。7d时基本消退。虹膜上皮细胞，睫状体上皮细胞和渗出的炎症细胞表达MMP-9和TIMP-1。MMP-9在6h出现表达，18～24h达高峰，以后逐渐下降，7d消失。TIMP—1于24h出现表达，72h达高峰，以后逐渐下降。结论 大鼠EIU模型炎症早期MMP-9活性增高，继而TIMP-1分泌增多，MMP-9活性受抑，炎症减轻。提示MMP-9可能是参与EIU的重要调控因子，而TIMP-1则在炎症的抑制过程中发挥了重要作用。     

脂多糖受体复合体在急性前葡萄膜炎虹膜色素上皮细胞中作用的研究进展

近年来,有研究结果表明人葡萄膜中的虹膜色素上皮细胞具有对脂多糖(LPS)反应的固有模式识别受体,包括Toll样受体(TLR)4、髓样分化蛋白(MD)2及分化簇(CD)14。这一发现扩展了微生物触发因子和葡萄膜固有免疫在急性前葡萄膜炎发病机制中的解释。提示LPS受体复合物成分可能成为该病的治疗靶点。本文中笔者对LPS受体复合体在人虹膜色素上皮细胞和葡萄膜炎动物模型中的研究现状进行综述。     

Toll样受体-4及其介导的信号转导与急性前葡萄膜炎

急性前葡萄膜炎是最常见的葡萄膜炎,其发病机制尚不明确。近年来研究认为,G阴性细菌感染启动、Toll样受体-4介导的信号转导在急性前葡萄膜炎的发病机制中发挥重要作用。本文对目前脂多糖-Toll样受体-4信号转导通路及通过对该通路干预来调控炎症的相关研究进展进行综述,以期为前葡萄膜炎的治疗提供新的思路。     

内毒素诱导的葡萄膜炎动物模型研究进展

葡萄膜炎是一种常见的眼部炎症,易反复发作且牵涉到眼内多种组织,其具体发病机制目前尚不清楚,因此有必要建立合适的动物模型以进行研究。已有研究表明,内毒素注射可以诱导动物的实验性葡萄膜炎。内毒素诱导的葡萄膜炎（EIU）动物模型已成为人们研究葡萄膜炎重要的动物模型,它对人们了解葡萄膜炎的发病机制及治疗葡萄膜炎做出了重要贡献。就该模型的发现、建立方法、炎症过程以及模型中涉及到的内毒素信号通路相关转录因子、细胞因子和一氧化氮（NO）等进行综述。     

急性闭角型青光眼发病机制与Toll样受体及髓样分化因子88免疫调节作用的相关性分析

目的探讨急性原发性闭角型青光眼(PACG)发病机制与Toll样受体(TLR)及髓样分化因子88(My D88)免疫调节作用的相关性,为临床治疗提供依据。方法选取2015年1月至2015年12月收入我院的90例急性PACG患者为研究组,根据视野损伤程度将患者分为重、中、轻三个亚组,选取同期入院的32例白内障患者为对照组,统计两组患者的基线资料,并检测两组患者的TLR4、My D88蛋白及炎性因子(IL-2、IL-6)的表达水平。结果两组患者TLR4和My D88的蛋白表达水平比较,具有统计学差异(P<0.05),且视神经损伤重度组的TLR4和My D88的蛋白表达水平显著高于视神经损伤中度组及视神经损伤轻度组,具有统计学差异(P<0.05)。两组患者外周血IL-2及IL-6水平比较,具有统计学差异(P<0.05),视神经损伤重度组的IL-2水平与视神经损伤中度组相比较,无统计学差异(P>0.05),但其显著低于视神经损伤轻度组,具有统计学差异(P<0.05);视神经损伤重度组的IL-6水平与视神经损伤中度组及视神经损伤轻度组相比较,均无统计学差异(P>0.05)。结论急性PACG的发病可能与TLR4和My D88的免疫调节有关,急性PACG发作期虹膜组织发生炎症,且TLR4和My D88的表达水平升高,这一过程依照TLR4-My D88的信号传导。     

内毒素诱导葡萄膜炎中炎症细胞凋亡与TRAIL表达的研究

目的:在内毒素诱导的葡萄膜炎(endotoxin induced uveitis,EIU)模型中,观察葡萄膜炎病变中炎症细胞凋亡的发生,研究大鼠虹膜组织中炎症细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的表达与炎症细胞凋亡的关系,探讨TRAIL凋亡途径可能参与炎症细胞的凋亡。方法:以1mg/kg内毒素注射于大鼠后足垫建立EIU模型,分别于注射后不同时间点观察大鼠眼内的炎症反应。吸取房水观察细胞数。摘取眼球,行HE(hematoxylin eosin)染色观察大鼠虹膜组织的病理改变;TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labeling)法检测炎症细胞凋亡情况;同时运用SABC法检测在内毒素诱导后的不同时间TRAIL在炎症细胞上的表达,并行图像分析。结果:内毒素注射6h开始出现炎症,以后炎症加重,于18～24h达到炎症高峰,48h炎症明显消退。房水中的细胞数也在24h组达到最多。HE染色显示:内毒素注射后6h,即出现炎症细胞,细胞数目在24h组最多,多数为多形核中性粒细胞,少数为单核细胞和淋巴细胞,48h组炎症细胞几乎消失。TUNEL染色显示:在内毒素注射后6h组即有炎症细胞出现阳性着色,24h组凋亡数达到最多。免疫组化显示:TRAIL蛋白在大鼠的虹膜色素上皮层呈弱阳性着色;TRAIL在炎症细胞上呈阳性着色,24h组在炎症细胞中的着色数量及着色强度达到最高。结论:以1mg/kg的内毒素注射于SD大鼠后足垫可诱导出葡萄膜炎反应,炎症反应在24h组最为强烈。炎症细胞凋亡可能是EIU炎症迅速消退的原因之一。TRAIL可能参与了炎症细胞的凋亡。     

内毒素耐受对内毒素诱导的葡萄膜炎炎症程度及虹膜睫状体中PI3K/AKT 信号通路的影响

目的探讨低剂量脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)预处理对内毒素诱导葡萄膜炎(endotoxin induced uveitis,EIU)动物模型炎症程度的影响,并分析虹膜睫状体组织中PI3K/AKT表达水平的改变。设计实验研究。研究对象8-10周龄健康雄性Wistar大鼠90只。方法随机分为正常对照(normal control,NC)组、内毒素耐受(endotoxin tolerance,ET)组和内毒素诱导的葡萄膜炎(EIU)组,每组30只。通过皮下注射1 mg/kg LPS建立内毒素诱导的葡萄膜炎动物模型。ET组:EIU模型诱导之前连续5日腹腔注射0.1 mg/kg LPS诱导内毒素耐受。EIU组及NC组连续5日注射等体积生理盐水。第6天相同时间ET组及EIU组接受200μg LPS皮下注射,NC组接受等体积生理盐水注射。注射后24小时,在裂隙灯显微镜下进行临床评分。眼球摘除行HE染色组织病理学观察。ELISA测量房水TNF-α浓度,蛋白印迹法检测虹膜睫状体PI3K和AKT蛋白的表达。主要指标眼前节炎症反应评分,虹膜切片HE染色观察,房水TNF-α浓度及虹膜睫状体PI3K/AKT蛋白表达。结果临床评分ET组、EIU组、NC组分别为(1.65±0.49)、(6.65±0.59)、(0.20±0.41)分(χ~2=53.261,P=0.001);组织病理评分ET组、EIU组、NC组分别为(0.6±0.5)、(3.8±0.4)、(0.2±0.4)分(χ~2=46.137,P=0.001)。房水TNF-α浓度ET组、EIU组、NC组分别为(10.58±0.67)、(30.96±1.55)、(10.32±0.61)pg/ml(F=260.08,P=0.03)。蛋白印迹法显示虹膜睫状体组织中PI3K和AKT的蛋白水平ET组、EIU组、NC组分别为(0.197±0.019)、(0.539±0.017)、(0.453±0.014)(F=210.66,P=0.002)和(0.234±0.019)、(0.553±0.013)、(0.428±0.002)(F=275.35,P=0.001)。结论内毒素耐受可以降低大鼠内毒素诱导的葡萄膜炎的炎症反应程度,下调虹膜睫状体组织中PI3K和AKT的表达,揭示内毒素耐受对EIU的保护机制可能与PI3K/AKT信号通路有关。     

大黄多糖对内毒素诱导急性前葡萄膜炎TLR4/NF-κB传导通路干预作用的实验研究

目的 通过观察大黄多糖对内毒素（LPS）诱导的急性前葡萄膜炎TLR4通路的影响,揭示大黄多糖对急性前葡萄膜炎TLR4通路的分子干预机制,为TLR4 通路介导的炎症治疗提供新的思路和途径。设计 实验研究。研究对象 野生型Wistar大鼠、RAW264.7巨噬细胞系。方法 野生型Wistar大鼠15只,随机分为3组,正常对照组、模型组（LPS组）、大黄多糖处理组,每组5只,大黄多糖处理组腹腔注射400 mg/kg大黄多糖,对照组和模型组注射等量PBS。各组腹腔注射2小时后模型组和大黄多糖处理组每只大鼠足底注射0.1 ml霍乱弧菌内毒素LPS,对照组注射等体积的PBS,24小时后裂隙灯下观察大鼠眼前节炎症反应并按炎症分级评分,RT-PCR观察大鼠虹膜TLR4表达的变化。RAW264.7巨噬细胞系进行体外培养,用大黄多糖、LPS分别刺激,通过Western blot、RT-PCR、ELISA、免疫荧光技术观察两者对巨噬细胞TLR4及相关分子的影响。主要指标 大鼠眼前节炎症反应程度、巨噬细胞TLR4表达变化。结果 裂隙灯下观察,LPS组相比于正常对照组虹膜充血严重,前房闪辉及瞳孔区纤维素渗出均较多;大黄多糖干预组大鼠仅轻度虹膜充血,瞳孔缘无明显渗出膜,瞳孔无缩小。RT-PCR示大黄多糖干预组TLR4 mRNA 表达较LPS组明显降低。Western blot和RT-PCR结果显示大黄多糖在体外分别能引起巨噬细胞TLR4、髓样分化蛋白-88（MyD88）、核因子-κB（NF-κB） p65蛋白和mRNA表达量的增加;ELISA显示大黄多糖100 ?滋g/ml作用于Raw264.7细胞24小时后能引起上清液炎症因子IL-17,IL-10,TNF-α,INF-γ,IL-1β的表达增高;免疫荧光显示大黄多糖能引起培养细胞的激活、TLR4复合物及NF-κB p65表达。结论 大黄多糖对内毒素诱导的大鼠急性前葡萄膜炎模型具有明显的抑制作用。体外实验显示大黄多糖同LPS一样,在体外具有激活巨噬细胞TLR4及其下游MyD88和NF-κB、调节细胞因子表达的作用。（眼科, 2013, 22: 134-140）     

Interferon gamma immunoreactivity in iris nerve fibres during endotoxin induced uveitis in the rat

AIMS—Previous studies have implied that interferon gamma (IFN-γ) is involved in the pathogenesis of endotoxin induced uveitis (EIU) in the rat. This study investigated the source of IFN-γ in the iris during EIU.METHODS—Whole mounts of iris were isolated from Lewis rats before and at different times (from 4 hours to 14 days) after foot pad injection of 200 µg Salmonella typhimurium lipopolysaccharide (LPS). Immunohistological analysis was performed using monoclonal antibodies (mAbs) specific to rat IFN-γ (DB12 and DB13). mAbs specific to monocytes, macrophages, and dendritic cells and MHC class II were used to asses the inflammatory response in the eye (ED-1, ED-2, and OX-6). An antibody specific to neurofilaments (2H3) was used to stain nerve fibres in the normal iris.RESULTS—LPS administration induced acute intraocular inflammation, characterised by a massive infiltration of monocytes/macrophages and increased numbers of MHC class II positive cells in the iris. IFN-γ immunoreactive cells were not detected in iris whole mounts of control rats. Strikingly, IFN-γ immunoreactivity was found in fibres from 4 hours until 10 days after LPS injection, with the most intense staining at 48-72 hours. Other DB12 or DB13 positive cells were not detected in the iris. The pattern of DB12 and DB13 staining in the inflamed iris was similar to the 2H3 staining of neurons in the iris of control rats.CONCLUSION—These results show that systemic LPS administration induces IFN-γ immunoreactivity in iris fibres and suggest that iris nerve fibres may be a source of IFN-γ during EIU. The IFN-γ immunoreactive material in the iris nerve fibres may be identical to neuronal IFN-γ.